阪崎克罗诺杆菌核酸快速恒温检测方法及试剂盒
阅读说明：本技术 阪崎克罗诺杆菌核酸快速恒温检测方法及试剂盒 (Rapid constant-temperature detection method and kit for nucleic acid of cronobacter sakazakii ) 是由 李雪玲 刘伟 李园园 韦朝春 陆长德 李亦学 贾犇 曹永梅 于 2016-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物组及试剂盒。所述方法为：从待测样品中提取基因组DNA；以所述基因组DNA为模板,以能扩增阪崎克罗诺杆菌特异性序列的引物组为引物,在酶反应体系下进行恒温扩增反应；通过判断反应结果是否为阳性,确定待测样品中是否存在阪崎克罗诺杆菌。本发明检测方法具有高灵敏度和高特异性,检测时间短,结果判定简单,操作便捷,成本低,具广泛应用前景。(The invention discloses a method, a primer group and a kit for rapidly detecting cronobacter sakazakii at constant temperature. The method comprises the following steps: extracting genome DNA from a sample to be detected; performing constant-temperature amplification reaction in an enzyme reaction system by using the genome DNA as a template and a primer group capable of amplifying a specific sequence of Cronobacter sakazakii as a primer; and determining whether the sample to be detected has cronobacter sakazakii or not by judging whether the reaction result is positive or not. The detection method has the advantages of high sensitivity and high specificity, short detection time, simple result judgment, convenient operation, low cost and wide application prospect.)
本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610767354.8、发明名称为：“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国发明专利申请的分案申请；该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、发明名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国发明专利申请的优先权。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒。
背景技术
阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种革兰氏阴性、周生鞭毛、能运动、无芽孢的兼性厌氧细菌，1980年前称为非典型的产黄色素的阴沟肠杆菌，1980年后曾更名为阪崎肠杆菌，2008年重新分类命名，被划归于肠杆菌科克罗诺杆菌属。阪崎克罗诺杆菌广泛存在于自然界，是通过配方粉危害婴幼儿健康的重要条件性致病菌，能引起婴儿严重的临床症状，如脑脓疡，脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和全身性败血症等，致死率高达40％-80％。新生婴儿或早产儿都存在通过食用污染有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方粉而感染阪崎克罗诺杆菌菌株的风险。与其他食源性致病微生物相比，虽然阪崎克罗诺杆菌感染率不高，但对于特殊人群却有着较高的致死率，并且该菌的宿主及传播模型尚并不是十分清楚。因此对于该菌的预防和检测尤为重要。
目前，国内外针对阪崎克罗诺杆菌的检测方法仍以常规培养方法作为标准，但检测周期较长(达5-7天)，操作相对复杂，检测效率较低，难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。随后研究人员陆续开发出了PCR和荧光PCR技术的检测手段，也被纳入到我国的“奶粉中克罗诺杆菌的检测方法”的行业标准，但是这两种方法需要专门的检测仪器，因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000 Jun 15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。
引物设计是LAMP技术中最为关键的一步，常规做法是将某待检测生物的公认的特异性基因导入LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e)，设定相关参数生成引物组。也就是说，用户首先必须确保该靶基因为待测物种的特异序列。以发明专利ZL201010614700.1和CN 101319249 B为例，它们分别针对文献报道的阪崎克罗诺杆菌的特异基因——OmpA基因和18S rDNA序列，采用LAMP技术进行阪崎克罗诺杆菌检测。然而，所谓“公认的特异性基因”往往基于滞后的知识，并未基于不断增长的微生物基因组数据进行必要的更新，导致基于该靶基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其特异性。本发明用表1展示了现有技术中存在的引物特异性不够、通用性也不能确保的问题。也就是说，现有技术方法中所使用的阪崎克罗诺杆菌特异序列实际上并非阪崎克罗诺杆菌所特有，即，有可能将非阪崎克罗诺杆菌错误地认定为阪崎克罗诺杆菌。类似的问题也存在于通用性的确认。因此，行业内亟需一种能够确保特异性和通用性的阪崎克罗诺杆菌检测方法，同时满足基层检测部门对快速、便捷的需求，能够方便地在企业生产线内部开展实时实地检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别阪崎克罗诺杆菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本发明基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源(截至2013年8月5日数据)进行阪崎克罗诺杆菌LAMP引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物组及试剂盒。采用本发明的检测方法检测阪崎克罗诺杆菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。
本发明提出一种快速检测阪崎克罗诺杆菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物，在酶反应体系下，进行恒温扩增反应；
(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在阪崎克罗诺杆菌。
本发明恒温检测阪崎克罗诺杆菌菌株的方法，从待测样品中提取基因组DNA，以其为模板，以阪崎克罗诺杆菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应，然后，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在阪崎克罗诺杆菌。其中，所述酶反应体系包括但不限于DNA聚合酶反应体系。
本发明中，所述阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列为GI号为156932229的阪崎克罗诺杆菌的1077500～1080076bp位序列。
本发明中，所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组为所述基因组(GI号为156932229)的1077500～1080076bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。其中，所述阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列是指仅为阪崎克罗诺杆菌基因组所特有的，而其它微生物基因组所不包含的碱基序列。
其中，所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异碱基序列的引物组包括但不限于选自以下各引物组A～L之任意一组，或选自与该引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为45％及以上的引物组之任意一组。
引物组A：
上游外引物F3_A：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’(SEQ ID NO：1)；
下游外引物B3_A：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’(SEQ ID NO：2)；
上游内引物FIP_A：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’(SEQ IDNO：3)；
下游内引物BIP_A：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’(SEQ IDNO：4)；
引物组B：
上游外引物F3_B：5’-GTTCGATCTCCAGCTTACGAAG-3’(SEQ ID NO：5)；
下游外引物B3_B：5’-GACATGAGTATCCACCAGGC-3’(SEQ ID NO：6)；
上游内引物FIP_B：5’-GCGAGAGGTAACGAACGCAGTGGCGAGATTTCATATTGCCGC-3’(SEQID NO：7)；
下游内引物BIP_B：5’-AGTTGCTGGTGAGCTTCGGCAGAAGTACAGGCCAGGGTAA-3’(SEQ IDNO：8)；
引物组C：
上游外引物F3_C：5’-GGATACATCCCATTGGCT-3’(SEQ ID NO：9)；
下游外引物B3_C：5’-CGTCTGGAGTTATTGCAATT-3’(SEQ ID NO：10)；
上游内引物FIP_C：5’-AAGCAAGCAGAATACTCCCAGCTGCCAGGTCAATATTTGC-3’(SEQ IDNO：11)；
下游内引物BIP_C：5’-CATCAACTTTTGTATCATGTGCCTGTCTCGATTTAAACACGCC-3’(SEQID NO：12)；
引物组D：
上游外引物F3_D：5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’(SEQ ID NO：13)；
下游外引物B3_D：5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’(SEQ ID NO：14)；
上游内引物FIP_D：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’(SEQ IDNO：15)；
下游内引物BIP_D：
5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’(SEQ ID NO：16)；
引物组E：
上游外引物F3_E：5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’(SEQ ID NO：17)；
下游外引物B3_E：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’(SEQ ID NO：18)；
上游内引物FIP_E：5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’(SEQ IDNO：19)；
下游内引物BIP_E：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’(SEQ IDNO：20)；
引物组F：
上游外引物F3_F：5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’(SEQ ID NO：21)；
下游外引物B3_F：5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’(SEQ ID NO：22)；
上游内引物FIP_F：5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’(SEQID NO：23)；
下游内引物BIP_F：5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’(SEQ ID NO：24)；
引物组G：
上游外引物F3_G：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’(SEQ ID NO：25)；
下游外引物B3_G：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’(SEQ ID NO：26)；
上游内引物FIP_G：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’(SEQID NO：27)；
下游内引物BIP_G：
5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’(SEQ ID NO：28)；
引物组H：
上游外引物F3_H：5’-AAGGCTTACTCTTGAACCA-3’(SEQ ID NO：29)；
下游外引物B3_H：5’-TGGGACTCCGAAACAATC-3’(SEQ ID NO：30)；
上游内引物FIP_H：
5’-CACATATAACCAGGATGACCGTTATTAAGGTGTCAGGATAGTGG-3’(SEQ ID NO：31)；
下游内引物BIP_H：5’-GCTAAGCGTCAATTTCGGGTGCGCTTATTTGAACCGTAT-3’(SEQ IDNO：32)；
引物组I：
上游外引物F3_I：5’-GGCAGAAACAGCCTGTTCA-3’(SEQ ID NO：33)；
下游外引物B3_I：5’-TGGCTGGGGAACTTTCTCAT-3’(SEQ ID NO：34)；
上游内引物FIP_I：5’-CCTGTCCAGGCATTACGTGATGAGCATCTACACTGACAGGCAC-3’(SEQID NO：35)；
下游内引物BIP_I：5’-TAAACGCGCCGCAGAGACTGTTATGCTGGGTGTTGGCG-3’(SEQ IDNO：36)；
引物组J：
上游外引物F3_J：5’-ATAAGGCCCATAAGTGCG-3’(SEQ ID NO：37)；
下游外引物B3_J：5’-AGGTATGGAAAAACAGTCAC-3’(SEQ ID NO：38)；
上游内引物FIP_J：5’-TTGGCGTCCGTATAGCGTTACCAGTAAGAACGGTGGAT-3’(SEQ IDNO：39)；
下游内引物BIP_J：5’-CATCACCATAACATTCATAACACCGTTTCTGGTCTTGGAGGAAT-3’(SEQ ID NO：40)；
引物组K：
上游外引物F3_K：5’-GTCCCACTTTGAGATGCA-3’(SEQ ID NO：41)；
下游外引物B3_K：5’-GACTATTCAACTGCCTGTT-3’(SEQ ID NO：42)；
上游内引物FIP_K：5’-GCCCCTTTAGTCTCAGCAAATTTATCAGTGCTCCCTATCG-3’(SEQ IDNO：43)；
下游内引物BIP_K：5’-CTGCAATTGTTTCAGGAATCAGTGGAAACGAGACAATTTCGGT-3’(SEQID NO：44)；
引物组L：
上游外引物F3_L：5’-TCATTGCCTGTAATTGCG-3’(SEQ ID NO：45)；
下游外引物B3_L：5’-TGAAAGATCTCATGCCAAC-3’(SEQ ID NO：46)；
上游内引物FIP_L：5’-GTGCATTTCTGGCTCTCATTGTTTAGTAACGCAACGACG-3’(SEQ IDNO：47)；
下游内引物BIP_L：
5’-CTCGTAAAATGTGTAAGCAAGATGGGGCTAAACGCAATACATTCA-3’(SEQ ID NO：48)。
本发明中，所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异碱基序列的引物组还可以包括与前述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为45％及以上的引物组，该引物组包括但不限于以下引物组M～R之任一引物组：
引物组M：
上游外引物F3_M：5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’(SEQ ID NO：49)；
下游外引物B3_M：5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’(SEQ ID NO：50)(与引物F3_C互补链5’-AGCCAATGGGATGTATCC-3’同源性50％)；
上游内引物FIP_M：5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’(SEQID NO：51)；
下游内引物BIP_M：5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’(SEQID NO：52)；
引物组N：
上游外引物F3_N：5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’(SEQ ID NO：53)(与引物F3_D5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’同源性50％)；
下游外引物B3_N：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’(SEQ ID NO：54)；
上游内引物FIP_N：5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’(SEQ IDNO：55)；
下游内引物BIP_N：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’(SEQ IDNO：56)；
引物组O：
上游外引物F3_O：5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’(SEQ ID NO：57)(与引物F3_E5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’同源性50％)；
下游外引物B3_O：5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’(SEQ ID NO：58)；
上游内引物FIP_O：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’(SEQID NO：59)；
下游内引物BIP_O：5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’(SEQ ID NO：60)；
引物组P：
上游外引物F3_P：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’(SEQ ID NO：61)(与引物B3_F的互补链5’-TTAAGCCGGTTAATTTGCTC-3’同源性45％)；
下游外引物B3_P：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’(SEQ ID NO：62)；
上游内引物FIP_P：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’(SEQID NO：63)；
下游内引物BIP_P：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’(SEQ ID NO：64)；
引物组Q：
上游外引物F3_Q：5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’(SEQ ID NO：65)；
下游外引物B3_Q：5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’(SEQ ID NO：66)(与引物F3_G的互补链5’-CACAACTGAGTGAGCAAATT-3’同源性50％)；
上游内引物FIP_Q：5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’(SEQ IDNO：67)；
下游内引物BIP_Q：5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’(SEQ IDNO：68)；
引物组R：
上游外引物F3_R：5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’(SEQ ID NO：69)；
下游外引物B3_R：5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’(SEQ ID NO：70)(与引物F3_H的互补链5’-TGGTTCAAGAGTAAGCCTT-3’同源性47％)；
上游内引物FIP_R：5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’(SEQID NO：71)；
下游内引物BIP_R：5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’(SEQ IDNO：72)。
本发明方法中，所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组可以包含或不包含环引物。所述环引物可以是一条或多条，包括引物LF和/或LB。所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下引物组A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’之任意一组；或选自与所述引物组A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’序列或其互补链序列中单条序列同源性为45％及以上的引物组之任意一组：
引物组A’：
上游外引物F3_A：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’；
下游外引物B3_A：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’；
上游内引物FIP_A：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’；
下游内引物BIP_A：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’；
下游环引物LB_A：5’-ATGTCTTTCCCTGCATTTTCCA-3’(SEQ ID NO：73)；
引物组D’：
上游外引物F3_D：5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’；
下游外引物B3_D：5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’；
上游内引物FIP_D：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’；
下游内引物BIP_D：
5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；
上游环引物LF_D：5’-GAGTTATTGCAATTACTCTCTCTCG-3’(SEQ ID NO：74)；
和/或，下游环引物LB_D：5’-CTCAGCTTCTGCCTGTACAA-3’(SEQ ID NO：75)；
引物组E’：
上游外引物F3_E：5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’；
下游外引物B3_E：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；
上游内引物FIP_E：5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’；
下游内引物BIP_E：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；
下游环引物LB_E：5’-TCTCAAATTCAGCCATTCTTCCTG-3’(SEQ ID NO：76)；
引物组F’：
上游外引物F3_F：5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’；
下游外引物B3_F：5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’；
上游内引物FIP_F：5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’；
下游内引物BIP_F：5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’；
上游环引物LF_F：5’-AGTTGATGTTAACCGGGCAAT-3’(SEQ ID NO：77)；
引物组G’：
上游外引物F3_G：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；
下游外引物B3_G：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；
上游内引物FIP_G：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；
下游内引物BIP_G：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；
上游环引物LF_G：5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’(SEQ ID NO：78)；
引物组M’：
上游外引物F3_M：5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’；
下游外引物B3_M：5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’；
上游内引物FIP_M：GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’；
下游内引物BIP_M：5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’；
下游环引物LB_M：5’-TACGTAGTTCTCCCATGTCCTGGA-3’(SEQ ID NO：79)；
引物组N’：
上游外引物F3_N：5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’；
下游外引物B3_N：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；
上游内引物FIP_N：5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’；
下游内引物BIP_N：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；
上游环引物LF_N：5’-CGCAAAGCGTCTGGAGTTATTGC-3’(SEQ ID NO：80)；
和/或，下游环引物LB_N：5’-TTCAGCCATTCTTCCTGCAGCA-3’(SEQ ID NO：81)；
引物组O’：
上游外引物F3_O：5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’；
下游外引物B3_O：5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’；
上游内引物FIP_O：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’；
下游内引物BIP_O：5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；
上游环引物LF_O：5’-CTGGAGTTATTGCAATTACTCTCTC-3’(SEQ ID NO：82)；
引物组P’：
上游外引物F3_P：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；
下游外引物B3_P：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；
上游内引物FIP_P：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；
下游内引物BIP_P：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；
上游环引物LF_P：5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’(SEQ ID NO：83)；
引物组Q’：
上游外引物F3_Q：5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’；
下游外引物B3_Q：5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’；
上游内引物FIP_Q：5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’；
下游内引物BIP_Q：5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’；
上游环引物LF_Q：5’-GCAGGAAGAATGGCTGAATTTG-3’(SEQ ID NO：84)；
和/或，下游环引物LB_Q：5’-CTCTTGTGCCTGCAATAATGC-3’(SEQ ID NO：85)；
引物组R’：
上游外引物F3_R：5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’；
下游外引物B3_R：5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’；
上游内引物FIP_R：5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’；
下游内引物BIP_R：5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’；
下游环引物LB_R：5’-CAGTAAAGGTTGAATGACAGTGATG-3’(SEQ ID NO.86)。
在具体实施方案中，例如，上述引物组D’，N’或Q’中，可以只包含一条上游环引物，或只包含一条下游环引物，或同时包含一条上游环引物和一条下游环引物。
本发明方法中，在一具体实施方案(含环引物)中，所述恒温扩增的酶反应体系为：1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/L Mg2+(MgSO4或MgCl2)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜碱。在另一具体实施方案(不含环引物)中，所述恒温扩增的酶反应体系为：1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/L Mg2+(MgSO4或MgCl2)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜碱。环引物有助于提高反应效率。例如，1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO4。1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO4和酶反应体系中的镁离子Mg2+做合并处理。
本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90min，优选地为20～90min，优选地为10～60min；②80℃终止反应2～20min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。
本发明方法中，检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测等。所述电泳检测，优选为凝胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶，也可以是聚丙烯酰胺凝胶。电泳检测结果中，如电泳图呈现特征性阶梯状条带，则待测样品呈阪崎克罗诺杆菌阳性，含有阪崎克罗诺杆菌；如电泳图不呈现特征性阶梯状条带，则待测样品呈阪崎克罗诺杆菌阴性。所述浊度检测，是用肉眼观察或浊度仪检测浊度，检测管出现混浊，则待测样品呈阪崎克罗诺杆菌阳性，含有阪崎克罗诺杆菌；如未见混浊，则待测样品为阪崎克罗诺杆菌阴性。也可以经离心后肉眼观察反应管底是否有沉淀，若反应管底有沉淀，则待测样品呈阪崎克罗诺杆菌阳性，含有阪崎克罗诺杆菌；如反应管底没有沉淀，则待测样品呈阪崎克罗诺杆菌阴性。
所述显色检测，是在反应管中加入显色剂，包括但不限于钙黄绿素(50μM)或SYBRGreen I(30-50×)，或羟基萘酚蓝(即HNB，120-150μM)。当采用钙黄绿素或SYBR Green I作为显色剂时，如反应后颜色为橙色，则待测样品为阪崎克罗诺杆菌阴性；如反应后颜色为绿色，则待测样品为阪崎克罗诺杆菌阳性，含有阪崎克罗诺杆菌。当采用羟基萘酚蓝作为显色剂时，如反应后颜色为紫罗兰色，则待测样品为阪崎克罗诺杆菌阴性；如反应后颜色为天蓝色，则待测样品为阪崎克罗诺杆菌阳性。所述显色检测，除了上述通过肉眼观察反应结果外，也可以通过检测仪器进行实时或终点检测反应结果，通过合理的设定阴性反应的阈值，当待测样品反应的结果低于或等于该阈值时，则待测样品为阪崎克罗诺杆菌阴性；当待测样品反应的结果大于该阈值时，则待测样品为阪崎克罗诺杆菌阳性。所述检测仪器包括但不限于荧光分光光度计、荧光定量PCR仪、恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和GenieII等温扩增荧光检测系统等。
所述显色检测中，若采用钙黄绿素或羟基萘酚蓝作为显色剂，可以在恒温扩增反应之前加入，也可以在恒温扩增反应完成之后加入，优选地为恒温扩增反应之前加入，可以有效的减少反应污染的可能性。若采用SYBR Green I作为显色剂，则在恒温扩增反应完成之后加入。若采用钙黄绿素作为显色剂，则在酶反应体系中加入50μM钙黄绿素的同时，加入0.6-1mM[Mn2+]，例如，0.6-1mM的MnCl2。
本发明还提供了用于恒温检测阪崎克罗诺杆菌菌株的方法中的引物。所述引物包括能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异碱基序列的引物组，其包括但不限于，所述引物的序列为GI号为156932229的阪崎克罗诺杆菌基因组的1077500～1080076bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。
其中，所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下各引物组之任意一组，或选自与所述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为45％及以上的任一引物组。其中，所述引物组包括但不限于以下引物组A～L之任意一个引物组。所述与前述引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为45％及以上的引物组包括但不限于以下引物组M～R之任意一个引物组。
引物组A：
上游外引物F3_A：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’；
下游外引物B3_A：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’；
上游内引物FIP_A：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’；
下游内引物BIP_A：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’；
引物组B：
上游外引物F3_B：5’-GTTCGATCTCCAGCTTACGAAG-3’；
下游外引物B3_B：5’-GACATGAGTATCCACCAGGC-3’；
上游内引物FIP_B：5’-GCGAGAGGTAACGAACGCAGTGGCGAGATTTCATATTGCCGC-3’；
下游内引物BIP_B：5’-AGTTGCTGGTGAGCTTCGGCAGAAGTACAGGCCAGGGTAA-3’；
引物组C：
上游外引物F3_C：5’-GGATACATCCCATTGGCT-3’；
下游外引物B3_C：5’-CGTCTGGAGTTATTGCAATT-3’；
上游内引物FIP_C：5’-AAGCAAGCAGAATACTCCCAGCTGCCAGGTCAATATTTGC-3’；
下游内引物BIP_C：5’-CATCAACTTTTGTATCATGTGCCTGTCTCGATTTAAACACGCC-3’；
引物组D：
上游外引物F3_D：5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’；
下游外引物B3_D：5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’；
上游内引物FIP_D：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’；
下游内引物BIP_D：5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；
引物组E：
上游外引物F3_E：5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’；
下游外引物B3_E：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；
上游内引物FIP_E：5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’；
下游内引物BIP_E：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；
引物组F：
上游外引物F3_F：5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’；
下游外引物B3_F：5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’；
上游内引物FIP_F：5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’；
下游内引物BIP_F：5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’；
引物组G：
上游外引物F3_G：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；
下游外引物B3_G：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；
上游内引物FIP_G：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；
下游内引物BIP_G：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；
引物组H：
上游外引物F3_H：5’-AAGGCTTACTCTTGAACCA-3’；
下游外引物B3_H：5’-TGGGACTCCGAAACAATC-3’；
上游内引物FIP_H：5’-CACATATAACCAGGATGACCGTTATTAAGGTGTCAGGATAGTGG-3’；
下游内引物BIP_H：5’-GCTAAGCGTCAATTTCGGGTGCGCTTATTTGAACCGTAT-3’；
引物组I：
上游外引物F3_I：5’-GGCAGAAACAGCCTGTTCA-3’；
下游外引物B3_I：5’-TGGCTGGGGAACTTTCTCAT-3’；
上游内引物FIP_I：5’-CCTGTCCAGGCATTACGTGATGAGCATCTACACTGACAGGCAC-3’；
下游内引物BIP_I：5’-TAAACGCGCCGCAGAGACTGTTATGCTGGGTGTTGGCG-3’；
引物组J：
上游外引物F3_J：5’-ATAAGGCCCATAAGTGCG-3’；
下游外引物B3_J：5’-AGGTATGGAAAAACAGTCAC-3’；
上游内引物FIP_J：5’-TTGGCGTCCGTATAGCGTTACCAGTAAGAACGGTGGAT-3’；
下游内引物BIP_J：5’-CATCACCATAACATTCATAACACCGTTTCTGGTCTTGGAGGAAT-3’；
引物组K：
上游外引物F3_K：5’-GTCCCACTTTGAGATGCA-3’；
下游外引物B3_K：5’-GACTATTCAACTGCCTGTT-3’；
上游内引物FIP_K：5’-GCCCCTTTAGTCTCAGCAAATTTATCAGTGCTCCCTATCG-3’；
下游内引物BIP_K：
5’-CTGCAATTGTTTCAGGAATCAGTGGAAACGAGACAATTTCGGT-3’；
引物组L：
上游外引物F3_L：5’-TCATTGCCTGTAATTGCG-3’；
下游外引物B3_L：5’-TGAAAGATCTCATGCCAAC-3’；
上游内引物FIP_L：5’-GTGCATTTCTGGCTCTCATTGTTTAGTAACGCAACGACG-3’；
下游内引物BIP_L：5’-CTCGTAAAATGTGTAAGCAAGATGGGGCTAAACGCAATACATTCA-3’；
引物组M：
上游外引物F3_M：5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’；
下游外引物B3_M：5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’；
上游内引物FIP_M：5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’；
下游内引物BIP_M：5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’；
引物组N：
上游外引物F3_N：5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’；
下游外引物B3_N：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；
上游内引物FIP_N：5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’；
下游内引物BIP_N：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；
引物组O：
上游外引物F3_O：5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’；
下游外引物B3_O：5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’；
上游内引物FIP_O：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’；
下游内引物BIP_O：5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；
引物组P：
上游外引物F3_P：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；
下游外引物B3_P：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；
上游内引物FIP_P：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；
下游内引物BIP_P：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；
引物组Q：
上游外引物F3_Q：5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’；
下游外引物B3_Q：5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’；
上游内引物FIP_Q：5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’；
下游内引物BIP_Q：5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’；
引物组R：
上游外引物F3_R：5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’；
下游外引物B3_R：5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’；
上游内引物FIP_R：5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’；
下游内引物BIP_R：5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’。
本发明用于所述恒温检测阪崎克罗诺杆菌方法中的引物中，所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组还可以包含或不包含一条或多条环引物；所述环引物为LF和/或LB。所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下引物组A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’之任意一组；或选自与所述引物组A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’序列或其互补链序列中单条序列同源性为45％及以上的引物组之任意一组：
引物组A’：
上游外引物F3_A：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’；
下游外引物B3_A：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’；
上游内引物FIP_A：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’；
下游内引物BIP_A：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’；
下游环引物LB_A：5’-ATGTCTTTCCCTGCATTTTCCA-3’；
引物组D’：
上游外引物F3_D：5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’；
下游外引物B3_D：5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’；
上游内引物FIP_D：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’；
下游内引物BIP_D：5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；
上游环引物LF_D：5’-GAGTTATTGCAATTACTCTCTCTCG-3’；
和/或，下游环引物LB_D：5’-CTCAGCTTCTGCCTGTACAA-3’；
引物组E’：
上游外引物F3_E：5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’；
下游外引物B3_E：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；
上游内引物FIP_E：5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’；
下游内引物BIP_E：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；
下游环引物LB_E：5’-TCTCAAATTCAGCCATTCTTCCTG-3’；
引物组F’：
上游外引物F3_F：5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’；
下游外引物B3_F：5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’；
上游内引物FIP_F：5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’；
下游内引物BIP_F：5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’；
上游环引物LF_F：5’-AGTTGATGTTAACCGGGCAAT-3’；
引物组G’：
上游外引物F3_G：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；
下游外引物B3_G：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；
上游内引物FIP_G：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；
下游内引物BIP_G：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；
上游环引物LF_G：5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’；
引物组M’：
上游外引物F3_M：5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’；
下游外引物B3_M：5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’；
上游内引物FIP_M：5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’；
下游内引物BIP_M：5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’；
下游环引物LB_M：5’-TACGTAGTTCTCCCATGTCCTGGA-3’；
引物组N’：
上游外引物F3_N：5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’；
下游外引物B3_N：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；
上游内引物FIP_N：5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’；
下游内引物BIP_N：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；
上游环引物LF_N：5’-CGCAAAGCGTCTGGAGTTATTGC-3’；
和/或，下游环引物LB_N：5’-TTCAGCCATTCTTCCTGCAGCA-3’；
引物组O’：
上游外引物F3_O：5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’；
下游外引物B3_O：5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’；
上游内引物FIP_O：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’；
下游内引物BIP_O：5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；
上游环引物LF_O：5’-CTGGAGTTATTGCAATTACTCTCTC-3’；
引物组P’：
上游外引物F3_P：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；
下游外引物B3_P：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；
上游内引物FIP_P：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；
下游内引物BIP_P：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；
上游环引物LF_P：5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’；
引物组Q’：
上游外引物F3_Q：5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’；
下游外引物B3_Q：5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’；
上游内引物FIP_Q：5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’；
下游内引物BIP_Q：5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’；
上游环引物LF_Q：5’-GCAGGAAGAATGGCTGAATTTG-3’；
和/或，下游环引物LB_Q：5’-CTCTTGTGCCTGCAATAATGC-3’；
引物组R’：
上游外引物F3_R：5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’；
下游外引物B3_R：5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’；
上游内引物FIP_R：5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’；
下游内引物BIP_R：5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’；
下游环引物LB_R：5’-CAGTAAAGGTTGAATGACAGTGATG-3’。
在具体实施方案中，上述引物组D’，N’或Q’中，可以只包含一条上游环引物，或只包含一条下游环引物，或同时包含一条上游环引物和一条下游环引物。在一具体实施方案中，所述引物分别为FIP、BIP、F3、B3、LF和LB所示的引物或与前述引物序列或其互补链序列中单条引物同源性为45％及以上的引物。
本发明还提供一种用于上述恒温检测克阪崎罗诺杆菌菌株方法中的试剂盒，其包括所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异碱基序列的引物组。本发明试剂盒中，所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组，包括但不限于以基因组(GI号:156932229)的1077500～1080076bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分作为所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物组A、引物组B、……、引物组K、引物组L之任意一个引物组等。还包括但不限于以与前述引物序列或其互补链序列中单条序列同源性为45％及以上的引物组作为引物；包括但不限于引物组M、引物组N、……、引物组Q、引物组R等。
本发明试剂盒中，所述能扩增阪崎克罗诺杆菌基因组特异性碱基序列的引物组可以包含或不包含一条或多条环引物；环引物作为可选组分。所述环引物为LF和/或LB。包含环引物LF和/或LB的引物组包括但不限于引物组A’、D’、E’、F’、G’、M’、N’、O’、P’、Q’、R’等。在具体实施方案中，本发明试剂盒中可以包含0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB环引物。在一具体实施方案中，引物组的序列分别为FIP、BIP、F3、B3、LF和LB所示的引物、或与前述序列或其互补链序列单条引物同源性为45％及以上的引物。
本发明试剂盒中，还包括BstDNA聚合酶缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTP溶液、Mg2+(MgSO4或MgCl2)和甜菜碱中的一种或多种。在一具体实施方案中，本发明试剂盒酶反应体系包含1×BstDNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/L Mg2+(MgSO4或MgCl2)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L的甜菜碱。例如，1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO4。1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO4和酶反应体系中的镁离子Mg2+做合并处理。
本发明试剂盒中，还包含阳性对照模板。在一具体实施方案中，所述阳性对照模板包括但不限于阪崎克罗诺杆菌的全基因组DNA、部分基因组DNA，或包含阪崎克罗诺杆菌全基因组DNA或部分基因组DNA的载体。
本发明试剂盒中，还包含阴性对照模板，所述阴性对照模板包括但不限于双蒸水。
本发明试剂盒中，还包含显色剂，显色剂包括但不限于钙黄绿素，SYBR Green I或羟基萘酚蓝。当显色剂为钙黄绿素时，试剂盒中还包含[Mn2+]，例如，MnCl2。
本发明试剂盒中，还包含双蒸水。
本发明试剂盒中，还包含核酸抽提试剂。
本发明还提出了一种载体，所述载体包含选自引物组A～L、M～R、A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’之任意一组引物。该载体由于包含了具有阪崎克罗诺杆菌特异性的DNA序列，因此可应用于微生物分类学、比较基因组学、进化等研究领域，以及微生物检测等应用领域。该载体可以是但不限于质粒载体(如pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript M13、Ti质粒等)、病毒载体(如λ噬菌体等)和人造染色体载体(如细菌人造染色体BAC、酵母人造染色体YAC等)。例如，包含引物组A之任意一条引物的载体pBR322-A、包含引物组B之任意一条引物的载体pBR322-B、……包含引物组R’之任意一条引物的载体pBR322-R’等。包含引物组A之任意一条引物的载体λ噬菌体-A、包含引物组B之任意一条引物的载体λ噬菌体-B、……包含引物组R’之任意一条引物的载体λ噬菌体-R’等。
本发明还提出了选自引物组A～L、M～R、A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’之任意一组的引物在恒温检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。
本发明还提出了所述试剂盒在恒温检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。
本发明还提出了所述载体在恒温检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。
本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物/引物组、检测试剂/试剂盒，对我国的食品安全具有较大意义。本发明有益效果包括：采用本发明阪崎克罗诺杆菌检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、结果判定简单、操作便捷、成本低等优点。与目前常用检测方法相比，本发明采用的恒温扩增法，可以在恒温条件下进行，只需采用简单的恒温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，不需要对扩增产物进行电泳检测等步骤，因而，非常适于广泛应用于社会各界包括基层食品安全检测部门推广使用，即使在分子生物学专业知识和技能基础相对不足的环境下也可充分应用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。
附图说明
图1表明本发明实施例7阪崎克罗诺杆菌恒温检测方法的特异性。
图2表明本发明实施例8阪崎克罗诺杆菌检测方法的灵敏度。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1-6阪崎克罗诺杆菌恒温反应体系和检测方法
按照以下(1)～(3)步骤进行检测：
(1)基因组DNA的提取
用于检测的阪崎克罗诺杆菌菌种来源中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC21560(＝ATCC29544)。取1mL细菌培养物使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA，DNAOD260/OD280为1.8，浓度为288ng/μL。
(2)以待测阪崎克罗诺杆菌基因组DNA为模板，分别采用自配的试剂盒(见表2，表3)，并按照表3中所述条件，配制反应体系，以阪崎克罗诺杆菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应。实施例1～6中的引物分别为引物组A，A’，D’(2条环引物)，D’(1条环引物)，P’，R。
(3)按照表3中所述条件，通过电泳检测、浊度检测或显色检测，进行扩增结果确认。
由表3可以看出，本发明检测方法及其所采用的引物组及反应体系能够很好地对阪崎克罗诺杆菌特异性片段进行扩增并得到检测结果。此外，当采用检测仪进行检测时，缩短反应时间至10min时也有很好的检测效果(如实施例6)。因此，本发明可以应用于检测样本中是否含有阪崎克罗诺杆菌。
按上述实施例方法，分别用引物组B～L，引物组M～Q，引物组E’，F’，G’，M’，N’，O’，Q’，R’，也能够很好地对阪崎克罗诺杆菌特异性片段进行扩增并得到检测结果。
实施例7阪崎克罗诺杆菌特异性检测
收集非阪崎克罗诺杆菌28株(表4和图1中的1～22，24～29)，将这些菌株与阪崎克罗诺杆菌菌株(表4和图1中的23)分别进行培养，取1mL菌液，采用试剂盒IA，提取细菌DNA，并参照实施例1的反应体系和条件，分别进行LAMP扩增和加入显色剂观察。
其检测结果如表4和图1所示，图1中，1-22分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、表皮葡萄球菌、马红球菌、蜡样芽孢杆菌、蕈样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、肠沙门氏菌肠亚种、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大肠埃希氏菌、致泻大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌，24-29分别为小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、弗氏弧菌和霍乱弧菌，NTC：阴性对照，23：阪崎克罗诺杆菌。图1中，仅有阪崎克罗诺杆菌菌株扩增反应后的产物呈现为亮绿色，为阳性结果，如第23号管所示。而其他非阪崎克罗诺杆菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物均呈现为橙色，为阴性结果，如第1～22号管以及NTC阴性对照管所示。
由图1和表4结果可以看出，本发明检测试剂盒及检测方法具有良好的阪崎克罗诺杆菌菌株特异性，即，只有阪崎克罗诺杆菌菌株扩增阳性，其他非阪崎克罗诺杆菌菌株为阴性。
配制检测试剂盒，试剂盒中采用的引物分别为引物组B～L，引物组M～R，引物组A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’，按上述特异性检测方法，分别得到同样的检测结果，即，非阪崎克罗诺杆菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物为阴性结果，阪崎克罗诺杆菌菌株扩增反应后的产物为阳性结果。
此外，按照表1中所述方法，分别对引物组A～L，引物组M～R，引物组A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’的特异性进行理论分析，结果发现，在各条引物最多允许2个错配的情况下，各引物组各条引物不能同时比对到非阪崎克罗诺杆菌上，表明各引物组的特异性均较好。
实施例8灵敏度检测
按实施例2的方法提取细菌CICC21560的DNA，采用试剂盒IIB，并按照50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg、50fgDNA梯度加入反应体系，其他反应条件参照表3实施例2的方法分别进行LAMP扩增和加入显色剂观察。如图2所示，1-7分别为50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg和50fg，NTC：阴性对照。图2中50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，50fg处理和阴性对照的反应产物呈现为橙色，为阴性结果。检测结果表明，每个反应管中最低含500fg(约相当于100个细菌)的DNA时仍可被检出，灵敏度较高。
按上述检测方法，其他步骤及条件同上，分别用引物组A～L，引物组M～R，引物组D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’，每个反应管中低至5pg～500fg的DNA仍可被检出，检测灵敏度较高。
实施例9通用性检测
按照表1中所述方法，分别对引物组A～L，引物组M～R，引物组A’，D’，E’，F’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’的通用性进行理论分析，结果发现，各引物组的引物区域与三株阪崎克罗诺杆菌(GI号分别为156932229，449306535和389839000)的基因组序列完全匹配，理论上可以用于上述三株阪崎克罗诺杆菌菌株的检测，表明各引物组的通用性均较好。
表1阪崎克罗诺杆菌的现有检测方法中引物的通用性和特异性分析
注：a)将专利中引物F3和B3间的序列与阪崎克罗诺杆菌的三个基因组(GI号分别为156932229、449306535和389839000)进行Bowtie比对，确定检测区域在GI号156932229基因组中的位置(星号*表示引物F3和B3间的序列可比对到GI号156932229基因组中的7个重复区域，本表中仅列出1个区域)。专利ZL201310287426.5中四套引物的扩增区域无法定位，文本中也没有给出扩增靶基因为何种基因。b)将检测区域序列在公共数据库资源中进行Blast比对，引物区域完全匹配为通用性好。c)将检测区域序列在公共数据库资源中进行Blast比对，引物区域匹配程度越高，特异性越差。
表2恒温检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒种类及主要组成成分
表3实施例1-6本发明恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法中的反应条件及检测结果
表4试验所用菌株及检测结果
注：a)CGMCC：中国普通微生物菌种保藏中心，CICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心，CMCC：中国医学细菌菌种保藏管理中心。b)+：阳性结果，-：阴性结果。
<110> 上海产业技术研究院、上海旺旺食品集团有限公司
<120> 阪崎克罗诺杆菌核酸快速恒温检测方法及试剂盒
<160> 86
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggattaggaa atatacgacg c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcatatatg atacggggaa 20
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcaaaaccc attggtacct tatactgtct atgggcacaa 40
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaatatgat cccccggctt ctgggaggaa atatcgctaa 40
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttcgatctc cagcttacga ag 22
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gacatgagta tccaccaggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgagaggta acgaacgcag tggcgagatt tcatattgcc gc 42
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agttgctggt gagcttcggc agaagtacag gccagggtaa 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggatacatcc cattggct 18
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtctggagt tattgcaatt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aagcaagcag aatactccca gctgccaggt caatatttgc 40
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
catcaacttt tgtatcatgt gcctgtctcg atttaaacac gcc 43
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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atcatgtgcc tgaagtga 18
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<213> 人工序列
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ttaaccgggc aatgattg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gtaatgacct tgacgcaaag cgttgcttct attggcgtg 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gttcaaaatt tagttcctga gaggcgaaga atggctgaat ttgag 45
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgaagtgatt cggttgct 18
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcgaatctct taatcgatca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacaagccc gtaatgacct tcgagagaga gtaattgca 39
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aacctcagct tctgcctgta attagttgat gttaaccggg 40
<210> 21
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<213> 人工序列
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ctgcctgtac aatctcaaa 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagcaaatta accggcttaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctaaaaatt gctcgcgaat ctccattctt cctgcagcaa t 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tgctcttgtg cctgcaattt tcacaaactg tcaccg 36
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<213> 人工序列
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aatttgctca ctcagttgtg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgaccgtta tcgtcagg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcttttccac aaacgatggt ggttgcaata tttttaccgg c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tatagttcca tccaaggctt actcgtgtca ccaaaaacca ctat 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaggcttact cttgaacca 19
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<213> 人工序列
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tgggactccg aaacaatc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacatataac caggatgacc gttattaagg tgtcaggata gtgg 44
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<213> 人工序列
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gctaagcgtc aatttcgggt gcgcttattt gaaccgtat 39
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<213> 人工序列
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ggcagaaaca gcctgttca 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tggctgggga actttctcat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctgtccagg cattacgtga tgagcatcta cactgacagg cac 43
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
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taaacgcgcc gcagagactg ttatgctggg tgttggcg 38
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<213> 人工序列
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ataaggccca taagtgcg 18
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aggtatggaa aaacagtcac 20
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<213> 人工序列
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ttggcgtccg tatagcgtta ccagtaagaa cggtggat 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
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catcaccata acattcataa caccgtttct ggtcttggag gaat 44
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<213> 人工序列
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gtcccacttt gagatgca 18
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<213> 人工序列
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gactattcaa ctgcctgtt 19
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gcccctttag tctcagcaaa tttatcagtg ctccctatcg 40
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<213> 人工序列
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ctgcaattgt ttcaggaatc agtggaaacg agacaatttc ggt 43
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tcattgcctg taattgcg 18
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tgaaagatct catgccaac 19
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gtgcatttct ggctctcatt gtttagtaac gcaacgacg 39
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ctcgtaaaat gtgtaagcaa gatggggcta aacgcaatac attca 45
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gtacaggcca gggtaaatgt acgtccagtt gctggtgagc tt 42
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<213> 人工序列
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tgaccggtat ttcgacctgt atgccaagtg cgcagacgag at 42
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<213> 人工序列
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ttttgaacaa gcccgtaatg acggcgtgtt taaatcgaga 40
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aacctcagct tctgcctgta attagttgat gttaaccggg 40
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tatcatgtgc ctgaagtgat 20
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<213> 人工序列
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gtaatgacct tgacgcaaag cctattggcg tgtttaaatc g 41
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caaaatttag ttcctgagag gcaacgaaga atggctgaat ttgag 45
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<213> 人工序列
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gattcgcgag caatttttag cttttcacaa actgtcaccg 40
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