用作p2x1及p2x3受体拮抗剂的新型5-羟基吡啶类化合物及包含其的药物组合物
阅读说明：本技术 用作p2x1及p2x3受体拮抗剂的新型5-羟基吡啶类化合物及包含其的药物组合物 (Novel 5-hydroxypyridines as P2X1 and P2X3 receptor antagonists and pharmaceutical compositions containing the same ) 是由 金容哲 郑瑛焕 于 2018-03-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用作P2X1和P2X3受体拮抗剂的新型5-羟基吡啶类化合物和包含该化合物的组合物。本发明的化合物具有强烈拮抗P2X1和P2X3受体的活性,因此可以有效地用作治疗或预防由P2X1和P2X3受体活性引起的慢性炎症性疾病或神经性疼痛疾病的药物。(The present invention relates to novel 5-hydroxypyridines useful as P2X1 and P2X3 receptor antagonists and compositions containing them. The compound of the present invention has strong antagonistic activity against P2X1 and P2X3 receptors, and thus can be effectively used as a drug for treating or preventing chronic inflammatory diseases or neuropathic pain diseases caused by P2X1 and P2X3 receptor activity.)
技术领域
本发明是在未来创造科学部的支持下，通过项目编号为2014R1A2A1A11052300的项目进行的，上述项目的研究管理专业机构是韩国研究基金会，研究事业名称为“核心个人研究(成果扩散)”，研究项目名称为“关于神经性疼痛信号传递的多靶点控制机制及药物设计的研究”，主管机构是韩国科学技术院；研究期间是2014.11.01-2016.10.31。
本专利申请主张2017年3月13日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2017-0031413号的优先权，并且上述专利申请的公开内容通过引用方式引入本说明书当中。
本发明涉及用作P2X1及P2X3受体拮抗剂的新型5-羟基吡啶类化合物及包含其的药学组合物。
背景技术
P2X受体是可响应细胞外腺苷5'-三磷酸(ATP)的结合而被激活的配体门控的阳离子通道。众所周知，当P2X受体的跨膜孔(transmembrane pore)打开时，诸如Ca2+，Na+和K+的阳离子进入细胞质，引起膜去极化和细胞的兴奋性。在哺乳动物中，七种P2X受体亚型在血管平滑肌、血小板、外周和中枢神经系统以及免疫细胞中广泛表达，并介导各种生理过程，包括突触传递、突触前调解、平滑肌收缩、细胞增殖和细胞死亡、内脏运动、血小板聚集、味觉、痛觉及炎症。对斑马鱼P2X4受体的X射线晶体结构的最新研究表明，P2X受体具有共同的拓扑结构，其中包括两个跨膜结构域(TM1和TM2)、ATP结合位点以及含有细胞内N-和C-末端的大的糖基化和富含半胱氨酸的细胞外环。并且，还已知的是ATP与zP2X4受体结合时的门控机制是由晶体结构的载脂蛋白(apo)状态和开放(open)状态之间的立体结构变化来决定的。
在P2X受体亚型中，P2X3受体(P2X3R)以同型(homomeric)P2X3和异型(heteromeric)P2X2/3受体的形式存在于中小直径的C-和Aδ-纤维初级传入神经元中，这对疼痛-传感系统提供高度的特异性。包括基因敲除动物研究(knock-out animal studies)的许多研究表明，P2X3R与疼痛感密切相关。例如，向大鼠后爪施用ATP或P2X3R-选择性激动剂(agonist)αβ-亚甲基ATP会引起疼痛，在神经性或炎性疼痛动物模型中，敲除P2X3R或使用P2X3R选择性反义RNA或siRNA(短干扰RNA)的动物的与疼痛相关的行为明显减少。此外，通过使用P2X3受体拮抗剂TNP-ATP(2',3'-O-(2,4,6三硝基苯基)腺苷-5'-三磷酸酯)及PPADS对P2X3R在疼痛感中的关键作用进行检查的结果，在慢性神经性疼痛动物模型中疼痛反应减少。因此，这些数据表明P2X3R的拮抗作用可能是控制慢性疼痛的潜在治疗策略之一。
在过去的十年中，有效而具有选择性的P2X3受体拮抗剂由包括本发明人在内的制药产业及学术机构进行了开发。雅培实验室(Abbott Laboratories)公开了A-317491(图1a的化合物1)，它是第一种选择性的非核苷酸双重(dual)P2X3-P2X2/3拮抗剂，在慢性和炎性疼痛动物模型中显示出减轻疼痛的作用。罗氏(Roche)报道了作为首个对P2X3-P2X2/3受体具有高功效和选择性的变构(allosteric)拮抗剂的二氨基嘧啶(diaminopyrimidine)类的类似物RO-4(图1b的化合物2a)、RO-51(图1b的化合物2b)和RO-85(图1c的化合物3)。阿斯利康(AstraZeneca)为了改善P2X3受体拮抗剂的功效和理化性质发布了对吡咯并嘧啶酮(pyrrolo-pyrimidinone)衍生物(图1d的化合物4)的构效关系(SAR，structure-activityrelationship)的研究。一种口服的生物相容性强的选择性P2X3-P2X2/3受体拮抗剂AF-219作为Afferent制药公司(Afferent Pharmaceuticals)的临床候选药物，由于在包含间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征和慢性咳嗽的II期临床试验中通过几种概念验证研究的结果，显示出明显的药理作用。本发明人报道了选择性和非竞争性的肽拮抗剂斯宾诺芬(Spinorphin)(图1e的化合物5，IC50＝8.3pM)和5-羟基吡啶衍生物(图1g的化合物7a-c)，并且这些化合物是将作为非选择性P2X拮抗剂的PPADS(图1f中的化合物6a)的强阴离子磷酸磺酸基和不稳定的偶氮键(-N＝N-)分别变形为弱的阴离子羧酸和稳定的碳-碳键来进行开发的。
为了优化5-羟基吡啶衍生物的药物性质(图1g的化合物7a-c)，本发明人在碳的各个位置引入了各种取代基，其结果，开发了具有更高生物稳定性和优异拮抗作用的新型hP2X3受体拮抗剂。
整个本说明书中参照了多数论文和专利文献，并显示了其引用。所引用的论文和专利文献的公开内容作为整体以参照的方式引入到本说明书中，从而更明确地描述本发明所属的技术领域的水平和本发明的内容。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明人试图开发针对在疼痛和炎性信号传导中起重要作用的P2X1受体和P2X3受体的新型拮抗剂而努力研究。本发明人合成了针对在5-羟基吡啶衍生物的各个位置上的碳引入各种取代基的新型化合物(图1g的化合物7a-c)，并试验其药代动力学和功效的结果，通过阐明该新型化合物具有更高的生物稳定性和优良的拮抗作用的hP2X3受体拮抗剂来完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种用作P2X1及P2X3受体拮抗剂的新型5-羟基吡啶类化合物及包含其的药物组合物。
本发明的另一个目的在于提供一种将包含上述用作P2X1受体和P2X3受体的新型5-羟基吡啶类化合物的药物组合物施用在受试者的步骤的慢性炎症性疾病、神经性疼痛疾病或血小板聚集相关的疾病的治疗方法。
本发明的其他目的和优点通过下述的本发明的详细的描述、权利要求及附图会更加明确。
用于解决问题的方案
根据本发明的一方面，本发明提供了一种由以下通式1表示的化合物、上述化合物异构体或药学上可接受的盐：
【通式1】
在上述通式1中，
A为以下化学式1或2所示的取代基中的任意一个，
【化学式1】
【化学式2】
其中n和m分别独立地为0至5的整数；
R1是氢原子、未被取代或被羧基、磺酰基、硫醚(例如-CH2CH2SCH3)、苄基、苯乙基取代的直链型或支链型C1-C6烷基；
R2是氢原子、未被取代或被羧基、磺酰基、氰基、酰胺、四唑基或
R3是氢原子、未被取代或被羧基取代的直链型或支链型C1-C6烷基，或与R2一起形成上述5元-6元杂环基；
R4是氢原子，或直链型或支链型C1-C6烷基；
R5是未被取代或被苯基、吡咯烷基、哌啶基、四氢呋喃或1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基取代的直链型或支链型C1-C8烷基、C5-C6环烷基或
根据本发明的一体现例，上述通式I的R2可以是氢原子、C1-C6烷基、-COOH、-CH＝CHCOOH、-CH2CH2COOH、甲基磺酰基(-S(＝O)2-CH3)、氰基、酰胺(-CONH2)、
其中R5可以是
当由上述通式I表示的化合物的A是上述化学式1时，属于上述通式I的化合物组包括有以下特征的化合物组：
n是0至5的整数；R1是氢原子、未被取代或被羧基、磺酰基、硫醚(例如-CH2CH2SCH3)、苄基、苯乙基取代的直链型或支链型C1-C4烷基；R2是氢原子、未被取代或被羧基、磺酰基、氰基、酰胺、四唑基或
并且，当由上述通式I表示的化合物的A是上述化学式2时，属于上述通式I的化合物组包括有以下特征的化合物组：
m是0至5的整数；R1是氢原子，或者直链型或者支链型的C1-C3烷基；R2是氢原子、未被取代或被羧基、-CH2NH2、-CH2NH-S(＝O)2-CH3、氰基或
另外，根据本发明的一体现例，提供了由以下通式Ia表示的5-羟基吡啶类化合物、上述化合物的异构体或上述化合物的药学上可接受的盐：
【通式Ia】
上述通式Ia中，
R1是氢原子、直链型或支链型的C1-C4烷基、羧基(-COOH)、甲基磺酰基乙基(-CH2CH2-S(＝O)2-CH3)、-CH2CH2SCH3、苄基或苯乙基；R2是氢原子、C1-C3烷基、-COOH、-CH＝CHCOOH、-CH2CH2COOH、甲基磺酰基(-S(＝O)2-CH3)、氰基、酰胺(-CONH2)或或与R3一起形成包含至少一个选自由N、O、S组成的组中的原子的五元-六元杂环基；R3是氢原子、C1-C3烷基或羧基，或与R2一起形成5元-6元杂环基。R4是氢原子或C1-C3烷基。
另外，根据本发明的另一体现例，提供了由以下通式Ib表示的5-羟基吡啶类化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：
【通式Ib]
上述通式Ib中，R1是氢原子或直链型或支链型的C1-C3烷基；R2是氢原子、直链型或支链型的C1-C3烷基、-COOH、-CH＝CHCOOH、-CH2CH2COOH、-CH2NH2、磺酰基(-CH2NH-S(＝O)2-CH3)、氰基或
此外，根据本发明的又一体现例，本发明提供了由以下通式Ib′表示的5-羟基吡啶类化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：
【通式Ib′】
在通式Ib′中，
R1是氢原子或直链型或支链型的C1-C3烷基；R3是氢原子或直链型或支链型的C1-C3烷基；R5是
属于上述通式Ia的化合物中，可以包括：
5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸(13a)；
5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基吡啶-3,4-二羧酸(13b)；
6-乙基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸(13c)；
5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-丙基吡啶-3,4-二羧酸(13d)；
6-丁基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸(13e)；
5-羟基-6-异丙基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸(13f)；
5-羟基-6-异丁基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸(13g)；
6-苄基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸(13h)；
5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-苯乙基吡啶-3,4-二羧酸(13i)；
3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-2,4,5-三羧酸(13j)；
5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-(2-(甲硫基乙基)乙基)吡啶-3,4-二羧酸(13k)；
5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-(2-(甲基磺酰基)乙基)吡啶-3,4-二羧酸(13l)；
4-氰基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基烟酸乙酯(14)；
5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基-4-(H-四唑-5-基)烟酸乙酯(15)；
4-氰基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基烟酸(16)；
5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基-4-(H-四唑-5-基)烟酸(17)；
7-羟基-4-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基呋喃[3,4-c]吡啶-1,3-二酮(18)；
8-羟基-5-(4-甲氧基苯乙基)-7-甲基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4-二酮(19)；
6-(4-甲氧基苯乙基)-2-甲基-4-(甲基磺酰基)吡啶-3-醇(20)；
3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-2-甲基异烟酸甲酯(21a)；
3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-2,5-二甲基异烟酸甲酯(21b)；
3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-5-甲基-2-丙基异烟酸甲酯(21c)；
3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-2-甲基异烟酸(22a)；
3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-2,5-二甲基异烟酸(22b)；
3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-5-甲基-2-丙基异烟酸(22c)；和
5-羟基-2-[2-(2-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-丙基-吡啶-4-羧酰胺(23)。
属于上述通式Ib或Ib′中的化合物，可以包括：
5-羟基-2-(3-苯氧基苄基)-6-丙基吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(26)；
5-羟基-2-(3-苯氧基苄基)-6-丙基吡啶-3,4-二羧酸(27)；
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸甲酯(28)；
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸(29)；
3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸甲酯(30)；
(3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)甲醇(31)；
4-(羟甲基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-3-醇(32)；
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟醛(33)；
(E)-3-(3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)丙烯酸乙酯(34)；
(E)-3-(3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)丙烯酸(35)；
3-(3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)丙酸乙酯(36)；
3-(3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)丙酸(37)
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟腈(38)；
3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟腈(39)；
(3-(环六-2,4-二烯-1-基甲氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)甲胺(40)；
4-(氨基甲基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-3-醇(41)；
N-((3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)甲基)甲磺酰胺(42)；
N-((3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)甲基)甲磺酰胺(43)；
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸苯乙酯(Phenethyl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46a)；
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸辛酯(Octyl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46b)；
2-邻苯二甲酰亚胺基乙基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(2-phthalimidoethyl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46c)；
4-邻苯二甲酰亚胺基丁基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(4-phthalimidobutyl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46d)；
2-(吡咯烷-1-基)乙基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(2-(pyrrolidin-1-yl)ethyl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46e)；
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸异丙酯(Isopropyl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46f)；
戊-3-基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(Pentan-3-yl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46g)；
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸环戊酯(Cyclopentyl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46h)；
四氢呋喃-3-基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(Tetrahydrofuran-3-yl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46i)；
1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(1-(Tert-butoxycarbonyl)piperidin-4-yl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(46j)；
哌啶-4-基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(Piperidin-4-yl3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(47)；和
3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸乙酯(Ethyl 3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)(48)。
由上述通式I表示的本发明的化合物在该技术领域中可以根据常规方法制备药学上可接受的盐及溶剂化物。
由药学上可接受的游离酸(free acid)形成的酸加成盐可用作盐。酸加成盐可以通过常规方法制备，例如，通过将化合物溶解在过量的酸水溶液中，并且通过使用与水混溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈使该盐沉淀。可以加热与化合物和水等摩尔量的酸或醇(例如，乙二醇单甲醚)，然后通过蒸发上述混合物进行干燥，或可以对析出的盐进行抽滤。
此时，作为游离酸，可以使用有机酸和无机酸。作为无机酸，可以使用盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、酒石酸等；作为有机酸，可以使用甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、扁桃酸(propionic acid)、柠檬酸(citricacid)、乳酸(lactic acid)、乙醇酸(glycollic acid)、葡萄糖酸(gluconic acid)、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸(glutaric acid)、葡糖醛酸(glucuronic acid)、天冬氨酸、抗坏血酸、碳酸，香草酸，氢碘酸等。
并且，可以使用碱来制备药学上可接受的金属盐。例如，通过将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，并过滤未溶解的化合物盐，然后蒸发并干燥滤液的方式获得碱金属盐或碱土金属盐。在此，作为金属盐，在制药方面最合适的是制备钠盐、钾盐或者钙盐，并且，与金属盐对应的银盐可以通过将碱金属或碱土金属盐与适当的银盐(例如，硝酸银)进行反应的方式获得。
除非有其他说明，具有上述通式I的结构的5-羟基吡啶类化合物的药学上可接受的盐可以包括可以存在于具有通式I的结构的5-羟基吡啶类化合物中的酸性或碱性基团的盐。例如，药学上可接受的盐可以包括羟基的钠盐、钙盐和钾盐，并且，氨基的其他药学上可接受的盐可以包括氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐，酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、对甲苯磺酸盐(tosylate)等，这些盐可以通过本领域已知的制备方法或者制备过长来进行制备。
另外，具有通式I的结构的5-羟基吡啶类化合物具有不对称中心，因此可以以不同的对映异构体的形态存在，并且，具有通式I的结构的5-羟基吡啶类化学物的所有光学异构体和R或S型立体异构体及它们的混合物均在本发明的范围内。本发明包括外消旋物、一种以上对映异构体形态、一种以上非对映异构体形态或它们的混合物的用途，并且还包括本领域已知的异构体的分离方法或制备方法。
本发明的另一目的是作为提供上述通式I化合物的制备方法，可以通过以下的反应式当中所示的方法进行化学合成，但不限于这些实例。
以下的反应式按制备步骤显示了本发明的代表性的化合物的制备方法，并且本发明通过小的修饰(在反应式1至8的合成过程中对使用的试剂、溶剂和反应顺序进行变更)来制备。
根据未在反应式范围的过程合成了本发明的一些化合物，并且对于这些化合物的详细合成方法在其各自的实施例中进行了描述。
(反应式1)3,4-二羧基吡啶衍生物(3,4-Dicarboxypyridine derivatives)的制备
上述反应式1中的试剂及条件：(a)EDC，TEA，DCM，RT，2h，55-99％；(b)P2O5，CHCl3，回流5h，58-99％；(b’)三苯基膦，碘，TEA，DCM，RT，12h，50-63％；(c)马来酸二甲酯，纯(neat)，回流，5h，21-52％；(d)
(反应式2)5-羟基吡啶衍生物(5-Hydroxypyridine Derivatives)的制备(化合物16-19)
(反应式2-1)
(反应式2-2)
(反应式2-3)
反应式2(2-1至2-3)的试剂和条件：(a)顺式-β-氰基丙烯酸酯，纯(neat)，回流，5h，27-55％；(b)叠氮化钠，氯化铵，DMF，90℃，12h，48-62％；(c)20％KOH(aq)，室温，6h，30-52％；(d)马来酸酐，苯，60℃，2h，43-54％；(e)水合肼(aq)，无水乙酸钠，乙酸，回流，2h，35-46％；(f)甲基乙烯基砜，纯，回流，5h，49-55％。
(反应式3)5-羟基吡啶衍生物的制备(化合物21-23)
上述反应式3中的试剂及条件：(a)丙烯酸甲酯，纯(neat)，5h，37％-46％；(a’)巴豆酸甲酯，纯(neat)，5h，32％-52％；(b)20％KOH(aq)，RT，6h，40％-57％；(c)30％氨水(aq)，RT，12h，32％-45％。
(反应式4)5-羟基吡啶衍生物(5-Hydroxypyridine Derivatives)的制备(化合物36-39、33-37)
(反应式4-1)
(反应式4-2)
反应式4的试剂和条件：(a)P2O5，CHCl3，回流，5h，85％-99％；(b)巴豆酸甲酯，纯，回流，5h，22％-52％；(c)溴化苄，K2CO3，丙酮，回流2h，73％-96％；(d)LAH，***，0℃，1h，67％-88％；(e)Pd/C，H2，RT，0.5h，54％-91％；(f)MnO2，DCM，RT，2h，66-85％；(g)NaH，膦酰基乙酸三乙酯，THF，RT，1h，63％-78％；(h)20％KOH(aq)，室温，6h，37％-94％；(i)马来酸二甲酯，纯，回流，5h，32％-54％。
(反应式5)5-羟基吡啶的衍生物(5-Hydroxypyridine Derivatives)的制备(化合物38-43)
反应式5的试剂和条件：(a)甲基巴豆腈，纯，回流，5h，52％-74％；(b)溴化苄，K2CO3，丙酮，回流，2h，62％-86％；(c)LAH，***，0℃，1h，52％-74％；(d)甲磺酰氯，TEA，DCM，RT，1h，61％-77％；(e)Pd/C，H2，RT，0.5h，60％-91％。
(反应式6)化合物46a-j的制备
反应式6的试剂和条件：(a)20％KOH，甲醇，1,4-二氧六环，50℃，2d，63％；(b)烷基溴，NaHCO3，DMF，60℃，5h，35％-89％；(c)Pd/C，H2(1atm)，DCM，甲醇，RT，30min，22％-89％。
化合物45a-j和化合物46a-j的取代基R如下表1所示：
【[表1】
(反应式7)5-羟基吡啶衍生物(5-Hydroxypyridine Derivatives)的制备(化合物47)
反应式7的Boc脱保护的试剂和条件：20％TFA，DCM，RT，1h，67％。
(反应式8)5-羟基吡啶衍生物(5-Hydroxypyridine Derivatives)的制备(化合物48)
反应式8的狄尔斯-阿尔德(diels-Alder)反应的试剂和条件：巴豆酸乙酯，纯，5h，42％。
由于本发明的通式I表示的化合物对P2X1受体和P2X3受体表现出强的拮抗作用，因此上述化合物可以有效地用作能够预防或治疗由P2X1受体和P2X3受体活性引起的疾病的制剂，这些疾病是，例如变性关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病或膀胱炎等疾病等慢性炎症性疾病；神经性疼痛、异常性疼痛、糖尿病性神经病、自发性疼痛、刺激性疼痛、幻肢痛或复杂性局部疼痛综合征等神经性疼痛疾病；或动脉硬化、脑卒中、血栓症、栓塞、心肌梗塞、动脉粥样硬化或外周血循环障碍等血小板聚集有关的疾病。
本发明提供一种以上述通式I的化合物作为有效成分的、用于预防或治疗由P2X1受体和P2X3受体活性引起的慢性炎症性疾病、神经性疼痛疾病或与血小板聚集相关的疾病的药物组合物。
在本文中所定义的由P2X1受体和P2X3受体活性引起的慢性炎症性疾病包括，例如，退行性关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病或膀胱炎等；由P2X1受体和P2X3受体活性引起的神经性疼痛疾病包括，例如，神经性疼痛、异常性疼痛，糖尿病性神经病，自发性疼痛，刺激性疼痛，幻肢痛或复杂性局部疼痛综合征等；由P2X1受体和P2X3受体活性引起的血小板聚集相关的疾病包括，例如，动脉硬化、脑卒中、血栓症、栓塞、心肌梗塞、动脉粥样硬化或外周血循环障碍等。
因此，本发明提供一种具有通式I结构的吡啶羧酸类化合物作为有效成分的、用于P2X1受体和P2X3受体的拮抗剂。
本发明人利用双电极电压钳法(TEVC)确认了在表达为克隆的小鼠P2X1受体和人类P2X3受体的蛙卵(非洲爪蟾***)中新型5-羟基吡啶类化合物对P2X1受体和P2X3受体显示了强烈的拮抗活性，并且通过分析对表达为人类P2X7受体的人类HEK293细胞的溴化乙锭的积累，确认了本发明的化合物作为治疗和预防由P2X1受体和P2X3受体活性引起的慢性炎症性疾病、神经性疼痛疾病或血小板聚集相关疾病的药物，具有很高的开发可能性，并完成了本发明。
在另一方面，本发明涉及用于预防和治疗由P2X1受体和P2X3受体活性引起疾病的包含吡啶羧酸类化合物的药学组合物和通过使用吡啶羧酸类化合物治疗上述疾病的方法。
本发明中，术语“预防”是指旨在通过施用包含5-羟基吡啶类化合物的组合物来抑制与P2X1受体和P2X3受体活性有关的所有疾病的发作或延迟发作的所有行为。术语“治疗”是指旨在通过施用药物组合物来改善或有益地改变与P2X1受体和P2X3受体活性有关的所有疾病的所有行为。
本发明的包含5羟基吡啶类化合物的组合物和治疗方法不仅可以用于人类，而且也可用于可发作与P2X1和P2X3受体活性有关的所有疾病的牛、马、羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗、猫等哺乳动物。
另外，本发明提供一种具有上述通式(I)结构的5-羟基吡啶类化合物作为有效成分的、用于预防和治疗由P2X1受体和P2X3受体活性相关的所有疾病的药学组合物。
包含本发明的化合物的组合物根据本领域的常规方法，还包括合适的载体、赋形剂或者稀释剂。
可以包含本发明的组合物中的载体、赋形剂及稀释剂包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油。
包含本发明化合物的组合物分别根据本领域的常规方法以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服制剂的剂型、外用剂、栓剂、或无菌注射液的形态剂型化来使用。
详细地，当配制制剂时，本发明的组合物可以通过使用通常使用的填充剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来进行制备。用于口服的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这些固体制剂可以通过上述化合物中至少一种赋形剂例如，淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖、明胶(lactose)等进行混合而制备。并且，除了简单的赋形剂以外，也可以使用硬脂酸镁和滑石粉。用于口服的液体制剂包含混悬剂、内用溶液、乳剂、糖浆等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡以外，还可以包括各种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。非口服给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂和栓剂。丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)可用作非水溶液和混悬剂。作为栓剂的基质，可以使用半合成椰油酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂酸酯、甘油明胶等。
本发明的化合物的优选剂量根据患者的状况和体重、疾病的程度、药物形态、给药途径和时间而有所不同，但是可以由本领域技术人员适当地进行选择。但是为了获得优选的效果，本发明的化合物的日剂量可以为0.0001mg/kg～100mg/kg，优选为0.001mg/kg至100mg/kg，并且该剂量可以以每日一次至分多次来进行给药。相对于组合物的总重量，组合物中存在的本发明的化合物的量可以为0.0001重量％至10重量％，优选为0.001重量％～1重量％。
另外，本发明的化合物的药用剂型，可以以可药用盐的形式使用，或者可以单独使用或者与其他药物活性化合物结合使用以及以适当的组合来使用。
本发明的药物组合物通过各种途径给药于大鼠、小鼠、家畜和人等哺乳动物。可以预料给药的所有方式，例如，可以通过口服、直肠或静脉内、肌内、皮下、子宫内膜或脑血管内(intracerebroventricular)注射的方式给药。
发明效果
本发明提供一种用作P2X1及P2X3受体拮抗剂的新型5-羟基吡啶类化合物及包含该化合物的药物组合物。根据本发明的化合物强烈拮抗P2X1和P2X3受体，因此可以有效地用作治疗和预防由P2X1和P2X3受体活性引起的疾病，即慢性炎症性疾病或神经性疼痛疾病的药物。
附图说明
图1a至图1f是示出现有开发的P2X受体拮抗剂和本发明人报道的P2X受体拮抗剂的图。
图2a至图2c是示出对本发明的化合物29的P2X3及P2X2/3受体的拮抗活性的图(2a：hP2X3R，2b：rP2X3/3)。
图3a和图3b是示出通过硬膜内给药普瑞巴林(pregabalin)、AF353及化合物29来显示SNL大鼠的抗痛觉过敏作用的图。退缩阈值(withdrawal threshold)或者最大可能效果(maximum possible effect)的百分比(1μg时的％MPE)代表每个实验组5至6只大鼠的平均值±SEM。与载体(对照组)相比，*P＜0.05。
图4a和图4b是示出通过静脉内给药化合物28来显示SNL大鼠的抗痛觉过敏作用的图。退缩阈值或最大可能效果的百分比代表每个实验组5-6只大鼠的平均值±SEM。与载体(对照组)相比，**P<0.01，***P<0.001。
图5a和图5b是示出通过静脉内给药化合物28来显示CIPN大鼠的抗痛觉过敏作用的图。退缩阈值或最大可能效果的百分比代表每个实验组5-6只大鼠的平均值±SEM。与载体(对照组)相比，*P＜0.001。
具体实施方式
以下，将通过实施例对本发明进行更详细地说明。这些实施例旨在对本发明进行更具体的说明，并且根据本发明的要点本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。
参考例1，实验准备等
缩略语
本实验中所使用的略语的定义如下：
ACN，乙腈；
ANOVA，方差分析；
ATP，5′-三磷酸腺苷；
BBB，血脑屏障；
BzATP，2′(3′)-O-(4-苯甲酰基苯甲酰基)-ATP；
CIPN，化疗诱导的周围神经病；
CYP，细胞色素P450；
DMSO，二甲基亚砜；
FBS，胎牛血清；
i.p.，腹膜内给药；
i.v.，静脉注射；
MPE，最大可能的效果；
NeP，神经性疼痛；
PBS，磷酸缓冲盐溶液；
PEG，聚乙二醇；
P2XR，P2X受体；
SAR，构效关系(structure-activity relationship)；
SNL，脊髓神经结扎；
TEVC，双电极电压钳；
TM，跨膜
化学分析
1H和13C核磁共振(NMR)光谱从300MHz的Jeol JNM-LA 300WB光谱仪和400MHz的Jeol JNM-ECX 400P光谱仪上获得，并且，光谱从CDCl3，DMSO-d6或CD3OD中获得。相对于作为内标的四甲基硅烷(TMS)，以δ单位和ppm单位表示化学位移。数据报告如下：化学位移(Chemical shifts)、积分(integration)、多重性(multiplicity)(s，单峰；d，双峰；t，三重峰；m，多重峰；br，宽峰)。偶合常数J报告为Hz单位。在MALDI-TOF及ESI(电喷雾电离)设备上执行质谱法。另外，所选化合物的高分辨率质谱(m/z)通过在韩药振兴财团(长兴郡)的ESI(电喷雾电离)进行了分析。
所有最终化合物的纯度均通过HPLC来进行了测定(除非另有说明，否则纯度至少为95％)。纯度的测定通过使用Shimadzu Shim-pack C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm，100A)在Shimadzu SCL-10A VP HPLC系统上用两个溶剂系统执行。通过0.1％甲酸溶液(H2O):CH3CN＝90:10至1:100的比例在30分钟内以1mL/min的流速运行溶剂系统。通过使用二极管阵列检测器，通过UV吸收来进行检测峰(peak)。
实施例1，制备化合物10a-k的一般程序
在3-(4-甲氧基苯基)丙酸8(1.0当量)、各种伯胺化合物9a-k(1.0当量)和EDC(2.0当量)的无水二氯甲烷混合物中滴加三乙胺(1.0当量)。将反应混合物在室温中搅拌2小时，然后用饱和碳酸氢钠水溶液进行稀释。分离有机层，并将水层进一步用二氯甲烷萃取。利用无水Na2SO4对合并的有机萃取物进行干燥，并且在真空下浓缩之后，利用正己烷/乙酸乙酯＝3:1在硅胶上进行层析，从而获得作为粘性油的化合物10a-k。
化合物10a-k的具体制备方法和物理性质如下：
1-1.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]乙酸乙酯10a中间体
根据合成上述的化合物10a-k的一般程序，通过化合物8(1.0g，5.5mmol)和甘氨酸乙酯(glycine ethyl ester)(0.77g，5.5mmol)来制备。
产量1.4g(97％)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δppm 1.28(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.48-2.95(2H，m，2xCH2)，3.78(3H，s，CH3O)，4.00(2H，d，J＝5.1Hz，CH2)，4.20(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，6.00-6.08(1H，m，NH)，6.79-6.85(2H，m，苯基)，7.12(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝266.3[M+H]。
1-2.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]丙酸乙酯(Ethyl2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]propanoate)10b中间体
根据合成上述的化合物10a-k的一般程序，通过化合物8(5.9g，32mmol)和L-丙氨酸乙酯(L-alanine ethyl ester)(5.0g，32mmol)来制备。
产量7.3g(82％)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.22(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.35(3H，d，J＝7.2Hz，CH3)，2.53(2H，t，J＝6.9Hz，CH2)，2.88(2H，t，J＝6.9Hz，CH2)，3.79(3H，s，CH3O)，4.15(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，4.52-4.59(1H，m，CH)，5.96(1H，d，J＝5.4Hz，NH)，6.82-7.19(4H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝280.2[M+H]。
1-3.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]丁酸甲酯(Methyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]butanoate)10c中间体
根据合成上述的化合物10a-o的一般程序，通过化合物8(0.96g，5.3mmol)和DL-2-氨基丁酸甲酯(DL-2-aminobutyric acid methyl ester)(0.81g，5.3mmol)来制备。
产量1.4g(92％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ0.79(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.47-1.69(2H，m，CH2)，2.31-2.40(2H，m，CH2)，2.66-2.74(2H，m，CH2)，3.57(3H，s，CH3O)，3.67(3H，s，CH3O)，4.07-4.15(1H，m，CH)，6.76-6.81(2H，m，苯基)，7.04-7.10(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝280.2[M+H]。
1.4.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]戊酸乙酯(Ethyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]pentanoate)10d中间体
根据合成上述的化合物10a-o的一般程序，通过化合物8(2.9g，17mmol)和L-正缬氨酸乙酯(L-norvaline ethyl ester)(3.0g，17mmol)来制备。
产量5.2g(99％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.88(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.11-1.23(2H，m，CH2)，1.27(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.53-1.57(2H，m，CH2)，1.69-1.77(2H，m，CH2)，2.44-2.56(2H，m，CH2)，2.88-2.95(2H，m，CH2)，3.78(3H，s，CH3O)，4.17(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，4.55-4.60(1H，m，CH)，5.84-5.86(1H，m，NH)，6.81(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.11(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝308.3[M+H]。
1-5.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]己酸甲酯(Methyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]hexanoate)10e中间体
根据合成上述的化合物10a-o的一般方法，通过化合物8(0.50g，2.8mmol)和DL-正亮氨酸甲酯(DL-norleucine methyl ester)(0.5g，2.8mmol)来制备。
产量0.79(89％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.85(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.12-1.16(2H，m，CH2)，1.21-1.28(2H，m，CH2)，1.54-1.58(1H，m，CH)，1.71-1.75(1H，m，CH)，2.43-2.51(2H，m，CH2)，2.87-2.92(2H，m，CH2)，3.71(3H，s，CH3O)，3.76(3H，s，CH3O)，4.55-4.60(1H，m，CH)，5.81-5.83(1H，m，NH)，6.79-6.82(2H，m，苯基)，7.10-7.12(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝308.1[M+H]。
1-6.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]-3-甲基丁酸乙酯(Ethyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]-3-methyl-butanoate)10f中间体
根据合成上述的化合物10a-o的一般程序，通过化合物8(2.9g，17mmol)和L-正缬氨酸乙酯(L-valine ethyl ester)(3.0g，17mmol)来制备。
产量5.00g(99％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.82-0.86(6H，m，2xCH3)1.29(3H，t，J＝6.8Hz，CH3)，2.07-2.12(1H，m，CH)，2.48-2.59(2H，m，CH2)，2.90-2.94(2H，m，CH2)，3.78(3H，s，CH3O)，4.16-4.22(2H，m，CH2)，4.52-4.55(1H，m，CH)，5.84-5.86(1H，m，NH)，6.85(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.16(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝308.7[M+H]。
1-7.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]-4-甲基戊酸乙酯(Ethyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]-4-methyl-pentanoate)10g中间体
根据合成上述的化合物10a-o的一般程序，通过化合物8(2.7g，15mmol)和L-亮氨酸乙酯(L-leucine ethyl ester)(3.0g，15mmol)来制备。
产量4.9g(99％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.92(6H，t，J＝6.4Hz，2xCH3)1.25(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.42-1.48(2H，m，CH2)，1.53-1.57(1H，m，CH)，2.43-2.53(2H，m，CH2)，2.87-2.94(2H，m，CH2)，3.77(3H，s，CH3O)，4.13(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，4.57(1H，m，CH)，5.71-5.73(1H，m，NH)，6.80(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.10(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝322.7[M+H]。
1-8.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]-3-苯基丙酸乙酯(Ethyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]-3-phenyl-propanoate)10h中间体
根据合成上述的化合物10a-o的一般程序，通过化合物8(2.3g，13mmol)和L-苯丙氨酸乙酯(L-phenylalanine ethyl ester)(3.0g，13mmol)来制备。
产量4.60g(99％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 1.22(3H，t，J＝6.8Hz，CH3)2.42-2.50(2H，m，CH2)，2.86-2.91(2H，m，CH2)，3.06-3.07(2H，m，CH2)，3.77(3H，s，CH3O)，4.13-4.19(2H，m，CH2)，4.86-4.88(1H，m，CH)，5.84-5.86(1H，m，NH)，6.81-6.85(2H，m，苯基)，6.95-6.98(2H，m，苯基)，7.09-7.13(2H，m，苯基)，7.22-7.25(3H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝356.3[M+H]。
1.9.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]-4-phenyl-butanoate)10i中间体
根据合成上述的化合物10a-o的一般程序，通过化合物8(2.2g，12mmol)和D-高苯丙氨酸乙酯(D-homophenylalanine ethyl ester)(3.0g，12mmol)来制备。
产量2.40g(55％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 1.27(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)1.87-2.16(2H，m，CH2)，2.41-2.56(4H，m，2xCH2)，2.86-2.93(2H，m，CH2)，3.73(3H，s，CH3O)，4.14(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，4.62-4.68(1H，m，CH)，5.90(1H，m，NH)，6.81(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.11-7.15(4H，m，苯基)，7.18-7.21(1H，m，苯基)，7.26-7.30(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝370.3[M+H]。
1-10.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]丙二酸二乙酯(Diethyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]propanedioate)10j中间体
根据合成上述的化合物(10a-o)的一般程序，通过化合物8(2.5g，14mmol)和氨基丙二酸二乙酯(3.0g，14mmol)来制备。
产量4.40g(92％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.27(6H，t，J＝7.2Hz，2xCH3)，2.53-2.57(2H，m，CH2)，2.88-2.92(2H，m，CH2)，3.77(3H，m，CH3)，4.21-4.28(4H，m，2xCH2)，5.12-5.13(1H，m，CH)，6.80-6.82(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.10-7.12(2H，d，J＝6.8Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝338.1[M+H]。
1-11.制备2-[3-(4-甲氧基苯基)丙酰氨基]-4-甲基硫烷基丁酸乙酯(Ethyl 2-[3-(4-methoxyphenyl)propanoylamino]-4-methylsulfanyl-butanoate)10k中间体
根据合成上述的化合物10a-o的一般程序，通过化合物8(2.5g，14mmol)和DL-蛋氨酸乙酯(DL-methionine ethyl ester)(3.0g，14mmol)来制备。
产量4.7g(99％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 1.31(3H，t，J＝6.8Hz，CH3)，2.08(3H，s，CH3S)，2.10-2.15(2H，m，CH2)，2.31-2.61(4H，m，2xCH2)，2.91-2.99(2H，m，CH2)，3.82(3H，s，CH3O)，4.22-4.26(2H，q，J＝6.8Hz，CH2)，4.69-4.73(1H，m，CH)，6.06-6.08(1H，m，NH)，6.85-6.88(2H，m，苯基)，7.15-7.17(2H，m，苯基)；MS(ESI)m/z＝340.2[M+H]。
实施例2.制造化合物11a-k的一般程序
将五氧化二磷(Phosphorous pentoxide)(2.0当量)添加到干燥的二氯甲烷中的化合物10a-k(1.0当量)溶液中。将混合物回流5小时，冷却至室温，然后用20％KOH水溶液来处理，并剧烈搅拌30分钟。将混合物转移至分液漏斗，然后用二氯甲烷萃取三次。利用无水Na2SO4对合并的有机萃取物进行干燥，并在真空下进行浓缩，然后利用正己烷/乙酸乙酯＝3:1在硅胶上进行层析，从而获得作为粘性油的化合物11a-k。
2-1.制备5-乙氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)恶唑11a
根据合成上述的化合物11a-k的一般程序，通过化合物10a(1.3g，4.9mmol)和五氧化磷(Phosphorous pentoxide)(2.8g，9.8mmol)来制备。
产量1.3g(99％)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.29(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.01(3H，s，CH3)，3.94(2H，s，CH2)，4.05(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，7.23-34(5H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝248.3[M+H]。
2-2.制备5-乙氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)-4-甲基恶唑11b
根据合成上述化合物11a-k的一般程序，通过化合物10b(6.4g，22mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(13g，44mmol)来制备。
产量5.3g(91％)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.31(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.01(3H，s，CH3)，2.83(2H，t，J＝6.0Hz，CH2)，2.90(2H，t，J＝6.0Hz，CH2)，4.05(3H，s，OCH3)，4.32(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，6.81(2H，d，J＝8.7Hz，苯基)，7.10(2H，d，J＝8.7Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝262.4[M+H]。
2-3.制备4-乙基-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)恶唑11c
根据合成上述化合物11a-k的一般程序，通过化合物10c(1.4g，4.9mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(2.8g，9.8mmol)来制备。
产量1.1g(88％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.16(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.38(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，2.83-3.00(4H，m，2xCH2)，3.77(3H，s，OCH3)，3.84(3H，s，OCH3)，6.79-6.85(2H，m，苯基)，7.06-7.13(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝262.4[M+H]。
2-4.制备5-乙氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)-4-丙基恶唑11d
根据合成上述化合物11a-k的一般程序，通过化合物10d(1.0g，3.3mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(1.9g，6.5mmol)来制备。
产量0.55g(58％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.83-0.96(3H，m，CH3)，1.25-1.37(3H，m，CH3)，1.52-1.64(2H，m，CH2)，2.25-2.36(2H，m，CH2)，2.80-3.00(4H，m，2xCH2)，3.77(3H，s，CH3O)，4.01-4.12(2H，m，CH2)，6.75-6.84(2H，m，苯基)，7.03-7.13(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝290.0[M+H]。
2-5.制备4-丁基-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)恶唑11e
根据合成上述化合物11a-k的一般程序，通过化合物10e(0.78g，2.4mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(1.4g，4.9mmol)来制备。
产量0.67g(91％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.88(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.29-1.34(2H，m，CH2)，1.52-1.58(2H，m，CH2)，2.84-2.89(2H，m，CH2)，2.93-2.98(2H，m，CH2)，3.77(3H，s，CH3O)，3.84(3H，s，CH3O)，6.80-6.82(2H，m，苯基)，7.08-7.10(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝290.2[M+H]。
2-6.制备5-乙氧基-4-异丙基-2-(4-甲氧基苯乙基)恶唑11f
根据合成上述化合物11a-k的一般程序，通过化合物10f(3.0g，9.8mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(5.5g，20mmol)来制备。
产量2.4g(84％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 1.18-1.20(6H，m，2xCH3)，1.33(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.74-2.81(1H，m，CH)，2.84-2.89(2H，m，CH2)，2.93-2.98(2H，m，CH2)，3.78(3H，s，CH3O)，4.11(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，6.81(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.09(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝290.7[M+H]。
2-7.制备5-乙氧基-4-异丁基-2-(4-甲氧基苯乙基)恶唑11g
根据合成上述化合物11a-k的一般程序，通过化合物10g(3.0g，9.3mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(5.3g，19mmol)来制备。
产量2.7g(94％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.89(6H，d，J＝6.8Hz，2xCH3)，1.24(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.40-1.53(2H，m，CH2)，1.53-1.58(1H，m，CH)，2.44-2.57(2H，m，CH2)，2.89-2.96(2H，m，CH2)，3.78(3H，s，CH3O)，4.15(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，5.72-5.74(1H，m，NH)，6.82(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.12(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝303.8[M+H]。
2-8.制备4-苄基-5-乙氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)恶唑11h
根据合成上述化合物11a-k的一般程序，通过化合物10h(5.1g，14mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(8.2g，28mmol)来制备。
产量4.0g(82％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 1.29(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.86-2.98(2H，m，2xCH2)，3.73(2H，s，CH2)，3.79(3H，s，CH3O)，4.05(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，6.81(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.09(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.19-7.31(5H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝338.4[M+H]。
2-9.制备5-乙氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)-4-苯乙基恶唑11i
根据合成上述化合物11a-k的一般程序，通过化合物10i(2.5g，6.7mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(3.8g，13mmol)来制备。
产量2.3g(98％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 1.20(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)2.65(2H，m，CH2)，2.88-3.01(4H，m，2xCH2)，3.79(3H，s，CH3O)，3.82(2H，q，J＝7.2Hz，CH3)，6.85(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.13(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.15-7.19(3H，m，苯基)，7.24-7.28(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝352.4[M+H]。
2-10.制备5-乙氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)恶唑-4-羧酸乙酯11j
将碘(3.9g，15mmol)、三乙胺(4.3mL，31mmol)和含有化合物10j(2.6g，8.0mmol)的无水二氯甲烷溶液加入到含有三苯基膦(4.1g，15mmol)的无水二氯甲烷溶液中。将混合物在室温条件下搅拌一整夜，然后用水洗涤。利用无水Na2SO4对有机层进行干燥，并且在真空下进行浓缩，然后利用正己烷/乙酸乙酯＝3:1在硅胶上进行层析，从而获得作为粘性油的化合物11j。
产量1.6g(63％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.33(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.40(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.93-2.96(4H，m，2xCH2)，3.77(3H，s，CH3)，4.31(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，4.38(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，6.81(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.08(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝320.2[M+H]。
2-11.制备5-乙氧基-2-(4-甲氧基苯乙基)-4-(2-(甲硫基)乙基)恶唑11k
根据上述化合物11a-k的合成一般方法，通过化合物10k(4.7g，13mmol)和五氧化二磷(phosphorous pentoxide)(7.9g，28mmol)来制备。
产量2.7g(61％)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.32(3H，t，J＝6.0Hz，CH3)，2.01(3H，s，CH3)，2.91(2H，t，J＝5.4Hz，CH2)，3.04(2H，t，J＝5.4Hz，CH2)，3.91(3H，s，COOCH3)，4.06(2H，q，J＝6.0Hz，CH2)，7.27(2H，d，J＝8.1Hz，苯基)，7.95(2H，d，J＝8.1Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝322.5[M+H]。
实施例3.制备化合物12a-k的一般程序
将马来酸二甲酯(Dimethyl maleate)(2.0当量)添加至纯化合物11a-k(1.0当量)。将混合物回流5小时，并冷却至室温。随后，将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液进行稀释后通过二氯甲烷进行三次萃取。可利用无水Na2SO4对混合的有机萃取物进行干燥，并且在真空下进行浓缩，然后利用正己烷/乙酸乙酯＝7:1在硅胶上进行层析，从而获得作为粘性油的化合物12a-k。
3-1.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸二甲酯12a
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11a(0.84g，3.4mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(0.85g，6.8mmol)来制备。
产量0.35g(30％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 2.92(4H，s，2xCH2)，3.78(3H，s，CH3O)，3.89(3H，s，CH3O)，3.96(3H，s，CH3O)，6.81-6.83(2H，m，苯基)，7.09-7.11(2H，m，苯基)，8.53(1H，s，CH)；MS(ESI)：m/z＝346.3[M+H]。
3-2.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-methylpyridine-3,4-dicarboxylate)12b
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11b(1.5g，4.2mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(1.0g，8.4mmol)来制备。
产量0.56g(37％)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ3.02(3H，s，CH3)，3.04(2H，t，J＝4.8Hz，CH2)，3.32(2H，t，J＝4.8Hz，CH2)，3.79(3H，s，CH3O)，4.00(3H，s，CH3O)，4.08(3H，s，CH3O)，6.83(2H，d，J＝5.4Hz，苯基)，7.27(1H，d，J＝5.4Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝360.4[M+H]。
3-3.制备6-乙基-5-羟基-2-甲基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 6-ethyl-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)pyridine-3,4-dicarboxylate)12c
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11c(1.3g，4.3mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(1.1g，8.6mmol)来制备。
产量0.83g(52％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.27(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.86-2.97(6H，m，3xCH2)，3.77(3H，s，CH3O)，3.86(3H，s，CH3O)，3.93(3H，s，CH3O)，6.78-6.84(2H，m，苯基)，7.07-7.14(2H，m，苯基)，10.53(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝373.5[M+H]。
3-4.制备5-羟基-2-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-propylpyridine-3,4-dicarboxylate)12d
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11d(1.3g，4.3mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(1.1g，8.6mmol)来制备。
产量0.83g(52％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.27(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.86-2.97(6H，m，3xCH2)，3.77(3H，s，CH3O)，3.86(3H，s，CH3O)，3.93(3H，s，CH3O)，6.78-6.84(2H，m，苯基)，7.07-7.14(2H，m，苯基)，10.53(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝373.5[M+H]。
3-5.制备6丁基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-丙基吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 6-butyl-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)pyridine-3,4-dicarboxylate)12e
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11e(0.55g，1.9mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(0.48g，3.8mmol)来制备。
产量0.23g(30％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.98(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.69-1.78(2H，m，CH2)，2.25-2.36(2H，m，CH2)，2.85-2.93(6H，m，3xCH2)，3.78(3H，s，CH3O)，3.85(3H，s，CH3O)，3.93(3H，s，CH3O)，6.77-6.84(2H，m，苯基)，7.06-7.14(2H，m，苯基)，10.52(1H，s，CH)；MS(ESI)：m/z＝388.2[M+H]。
3-6.制备5-羟基-6-异丙基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 5-hydroxy-6-isopropyl-2-(4-methoxyphenethyl)pyridine-3,4-dicarboxylate)12f
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11f(2.0g，6.9mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(1.7g，14mmol)来制备。
产量0.56g(21％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 1.23-1.33(6H，m，2xCH3)，2.89-2.96(4H，m，CH2)，3.51-3.56(1H，m，CH)，3.77(3H，s，CH3O)，3.85(3H，s，CH3O)，3.92(3H，s，CH3O)，6.79(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.08(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，10.55(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝387.7[M+H]。
3-7.制备5-羟基-6-异丁基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 5-hydroxy-6-isobutyl-2-(4-methoxyphenethyl)pyridine-3,4-dicarboxylate)12g
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11g(2.0g，6.6mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(2.2g，13mmol)来制备。
产量0.86g(34％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.97(6H，d，J＝6.8Hz，2xCH3)，2.15-2.22(1H，m，CH)，2.77(2H，d，J＝7.2Hz，CH2)，2.92(4H，s，CH2)，3.77(3H，s，CH3O)，3.85(3H，s，CH3O)，3.93(3H，s，CH3O)，6.80(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.10(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，10.50(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝401.7[M+H]。
3-8.制备6-苄基-5-甲基-2-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 6-benzyl-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)pyridine-3,4-dicarboxylate)12h
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11h(3.9g，12mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(3.0g，24mmol)来制备。
产量1.4g(27％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 2.90-2.96(4H，m，2xCH2)，3.78(3H，s，CH3O)，3.85(3H，s，CH3O)，3.91(3H，s，CH3O)，4.24(2H，s，CH2)，6.80(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.09(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.18-7.34(4H，m，CH)，10.51(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝436.3[M+H]。
3-9.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-苯乙基吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-phenethylpyridine-3,4-dicarboxylate)12i
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11i(1.0g，2.9mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(0.71g，5.8mmol)来制备。
产量0.36g(28％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 2.91(4H，s，2xCH2)，3.03-3.07(2H，m，CH2)，3.21-3.25(2H，m，CH2)，3.79(3H，s，CH3O)，3.87(3H，s，CH3O)，3.95(3H，s，CH3O)，6.84(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.12(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.27-7.30(5H，m，CH)，10.56(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝450.2[M+H]。
3-10.制备2-乙基4,5-二甲基3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-2,4,5-三羧酸酯(2-Ethyl 4,5-dimethyl 3-hydroxy-6-(4-methoxyphenethyl)pyridine-2,4,5-tricarboxylate)12j
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11j(1.0g，3.1mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(0.78g，6.2mmol)来制备。
产量0.32g(24％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.26(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.50-2.59(2H，m，CH2)，3.16-3.23(2H，m，CH2)，3.77(3H，s，CH3O)，3.78(3H，s，CH3O)，3.81(3H，s，CH3O)，4.20-4.29(2H，m，CH2)，6.80-6.84(2H，m，苯基)，7.06-7.12(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝416.0[M-H]。
3-11.制备二甲基-羟基-2-[2-(2-(4-甲氧基苯基)乙基]-6-(2-甲基硫烷基乙基)吡啶-3,4-二羧酸酯(Dimethyl-hydroxy-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-6-(2-methylsulfanylethyl)pyridine-3,4-dicarboxylate)12k
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11k(1.0g，3.1mmol)和马来酸二甲酯(dimethyl maleate)(0.78g，6.2mmol)制备。
产量0.47g(36％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 2.18(3H，s，CH3S)，2.89-2.97(6H，m，3xCH2)，3.19-3.23(2H，m，CH2)，3.79(3H，s，CH3O)，3.87(3H，s，CH3O)，3.95(3H，s，CH3O)，6.82(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.10(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，10.57(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝420.3[M+H]。
3-12.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-(2-(甲基磺酰基)乙基)吡啶-3,4-二羧酸二甲酯(Dimethyl 5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-(2-(methylsulfonyl)ethyl)pyridine-3,4-dicarboxylate)12l
溶解有化合物12k(50mg，0.12mmol)的甲醇：在0℃下将溶解有
利用无水Na2SO4对混合的有机萃取物进行干燥，并在真空下进行浓缩，然后通过正乙烷/乙酸乙酯＝1：1在硅胶上进行层析，从而获得作为粘性油的化合物12a-k。
产量48mg(88％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 2.80-2.82(2H，m，CH2)，2.89-2.91(2H，m，CH2)，2.99(3H，s，CH3S)3.17-3.20(2H，m，CH2)，3.44-3.48(2H，m，CH2)，3.66(3H，s，CH3O)，3.72(3H，s，CH3O)，3.77(3H，s，CH3O)，6.85-6.88(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.02-7.0488(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝452.0[M+H]。
实施例4.制备化合物13a-l的一般程序
将溶解有化合物12a-l的20％KOH水溶液剧烈搅拌6小时。为了酸化将浓HCl溶液添加到混合物中。通过过量的水和氯仿来过滤沉淀的产物。然后，对产物进行干燥，从而获得白色固体化合物13a-l。
4-1.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸13a
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物12a(0.20g，0.63mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量为0.11g(52％)；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δppm 2.79-3.00(4H，m，2xCH2)，3.71(3H，s，CH3O)，6.82-6.85(2H，m，苯基)，7.09-7.12(2H，m苯基)，8.30(1H，s，CH)；MS(ESI)：m/z＝318.2[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C16H15NO6)：计算值(calcd.)为318.0972，实验值(found.)为318.0957；纯度98.1％。
4-2.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基吡啶-3,4-二羧酸13b
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物12b(0.20g，0.55mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量为0.12g(65％)；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.25(3H，s，CH3)，2.80-2.95(4H，m，2xCH2)，3.80(3H，s，CH3O)，6.91(2H，d，J＝8.7Hz)苯基)，7.21(2H，d，J＝8.7Hz，苯基)；13CNMR(DMSO-d 6，400MHz)19.07，35.48，37.68，55.43，114.12，120.40，128.32，129.68，135.06，142.99，144.39，157.83，166.88，171.98，175.15；MS(ESI)：m/z＝332.3[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C17H17NO6)：计算值为332.1129，实验值为332.1115；纯度98.1％。
4-3.制备6-乙基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸13c
根据合成上述化合物13a-1的一般方法，通过化合物12c(0.30g，0.80mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量97mg(35％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ1.14(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.43-2.92(6H，m，3xCH2)，3.67(3H，s，CH3O)，6.79-6.85(2H，m，苯基)，7.02-7.08(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝345.7[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C18H19NO6)：计算值为346.1285，实验值为346.1266；纯度97.1％。
4-4.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-丙基吡啶-3,4-二羧酸13d
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物12d(0.20g，0.52mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量0.10g(51％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ0.90(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.54-1.64(2H，m，CH2)，2.73-2.80(4H，m，2xCH2)，2.85-2.89(2H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3O)，6.78-6.85(2H，m，苯基)，7.02-7.08(2H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d6，400MHz)δ13.8，21.1，31.3，34.4，34.7，55.2，113.9，114.0，123.8，129.3，129.4，132.4，149.9，157.9，167.3，167.8；MS(ESI)：m/z＝359.8[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C19H21NO6)：计算得为360.1442，实验值为360.1421；纯度97.3％。
4-5.制备6-丁基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸13e
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物12e(0.24g，0.59mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量0.12g(57％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ0.84(3H，t，J＝7.2Hz，CH2)，1.24-1.30(2H，m，CH2)，1.51-1.55(2H，m，CH2)，2.45-2.47(2H，m，CH2)，2.76-2.82(2H，m，CH2)，2.85-2.90(2H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3O)，6.80-6.82(2H，m，苯基)，7.03-7.05(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝374.1[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C20H23NO6)：计算值为374.1598，实验值为374.1575；纯度97.4％。
4-6.制备5-羟基-6-异丙基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸13f
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物12f(0.30g，0.77mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量为0.14g(52％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 1.16-1.18(6H，m，2xCH3)，2.81-2.90(4H，m，CH2)，3.37-3.43(1H，m，CH)，3.67(3H，s，CH3O)，6.79(2H，d，J＝8Hz，苯基)，7.04(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)；13C NMR(DMSO-d 6，400MHz)δ22.3，27.8，34.1，34.6，37.8，55.1，114.0，124.0，129.4，132.2，149.1，157.9，167.2，167.7；MS(ESI)：m/z＝359.5[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C19H21NO6)：计算值为360.1442，实验值为360.1423；纯度96.1％。
4-7制备5-羟基-6-异丙基-2-(4-甲氧基苯乙基)-3,4二羧酸13g
根据合成上述化合物13a-l的一般程序，通过化合物12g(0.86g，2.2mmol)和20％KOH水溶液(5.0ml)来制备。
产量0.35g(43％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 0.82(6H，d，J＝6.8Hz，2xCH3)，1.99-2.02(1H，m，CH)，2.68(2H，m，CH2)，2.78-2.92(4H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3O)，6.82(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.04(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝374.5[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C20H23NO6)：计算值为374.1598，实验值为374.1572；纯度98.0％。
4-8.制备6-苄基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-3,4-二羧酸13h
根据上述化合物13a-1的合成一般方法，通过化合物12h(0.45g，1.0mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量0.39g(90％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 2.80-2.92(4H，m，2xCH2)，3.68(3H，s，CH3O)，4.13(2H，s，CH2)，6.78(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.04(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.15-7.26(5H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d 6，400MHz)δ34.7，35.5，36.7，55.4，114.3，126.9，128.9，129.1，129.7，133.0，138.1，149.4，158.1，168.1，168.4；MS(ESI)：m/z＝408.2[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C23H21NO6)：计算值为408.1442，实验值为408.1442；纯度98.6％。
4-9.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-苯乙基吡啶-3,4-二羧酸13i
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物12i(0.15g，0.33mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量88mg(63％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 2.72-2.76(2H，m，CH2)，2.84-2.92(4H，m，2xCH2)，3.06-3.10(2H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3O)，6.81(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.04(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.16-7.20(3H，m，苯基)，7.25-7.28(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝421.0[M-H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C24H23NO6)：计算值为422.1598，实验值为422.1572；纯度95.0％。
4-10.制备3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)吡啶-2,4,5-三羧酸13j
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物12j(0.20g，0.48mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量0.10g(55％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.66-2.70(2H，m，CH2)，3.05-3.09(2H，m，CH2)，3.65(3H，s，CH3)，6.78(2H，d，J＝7.6Hz，苯基)，7.06(2H，d，J＝8.0Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝362.1[M+H]。
4-11.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-(2-(甲硫基)乙基)吡啶-3,4-二羧酸13k
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物12k(0.47g，1.1mmol)和20％KOH水溶液(5.0mL)来制备。
产量0.22g(52％)1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 2.06(3H，s，CH3S)，2.76-2.90(6H，m，3xCH2)，3.04-3.08(2H，m，CH2)，3.68(3H，s，CH3O)，6.81(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)，7.05(2H，d，J＝8.4Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝392.4[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C19H21NO6S)：计算值为392.1162，实验值为392.1142；纯度95.4％。
4-12.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-(2-(甲基磺酰基)乙基)吡啶-3,4-二羧酸13l
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，该化合物有化合物12l(70mg，0.16mmol)和20％KOH水溶液(5.0ml)来制备。
产量32mg(47％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 2.80-2.83(2H，m，CH2)，2.85-2.87(2H，m，CH2)，3.00(3H，s，CH3S)，3.16-3.20(2H，m，CH2)，3.43-3.47(2H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3O)，6.80-6.82(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)，7.06-7.08(2H，d，J＝8.8Hz，苯基)；13CNMR(DMSO-d6，400MHz)δ24.0，34.5，36.2，40.4，51.1，55.1，113.9，122.0，128.3，129.3，129.4，133.3，147.3，157.7，168.3，168.6；MS(ESI)：m/z＝423.8[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C19H21NO8S)：计算值为424.1061，实验值为424.1038；纯度96.8％。
实施例5.制备4-氰基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基烟酸乙酯(Ethyl4-cyano-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-methylnicotinate)14
根据合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物11b(0.49g，1.9mmol)和顺式-β-氰基丙烯酸乙酯(0.23mL，1.9mmol)来制备。
产量0.18g(27％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.38(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.58(3H，s，CH3)，2.88-2.95(2H，m，CH2)，3.17-3.21(2H，m，CH2)，3.77(3H，s，CH3)，4.38-4.34(2H，m，CH2)，6.79-6.81(2H，m，苯基)，7.08-7.11(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝341.5[M+H]。
实施例6.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基-4-(1H-四唑-5-基)烟酸乙酯(Ethyl 5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-methyl-4-(1H-tetrazol-5-yl)nicotinate)15
将化合物14(0.18g，0.52mmol)、叠氮化钠(33mg，0.52mmol)和氯化铵(28mg，0.52mmol)溶解于DMF(10ml)的混合物加入到圆底烧瓶中，并在90℃下搅拌过夜。反应完成后，对反应混合物进行冷却。添加1N HCl水溶液(17mL)，从而诱导沉淀物的形成。通过过滤获得沉淀的产物。并且将所获得的沉淀物通过水或氯仿进行洗涤，然后将产物进行干燥，从而获得白色固体化合物15。
产量95mg(48％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.96(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，2.52(3H，s，CH3)，2.80-2.85(2H，m，CH2)，2.88-2.96(2H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3)，4.05-4.12(2H，m，CH2)，6.80-6.82(2H，m，苯基)，7.05-7.08(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝384.3[M+H]。
实施例7.制备4-氰基-5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基烟酸16
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物14(0.10g，0.30mmol)和20％KOH水溶液(3.0mL)来制备。
产量30mg(30％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.44(3H，s，CH3)，2.83-2.87(2H，m，CH2)，3.03-3.07(2H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3)，6.78-6.82(2H，m，苯基)，7.04-7.10(2H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d6，400MHz)δ17.4，35.1，37.8，55.2，113.8，113.9，114.0，122.6，129.3，129.4，133.3，146.9，157.7，169.1；MS(ESI)：m/z＝311.3[M-H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C17H16N2O4)：计算值为313.1183，实验值为313.1167；纯度97.6％。
实施例8.制备5-羟基-2-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基-4-(1H-四唑-5-基)烟酸17
根据合成上述化合物13a-1的一般程序，通过化合物15(0.10g，0.30mmol)和20％KOH水溶液(3.0mL)来制备。
产量31mg(30％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.51(3H，s，CH3)，2.81-2.86(2H，m，CH2)，2.92-2.97(2H，m，CH2)，3.68(3H，s，CH3)，6.80-6.84(2H，m，苯基)，7.08-7.11(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝354.4[M-H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C17H17N5O4)：计算值为356.1353，实验值为356.1335；纯度98.7％。
实施例9.制备7-羟基-4-(4-甲氧基苯乙基)-6-甲基呋喃[3,4-c]吡啶-1,3-二酮18
将化合物11b(0.50g，1.9mmol)和马来酸酐(0.19g，1.9mmol)溶解于苯(6mL)中的混合物在60℃下加热2小时。反应完成后，对反应混合物进行冷却。通过过滤获得沉淀的产物，并通过过量的二***进行洗涤。然后将产物进行干燥，从而获得化合物18。
产量0.32g(54％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.52(3H，s，CH3)，2.82-2.86(2H，m，CH2)，3.16-3.20(2H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3)，6.79-6.81(2H，m，苯基)，7.09-7.11(2H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d 6，400MHz)δ16.6，34.8，35.3，55.5，114.2，114.4，123.9，129.6，132.9，147.3，158.2，167.5，168.1；MS(ESI)：m/z＝314.3[M+H]。
实施例10.制备8-羟基-5-(4-甲氧基苯乙基)-7-甲基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4-二酮19
将溶解有化合物18(0.29g，0.92mmol)的乙酸(300μL)滴加到水合肼(36μL，1.2mmol)溶解于水(400μL)的溶液中。向其中添加无水乙酸钠(0.098g，1.2mmol)，并将反应混合物加热回流2小时。反应完成后，对反应混合物进行冷却。将所生成的混合物通过乙酸乙酯进行稀释，并通过水及盐水进行洗涤。合并的有机层通过无水Na2SO4进行干燥，并在真空下进行浓缩之后，利用氯仿/甲醇＝10:1在硅胶上进行层析，从而获得化合物19。
产量0.14g(46％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.47(3H，s，CH3)，2.79-2.83(2H，m，CH2)，3.51-3.55(2H，m，CH2)，3.73(3H，s，CH3)，6.77-6.79(2H，m，苯基)，7.18-7.20(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝328.1[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C17H17N3O4)：计算值为328.1292，实验值为328.1277；纯度95.1％。
实施例11，制备6-(4-甲氧基苯乙基)-2-甲基-4-(甲基磺酰基)吡啶-3-醇20
根据合成化合物12a-k的一般程序，通过化合物11b(0.50g，1.9mmol)和甲基乙烯基砜(0.41mL，3.8mmol)来合成。
产量0.30g(49％)；1H NMR(CD3OD，400MHz)δ2.49(3H，s，CH3)，2.88(2H，m，CH2)，2.98(2H，m，CH2)，3.22(3H，s，SCH3)，3.72(3H，s，OCH3)，6.76-6.81(2H，m，苯基)，7.02-7.06(2H，m，苯基)，7.31(1H，s，苯基)；MS(ESI)：m/z＝322.2[M+H]；[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C16H19NO4S)：计算值为322.1108，实验值为322.1100；纯度96.8％。
实施例12.制备3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-2-甲基异烟酸甲酯(Methyl 3-hydroxy-6-(4-methoxyphenethyl)-2-methylisonicotinate)21a
根据合成化合物12a-k的一般程序，通过化合物11b(1.0g，3.8mmol)和丙烯酸甲酯(0.68mL，7.6mmol)来合成。
产量0.43g(37％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.54(3H，s，CH3)，2.91-3.01(4H，m，2xCH2)，3.77(3H，s，CH3O)，3.95(3H，s，CH3O)，6.79-6.84(2H，m，苯基)，7.09-7.14(2H，m，苯基)，7.24(1H，s，苯基)，10.43(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝302.1[M+H]。
实施例13.制备3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-2,5-二甲基异烟酸甲酯(Methyl 3-hydroxy-6-(4-methoxyphenethyl)-2,5-dimethylisonicotinate)21b
根据合成化合物12a-k的一般程序，通过化合物11b(1.2g，4.4mmol)和巴豆酸甲酯(0.93mL，8.8mmol)来合成。
产量0.49g(35％)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ2.36(3H，s，CH3)，2.51(3H，s，CH3)，2.84-2.92(2H，m，CH2)，3.00-3.08(2H，m，CH2)，3.79(3H，s，CH3O)，3.99(3H，s，CH3O)，6.80-6.85(2H，m，苯基)，7.10-7.16(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝316.2[M+H]。
实施例14.制备3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-5-甲基-2-丙基异烟酸甲酯(Methyl3-hydroxy-6-(4-methoxyphenethyl)-5-methyl-2-propylisonicotinate)21c
根据合成化合物12a-k的一般程序，由化合物11b(1.6g，5.5mmol)和巴豆酸甲酯(1.2mL，11mmol)合成该化合物。
产量0.64g(34％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.98(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.68-1.76(2H，m，CH2)，2.33(3H，s，CH3)，2.78-2.85(2H，m，CH2)，2.85-2.93(2H，m，CH2)，3.00-3.07(2H，m，CH2)，3.77(3H，s，CH3O)，3.97(3H，s，CH3O)，6.79-6.82(2H，m，苯基)，7.08-7.12(2H，m，苯基)，10.21(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝344.0[M+H]。
实施例15.制备3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-2-甲基异烟酸22a
将化合物21a(0.19mg，0.63mmol)溶解在20％KOH水溶液(3.0mL)中的溶液剧烈搅拌6小时。为了酸化将浓HCl溶液加入到混合物中，并将混合物在真空下进行浓缩。通过过滤除去KCl盐。然后，将滤液在真空下进行浓缩，并利用氯仿/甲醇＝20:1将残余物在硅胶上进行层析，从而获得化合物22a。
产量87mg(48％)；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)2.51(3H，s，CH3)，2.74-2.82(2H，m，CH2)，3.15-3.20(2H，m，CH2)，3.71(3H，s，CH3O)，6.80-6.86(2H，m，苯基)，7.11-7.16(2H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d6，400MHz)δ14.9，34.4，55.1，114.0，122.9，129.5，132.2，144.6，157.8，167.9；MS(ESI)：m/z＝288.2[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C16H17NO4)：计算值为288.1230，实验值为288.1213；纯度97.3％。
实施例16.制备3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-2,5-二甲基异烟酸22b
根据合成化合物22a的程序，通过化合物21b(65mg，0.21mmol)和20％KOH水溶液(3.0mL)来合成。
产量27mg(43％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.41(3H，s，CH3)，2.43(3H，s，CH3)，2.71-2.78(2H，m，CH2)，2.93-3.01(2H，m，CH2)，3.68(3H，s，CH3O)，6.80-6.85(2H，m，苯基)，7.06-7.12(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝302.1[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C17H19NO4)：计算值为302.1387，实验值为302.1370；纯度95.2％。
实施例17.制备3-羟基-6-(4-甲氧基苯乙基)-5-甲基-2-丙基异烟酸22c
根据合成化合物22a的程序，通过化合物21c(0.12g，0.35mmol)和20％KOH水溶液(3.0mL)来合成。
产量54mg(47％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ0.85(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.51-1.61(2H，m，CH2)，2.46(3H，s，CH3)，2.62-2.70(2H，m，CH2)，2.72-2.79(2H，m，CH2)，2.87-2.97(2H，m，CH2)，3.00-3.07(2H，m，CH2)，3.67(3H，s，CH3O)，6.76-6.81(2H，m，苯基)，7.03-7.08(2H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d 6，400MHz)δ14.1，15.8，21.3，33.0，34.2，36.2，55.1，113.8，125.9，129.5，129.6，133.8，145.0，146.0，157.6，172.4；MS(ESI)：m/z＝329.9[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C19H23NO4)：计算值为330.1700，实验值为330.1681；纯度96.9％。
实施例18.制备5-羟基-2-[2-(2-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基-6-丙基-吡啶-4-羧酰胺23
将化合物21c(50mg，0.15mmol)溶于30％氨水(3.0mL)。将反应混合物搅拌12小时。反应完成后，利用乙酸乙酯稀释所生成的混合物，并利用水和盐水进行洗涤。利用无水Na2SO4对合并的有机层进行干燥，并在真空下进行浓缩，然后利用氯仿/甲醇＝20:1在硅胶上进行层析，从而获得化合物23。
产量16mg(32％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ0.88(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.54-1.63(2H，m，CH2)，2.07(3H，s，CH3)，2.60-266(2H，m，CH2)，2.77-2.82(4H，m，2xCH2)，3.67(3H，s，CH3O)，6.77-6.82(2H，m，苯基)，7.09-7.13(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝328.9[M+H]。
实施例19.制备2-(2-(3-苯氧基苯基)乙酰氨基)戊酸乙酯24
根据合成化合物10a-k的一般程序，通过3-苯氧基苯基乙酸(3.8g，17mmol)和L-正缬氨酸乙酯(3.1g，17mmol)制备。
产量5.2g(86％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.87(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.16-1.28(2H，m，CH2)，1.24(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.52-1.62(2H，m，CH2)，1.71-1.82(2H，m，CH2)，3.54(3H，t，CH3)，4.11-4.20(2H，m，CH2)，4.52-4.60(2H，m，CH2)，5.88-5.95(1H，m，NH)，6.89-6.95(2H，m，苯基)，6.98-7.03(3H，m，苯基)，7.07-7.13(1H，m，苯基)，7.28-7.36(3H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝355.9[M+H]。
实施例20.制备5-乙氧基-2-(3-苯氧基苄基)-4-丙基恶唑25
根据合成化合物11a-k的一般程序，通过化合物24(4.7g，13mmol)和五氧化二磷(7.5g，26mmol)来合成。
产量4.8g(97％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.91(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.24(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.55-1.63(2H，m，CH2)，2.31-2.35(2H，m，CH2)，3.91(2H，s，CH2)，4.01-4.10(2H，m，CH2)，6.90-6.94(1H，m，苯基)，6.90-6.94(1H，m，苯基)，6.96-7.02(3H，m，苯基)，7.06-7.13(1H，m，苯基)，7.22-7.29(1H，m，苯基)，7.29-7.35(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝337.9[M+H]。
实施例21.制备5-羟基-2-(3-苯氧基苄基)-6-丙基吡啶-3,4-二羧酸二甲酯26
根据合成化合物12a-k的一般程序，通过化合物25(2.1g，6.2mmol)和马来酸二甲酯(2.3mL，18mmol)来合成。
产量1.0g(37％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.94(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.64-1.75(2H，m，CH2)，2.81-2.87(2H，m，CH2)，3.78(3H，s，CH3O)，3.92(3H，s，CH3O)，4.02(2H，s，CH2)，6.78-6.83(2H，m，苯基)，6.88-6.91(1H，m，苯基)，6.94-6.99(2H，m，苯基)，7.05-7.10(1H，m，苯基)，7.17-7.22(1H，m，苯基)，7.27-7.33(2H，m，苯基)，10.33(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝436.8[M+H]。
实施例22.制备5-羟基-2-(3-苯氧基苄基)-6-丙基吡啶-3,4-二羧酸27
根据合成化合物13a-1的一般程序，通过化合物26(93mg，0.21mmol)和20％KOH水溶液(20ml)来合成。
产量33mg(38％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 0.86(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.55-1.65(2H，m，CH2)，2.71-2.78(2H，m，CH2)，4.03(2H，s，CH2)，6.78-6.82(1H，m，苯基)，6.87-6.89(1H，m，苯基)，6.94-6.98(3H，m，苯基)，7.10-7.15(1H，m，苯基)，7.23-7.29(1H，m，苯基)，7.33-7.39(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝407.8[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C23H21NO6)：计算值为408.1442，实验值为408.1423；纯度99.0％。
实施例23.制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸甲酯28
根据合成化合物12a-k的一般程序，通过化合物25(3.6g，11mmol)和巴豆酸甲酯(2.2mL，22mmol)来合成。
产量0.92g(22％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.96(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.64-1.75(2H，m，CH2)，2.32(3H，s，CH3)，2.77-2.84(2H，m，CH2)，3.95(3H，s，CH3O)，4.16(2H，s，CH2)，6.76-6.80(2H，m，苯基)，6.84-6.87(1H，m，苯基)，6.93-6.97(2H，m，苯基)，7.04-7.09(1H，m，苯基)，7.15-7.20(1H，m，苯基)，7.26-7.32(2H，m，苯基)，10.32(1H，s，OH)；13C NMR(DMSO-d6，400MHz)δ14.2，15.5，21.6，33.6，52.8，116.6，118.7，119.1，123.9，125.9，130.4，131.3，142.1，145.8，148.0，148.8，156.9，157.2，167.6；MS(ESI)：m/z＝392.0[M+H]。
实施例24.制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸29
根据合成化合物22a的一般程序，通过化合物28(0.67g，1.7mmol)和20％KOH水溶液(10mL)来合成。
产量0.31g(48％)；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δppm 0.84(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.50-1.65(2H，m，CH2)，2.29(3H，s，CH3)，2.68-2.82(2H，m，CH2)，4.12(2H，s，CH2)，6.77-6.82(2H，m，苯基)，6.84-6.87(1H，m，苯基)，6.91-6.96(2H，m，苯基)，7.06-7.12(1H，m，苯基)，7.23-7.28(1H，m，苯基)，7.30-7.36(2H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d 6，400MHz)δ14.1，16.0，21.5，31.4，117.0，118.5，119.2，123.6，124.1，130.4，130.5，130.7，156.8，157.4，168.7；MS(ESI)：m/z＝377.9[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C23H23NO4)：计算值为378.1700，实验值为378.1674；纯度95.6％。
实施例25.制备3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸甲酯30
在K2CO3(2.1g，15.3mmol)存在的情况下，将溴化苄(0.73mL，6.1mmol)添加至溶解有化合物28(2.0g，5.1mmol)的干丙酮(dry acetone)(15ml)溶液中，并将反应混合物进行回流2小时。反应完成后，对反应混合物进行冷却，并以NH4Cl进行中和，然后用二氯甲烷进行两次萃取。对合并的有机层用无水Na2SO4进行干燥，并在真空下进行浓缩，随后利用正己烷/乙酸乙酯＝5:1在硅胶上进行层析，从而获得化合物30。
产量1.8g(73％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.93(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.65-1.77(2H，m，CH2)，2.12(3H，s，CH3)，2.73-2.80(2H，m，CH2)，3.82(3H，s，CH3)，4.13(2H，s，CH2)，4.89(2H，s，CH2)，6.78-6.86(2H，m，苯基)，6.89-6.93(1H，m，苯基)，6.94-7.00(2H，m，苯基)，7.05-7.10(1H，m，苯基)，7.17-7.24(1H，m，苯基)，7.27-7.38(3H，m，苯基)，7.38-7.39(2H，m，苯基)，7.39-7.41(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝482.2[M+H]。
实施例26.制备(3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)甲醇31
在0℃下，在溶解有化合物30(0.50g，1.0mmol)的二***的溶液中滴加溶解有LiAlH4(0.23g，6.2mmol)的干二***(dry diethyl ether)(5mL)的混悬液0.5小时。添加完成后，将反应混合物在N2气氛下于0℃中进行搅拌1小时。通过饱和NH4Cl水溶液淬灭未反应的LiAlH4，并利用二氯甲烷对反应混合物进行三次萃取。利用Na2SO4对合并的有机萃取物进行干燥，并将混合物通过硅藻土垫(celite pad)进行过滤。将所过滤的混合物在真空下进行浓缩，并利用正己烷/乙酸乙酯＝2:1在硅胶上进行层析，从而获得化合物31。
产量0.35g(75％)；1H NMR(CD3OD，400MHz)δppm 0.88(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.54-1.65(2H，m，CH2)，2.12(3H，s，CH3)，2.67-2.75(2H，m，CH2)，4.15(2H，s，CH2)，4.68(2H，s，CH2)，4.90(2H，s，CH2)，6.67-6.70(1H，m，苯基)，6.75-6.78(1H，m，苯基)，6.87-6.92(3H，m，苯基)，7.02-7.08(1H，m，苯基)，7.19-7.24(1H，m，苯基)，7.26-7.41(5H，m，苯基)，7.43-7.47(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝454.9[M+H]。
实施例27.制备4-(羟甲基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-3-醇32
将10％Pd/C(15mg)加入到溶解有化合物31(0.10g，0.22mmol)的甲醇溶液中。将反应混合物在H2气氛下搅拌0.5小时。反应完成后，将混合物通过硅藻土垫进行过滤，并将滤液在真空下进行浓缩，并利用氯仿/甲醇＝20:1在硅胶上进行层析，从而获得化合物32。
产量50mg(62％)；1H NMR(CD3OD，400MHz)δppm 0.91(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.52-1.66(2H，m，CH2)，2.05(3H，s，CH3)，2.62-2.76(2H，m，CH2)，3.20-3.25(2H，m，CH2)，4.08(2H，s，CH2)，4.81(3H，s，CH3)，6.62-6.66(1H，m，苯基)，6.73-6.77(1H，m，苯基)，6.81-6.91(3H，m，苯基)，7.02-7.08(1H，m，苯基)，7.16-7.22(1H，m，苯基)，7.25-7.32(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝364.1[M+H]。
实施例28.制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟醛33
将化合物32(50mg，0.14mmol)溶解在干二氯甲烷(dry dichloromethane)中，并将活化的二氧化锰(85mg，0.98mmol)添加到溶液中。将反应混合物在N2气氛下于0℃中剧烈搅拌2小时。反应完成后，将混合物通过硅藻土垫进行过滤。将滤液在真空下进行浓缩，并利用正己烷/乙酸乙酯＝3:1在硅胶上进行层析。
产量43mg(85％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.96(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.64-1.75(2H，m，CH2)，2.45(3H，s，CH3)，2.77-2.86(2H，m，CH2)，4.16(2H，s，CH2)，6.77-6.82(2H，m，苯基)，6.85-6.91(1H，m，苯基)，6.92-6.95(1H，m，苯基)，6.95-6.98(1H，m，苯基)，7.04-7.10(1H，m，苯基)，7.15-7.23(1H，m，苯基)，7.26-7.34(2H，m，苯基)，10.42(1H，s，CHO)；MS(ESI)：m/z＝361.7[M+H]。
实施例29.制备(E)-3-(3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)丙烯酸乙酯34
将膦酰基乙酸三乙酯(triethyl phosphonoacetate)(24μL，0.12mmol)滴加到溶解有NaH(60％油悬浮液，5.0mg，0.48mmol)的无水THF的悬浮液中。将该悬浮液搅拌5分钟后，向其中加入溶解有化合物33(40mg，0.11mmol)的无水THF溶液。将反应混合物搅拌1小时。反应完成后，利用二氯甲烷对所生成的混合物进行稀释，并利用水和盐水进行洗涤。利用无水Na2SO4对有机层进行干燥，并在真空下进行浓缩，然后利用正己烷/乙酸乙酯＝3:1在硅胶上进行层析。
产量33mg(70％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.93(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.30(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.69(2H，q，J＝7.6Hz，CH2)，2.13(3H，s，CH3)，2.71-2.79(2H，m，CH2)，4.11(2H，s，CH2)，4.27(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，6.38(1H，d，J＝16.4Hz，＝CH)，6.75-6.80(2H，m，苯基)，6.80-6.82(1H，m，苯基)，6.92-6.98(2H，m，苯基)，7.02-7.09(1H，m，苯基)，7.14-7.21(1H，m，苯基)，7.26-7.33(2H，m，苯基)，7.64(1H，d，J＝16.4Hz，＝CH)；MS(ESI)：m/z＝432.0[M+H]。
实施例30.制备(E)-3-(3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)丙烯酸35
根据合成化合物22a的一般程序，通过化合物34(35mg，0.081mmol)和20％KOH水溶液(7mL)来合成。
产量12mg(37％)；1H NMR(CD3OD，400MHz)δppm 0.90(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.56(2H，q，J＝7.6Hz，CH2)，2.11(3H，s，CH3)，2.70-2.77(2H，m，CH2)，4.09(2H，s，CH2)，6.61-6.78(3H，m，苯基&＝CH)，6.86-6.92(3H，m，苯基)，7.04-7.08(1H，m，苯基)，7.14-7.24(1H，m，苯基)，7.26-7.31(2H，m，苯基)，7.56(1H，d，J＝16.4Hz，＝CH)；MS(ESI)：m/z＝403.6[M+H]。
实施例31.制备3-(3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)丙酸乙酯36
根据合成化合物32的一般程序，通过化合物34(0.10g，0.23mmol)和10％Pd/C(15mg)来合成。
产量59mg(59％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.96(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.23(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.61-1.72(2H，m，CH2)，2.06(3H，s，CH3)，2.62-2.70(2H，m，CH2)，2.73-2.82(2H，m，CH2)，2.86-2.92(2H，m，CH2)，4.09(2H，s，CH2)，4.14(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，6.74-6.84(2H，m，苯基)，6.92-6.97(2H，m，苯基)，7.03-7.09(1H，m，苯基)，7.14-7.20(1H，m，苯基)，7.26-7.28(1H，m，苯基)，7.28-7.32(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝434.0[M+H]。
实施例32.制备3-(3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)丙酸37
根据合成化合物22a的一般程序，通过化合物36(59mg，0.14mmol)和20％KOH水溶液(7mL)来合成。
产量52mg(94％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.93(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.59-1.70(2H，m，CH2)，2.17(3H，s，CH3)，2.51-2.59(2H，m，CH2)，2.80-2.90(2H，m，CH2)，2.96-3.06(2H，m，CH2)，4.21(2H，s，CH2)，6.55-6.60(1H，m，苯基)，6.79-6.84(2H，m，苯基)，6.88-6.93(2H，m，苯基)，7.06-7.12(1H，m，苯基)，7.23-7.34(3H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d6，400MHz)δ14.3，14.5，21.9，22.2，33.0，33.7，116.5，118.7，119.1，123.9，130.3，130.5，142.6，146.1，156.9，157.1，174.7；MS(ESI)：m/z＝406.1[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C25H27NO4)：计算值为406.2013，实验值为406.1990；纯度97.8％。
实施例33.制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟腈38
根据合成化合物12a-k的一般程序，通过化合物25(0.50g，1.5mmol)和甲基巴豆腈(0.24mL，3.0mmol)来合成。
产量0.36g(67％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.91(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.64-1.74(2H，m，CH2)，2.34(3H，s，CH3)，2.74-2.81(2H，m，CH2)，4.09(2H，m，CH2)，6.78-6.82(2H，m，苯基)，6.85-6.88(1H，m，苯基)，6.93-6.98(2H，m，苯基)，7.06-7.12(1H，m，苯基)，7.17-7.22(1H，m，苯基)，7.27-7.33(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝359.1[M+H]。
实施例34.制备3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟腈39
根据合成化合物30的一般程序，通过化合物38(0.20g，0.56mmol)和溴化苄(80μL，0.67mmol)来合成。
产量.025g(99％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.90(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.60-1.70(2H，m，CH2)，2.39(3H，s，CH3)，2.69-2.77(2H，m，CH2)，4.14(2H，s，CH2)，5.08(2H，s，CH2)，6.79-6.85(2H，m，苯基)，6.89-6.90(1H，m，苯基)，6.94-6.99(2H，m，苯基)，7.06-7.11(1H，m，苯基)，7.18-7.24(1H，m，苯基)，7.28-7.34(2H，m，苯基)，7.36-7.44(3H，m，苯基)，7.46-7.51(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝449.1[M+H]。
实施例35.制备(3-(环己-2,4-二烯-1-基甲氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)甲胺40
根据合成化合物31的一般程序，通过化合物39(51mg，0.11mmol)和LiAlH4(0.23g，6.2mmol)来合成。
产量33mg(66％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.94(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.68-1.79(2H，m，CH2)，2.19(3H，s，CH3)，2.74-2.82(2H，m，CH2)，3.83(2H，s，CH2)，4.14(2H，s，CH2)，4.86(2H，s，CH2)，6.78-6.84(2H，m，苯基)，6.90-6.98(3H，m，苯基)，7.04-7.09(1H，m，苯基)，7.16-7.22(1H，m，苯基)，7.26-7.33(2H，m，苯基)，7.35-7.47(5H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝455.2[M+H]。
实施例36.制备4-(氨基甲基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-3-醇41
根据合成化合物32的一般程序，通过化合物40(0.12g，0.26mmol)和10％Pd/C(15mg)来合成。
产量67mg(71％)；1H NMR(CD3OD，400MHz)δppm 0.91(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)，1.54-1.65(2H，m，CH2)，2.03(3H，s，CH3)，2.64-2.75(2H，m，CH2)，4.03-4.09(4H，m，2xCH2)，6.62-6.66(2H，m，苯基)，6.74-6.77(1H，m，苯基)，6.82-6.90(2H，m，苯基)，7.04-7.08(1H，m，苯基)，7.16-7.21(1H，m，苯基)，7.30-7.36(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝363.06[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C23H26N2O2)：计算值为363.2067，实验值为363.2043；纯度96.6％。
实施例37.制备N-((3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)甲基)甲磺酰胺42
将包含化合物40(33mg，0.073mmol)和三乙胺(12μL，0.087mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液冷却至0℃，并向其中滴加甲烷磺酰氯(7μL，0.087mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后，将混合物利用乙酸乙酯进行稀释并通过盐水进行洗涤。利用无水Na2SO4对有机层进行干燥，并在真空下进行浓缩，然后利用氯仿/甲醇＝20:1在硅胶上进行层析，从而得到化合物42。
产量26mg(67％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.95(3H，t，J＝7.3Hz，CH3)，1.70-1.80(2H，m，CH2)，2.19(3H，s，CH3)，2.62(3H，s，CH3)，2.79-2.85(2H，m，CH2)，4.13-4.17(4H，m，2xCH2)，4.86-4.90(2H，m，CH2)，6.75-6.83(2H，m，苯基)，6.88-6.92(1H，m，苯基)，6.93-6.98(2H，m，苯基)，7.05-7.10(1H，m，苯基)，7.17-7.23(1H，m，苯基)，7.27-7.33(2H，m，苯基)，7.37-7.44(3H，m，苯基)，7.37-7.44(2H，m，苯基)；MS(ESI)：m/z＝531.1[M+H]。
实施例38.制备N-((3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基吡啶-4-基)甲基)甲磺酰胺43
根据合成化合物32的一般程序，通过化合物42(21mg，0.040mmol)和10％Pd/C(5.0mg)来合成。
产量11mg(62％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.96(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.63-1.74(2H，m，CH2)，2.19(3H，s，CH3)，2.72-2.77(2H，m，CH2)，2.82(3H，s，CH3)，4.12(2H，s，CH2)，4.33(2H，s，CH2)，6.74-6.81(2H，m，苯基)，6.85-6.88(1H，m，苯基)，6.92-6.96(2H，m，苯基)，7.04-7.10(1H，m，苯基)，7.16-7.21(1H，m，苯基)，7.26-7.32(2H，m，苯基)；13C NMR(DMSO-d6，400MHz)δ14.4，14.6，21.8，34.2，38.3，41.4，116.4，118.9，119.1，123.9，124.0，129.2，130.2，130.5，131.7，142.9，147.0，148.0，157.0，157.1；MS(ESI)：m/z＝441.0[M+H]；HRMS(ESI)[M+H]+(C24H28N2O4S)：计算值为441.1843，实验值为441.1818；纯度98.3％。
实施例39.制备3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸44
将20％的KOH水溶液加入到溶解有化合物30(120.8mg，0.25mmol)的1,4-二氧六环(1ml)和甲醇(1ml)溶液中。将反应混合物在50℃下剧烈搅拌两天。然后冷却至室温后，将反应混合物利用盐水稀释并通过EA进行3次萃取。利用无水Na2SO4对有机层进行干燥。将混合物进行过滤并在真空下进行浓缩，然后利用氯仿:甲醇＝10:1作为洗脱液在硅胶上进行层析，从而获得化合物44(74.4mg)。
产量63％；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ0.82(3H，t，J＝7.3Hz，CH3)，1.50-1.59(2H，m，J＝7.0Hz，7.3Hz，7.9Hz，CH2)，2.07(3H，s，CH3)，2.57(2H，t，J＝7.3Hz，7.9Hz，CH2)，4.00(2H，s，CH2)，4.99(2H，s，CH2)，6.80(2H，s，CH2)，6.80(2H，d，J＝7.9Hz，苯基)，6.85(1H，s，苯基)，6.98(2H，d，J＝7.9Hz，苯基)，7.12(1H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，苯基)，7.25-7.33(2H，m，J＝7.6Hz，苯基)，7.37(4H，t，J＝7.3Hz，苯基)，7.44(2H，d，J＝7.6Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝468.1[M+H]。
实施例40.制备化合物45a-j的一般程序
将NaHCO3(3.0当量)添加至溶解有化合物44(1.0当量)的20％DMF溶液中，并在室温下搅拌30分钟。将各种卤代烃(alkyl halides)(3.0当量)加入反应混合物中，并在50℃下搅拌过夜。并且冷却至室温后，利用盐水对反应混合物进行稀释并通过DCM进行3次萃取。利用无水Na2SO4对有机层进行干燥。过滤后，将混合物在真空下进行浓缩，然后利用正己烷:EA＝5:1作为洗脱液，通过硅胶柱层析进行纯化，从而获得化合物45a-j。
40-1.制备3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸苯乙酯(Phenethyl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45a
根据合成化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(20.3mg，0.043mmol，1.0当量)与(2-溴乙基)苯(24.1mg，0.130mmol，3.0当量)之间的反应获得化合物45a(19.1mg)。
产量77％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.94(3H，t，J＝7.3Hz，CH3)，1.69-1.75(2H，m，J＝7.6Hz，CH2)，2.00(3H，s，CH3)，2.77(2H，t，J＝7.6Hz，7.9Hz，CH2)，2.94(2H，t，J＝7.0Hz，7.3Hz，CH2)，4.12(2H，s，CH2)，4.64(2H，t，J＝7.0Hz，7.3Hz，CH2)，4.88(2H，s，CH2)，6.83(1H，d，J＝7.9Hz，苯基)，6.86(1H，s，苯基)，6.91(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.98(2H，d，J＝7.9Hz，苯基)，7.08(1H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，苯基)，7.16-7.25(5H，br，苯基)，7.27-7.41(8H，br，苯基)；MS(MALDI-TOF)：m/z＝571.5[M+H]。
40-2.制备3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸辛酯(Octyl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45b
根据合成化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)和1-溴辛烷(37.2mg，0.192mmol，3.0当量)之间的反应获得化合物45b(32.7mg)。
产量88％；1HNMR(CDCl3,400MHz)δ0.85(3H，t，J＝7.0Hz,CH3)，0.93(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.21-1.31(10H，br，CH2)，1.59-1.73(4H，m，J＝6.7Hz，7.6Hz，7.9Hz，CH2)，2.12(3H，s，CH3)，2.76(2H，t，J＝7.6Hz，7.9Hz，CH2)，4.13(2H，s，CH2)，4.24(2H，t，-J＝6.7Hz，CH2)，4.90(2H，s，CH2)，6.81(1H，d，J＝8.0Hz，苯基)，6.86(1H，s，苯基)，6.91(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.97(2H，d，J＝7.3Hz，7.6Hz，苯基)，7.07(1H，t，J＝7.6Hz，苯基)，7.20(1H，d，J＝7.9Hz，苯基)，7.28-7.42(7H，br，苯基)；MS(MALDI-TOF):m/z＝579.5[M+H]。
40-3.制备2-邻苯二甲亚氨基乙基3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(2-phthalimidoethyl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45c
根据合成化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)和N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺(48.8mg，0.192mmol，3.0当量)之间的反应获得化合物45c(26.0mg)。
产量＝63％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.91(3H，t，J＝7.3Hz，CH3)，1.65-1.71(2H，m，J＝7.6Hz，CH2)，2.09(3H，s，CH3)，2.72(2H，t，J＝7.6Hz，7.9Hz，CH2)，4.00(2H，t，J＝5.5Hz，CH2)，4.11(2H，s，CH2)，4.49(2H，t，J＝5.5Hz，5.8Hz，CH2)，4.85(2H，s，CH2)，6.82(1H，d，J＝8.2Hz，苯基)，6.85(1H，s，苯基)，6.89(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.98(2H，d，J＝8.0Hz，苯基)，7.08(1H，t，J＝7.3Hz，苯基)，7.21(1H，d，J＝7.6Hz，7.9Hz，苯基)，7.30-7.38(7H，br，苯基)，7.67-7.71(2H，m，J＝2.4Hz，3.0Hz，邻苯二甲酰亚胺)，7.76-7.80(2H，m，J＝2.4Hz，3.0Hz，邻苯二甲酰亚胺)；MS(ESI)：m/z＝640.9[M+H]。
40-4.制备4-邻苯二甲酰亚胺基3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(4-phthalimidobutyl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45d
根据合成化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)与N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺(4.2mg，0.192mmol，3.0当量)之间的反应获得化合物45d(38.6mg)。
产量＝89％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.94(3H，t，J＝7.3Hz，CH3)，1.67-1.74(6H，br，J＝7.6Hz，7.9Hz，CH2)，2.12(3H，s，CH3)，2.76(2H，t，J＝7.6Hz，7.9Hz，CH2)，3.63(2H，t，J＝6.4Hz，CH2)，4.13(2H，s，CH2)，4.27(2H，t，J＝5.8Hz，CH2)，4.90(2H，s，CH2)，6.82(1H，d，J＝8.2Hz，苯基)，6.87(1H，s，苯基)，6.92(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.98(2H，d，J＝7.6Hz，苯基)，7.08(1H，t，J＝7.3Hz，苯基)，7.21(1H，d，J＝7.6Hz，7.9Hz，苯基)，7.30-7.41(7H，br，苯基)，7.70-7.73(2H，m，J＝2.1Hz，3.1Hz，3.4Hz，邻苯二甲酰亚胺基)，7.81-7.84(2H，m，J＝3.1Hz，邻苯二甲酰亚胺基)；MS(ESI)：m/z＝669.0[M+H]。
40-5.制备2-(吡咯烷-1-基)乙基3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(2-(pyrrolidin-1-yl)ethyl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45e
根据合成化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)与N-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(32.7mg，0.192mmol，3.0当量)之间的反应获得化合物45e(26.7mg)。
产量＝74％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.94(3H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，CH3)，1.65-1.74(6H，br，CH2)，2.15(3H，s，CH3)，2.48(3H，s)，CH3)，2.71-2.78(4H，br，CH2)，4.13(2H，s，CH2)，4.39(2H，t，J＝6.1Hz，CH2)，4.92(2H，s，CH2)，6.82(1H，d，J＝8.2Hz，苯基)，6.87(1H，s，苯基)，6.92(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.98(2H，d，J＝7.6Hz，苯基)，7.09(1H，t，J＝7.3Hz，苯基)，7.22(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，7.30-7.43(7H，br，苯基)；MS(ESI)：m/z＝565.0[M+H]。
40-6.制备3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸异丙酯(Isopropyl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45f
根据合成上述化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)与2-碘丙烷(19.2μl，0.192mmol)之间的反应获得化合物45f。
产量22.8mg(70％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 7.41-7.43(2H，m，苯基)，7.35-7.39(2H，m，苯基)，7.29-7.34(3H，m，苯基)，7.21(1H，t，J＝7.8Hz，苯基)，7.06-7.10(1H，m，苯基)，6.97-6.99(2H，m，苯基)，6.93(1H，d，J＝6.9Hz，苯基)，6.81-6.83(1H，m，苯基)，5.24-4.27(1H，m，J＝6.4Hz，CH)，4.93(2H，s，CH2)，4.14(2H，s，CH2)，2.73-2.77(2H，m，CH2)，2.14(3H，s，CH3)，1.28(6H，d，J＝6Hz，CH3)，0.93(3H，m，CH3)；MS(ESI)：m/z＝509.5[M+H]。
40-7.制备戊-3-基3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(Pentan-3-yl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45g
根据合成上述化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)与3-溴戊烷(24.0μl，0.192mmol)之间的反应获得化合物45g。
产量12.2mg(35％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 7.39-7.42(3H，m，苯基)，7.36-7.38(1H，m，苯基)，7.33-7.36(1H，m，苯基)，7.29-7.31(2H，m，苯基)，7.22(1H，t，J＝7.9Hz，苯基)，7.06-7.10(1H，m，J＝7.6Hz，苯基)，6.97-6.99(2H，m，苯基)，6.93-6.94(1H，m，J＝7.6Hz，苯基)，6.88(1H，t，J＝2.0Hz，苯基)，6.81-6.84(1H，m，苯基)，4.96-5.02(1H，m，J＝6.4Hz，CH)，4.92(2H，s，CH2)，4.14(2H，s，CH2)，2.73-2.77(2H，m，CH2)，2.16(3H，s，CH3)，1.69-1.74(2H，m，J＝8.0Hz，CH2)，1.58-1.65(4H，m，J＝6.4Hz，CH2)，0.93(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，0.87(6H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝537.2[M+H]。
40-8.制备3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸环戊酯(Cyclopentyl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2–propylisonicotinate)45h
根据合成上述化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)和溴环戊烷(41.1μl，0.384mmol，6.0当量)之间的反应获得化合物45h。
产量20.2mg(59％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 7.39-7.43(3H，m，苯基)，7.33-7.37(2H，m，苯基)，7.30-7.33(2H，m，苯基)，7.22(1H，t，J＝8Hz，苯基)，7.07-7.10(1H，m，J＝7.2Hz，苯基)，6.97-7.00(2H，m，苯基)，6.92-6.94(1H，m，苯基)，6.88(1H，t，J＝1.6Hz，苯基)，6.81-6.84(1H，m，苯基)，5.36-5.41(1H，m，J＝3.2Hz，CH)，4.92(2H，s，CH2)，4.13(2H，s，CH2)，2.74-2.77(2H，m，J＝8Hz，CH2)，2.14(3H，s，CH3)，1.85-1.92(4H，m，CH2)，1.65-1.76(4H，m，CH2)，1.25(2H，s，CH2)，0.94(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝535.1[M+H]。
40-9.制备四氢呋喃-3-基3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(Tetrahydrofuran-3-yl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45i
根据合成上述化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)和3-溴氢呋喃(36.2μl，0.384mmol，6.0当量)之间的反应获得化合物45i。
产量11.7mg(89％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 7.39-7.41(3H，m，苯基)，7.36(1H，t，J＝2Hz，苯基)，7.33-7.35(1H，m，苯基)，7.31-7.32(1H，m，苯基)，7.30(1H，t，J＝2Hz，苯基)，7.22(1H，t，J＝8Hz，苯基)，7.07-7.11(1H，m，J＝7.6Hz，苯基)，6.97-7.00(2H，m，苯基)，6.91-6.94(1H，m，苯基)，6.87(1H，t，J＝2Hz，苯基)，6.81-6.84(1H，m，苯基)，5.44-5.48(1H，m，J＝4.4Hz，CH)，4.92(2H，s，CH2)，4.14(2H，s，CH2)，3.84-3.92(2H，m，CH2)，3.77-3.82(2H，m，CH2)，2.75-2.79(2H，m，J＝7.6Hz，2Hz，CH2)，2.14(3H，s，CH3)，1.96-2.03(2H，br，CH2)，1.68-1.78(2H，m，J＝1.6Hz，8Hz，CH2)，0.943(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝537.6[M+H]。
40-10.制备1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基3-(苄氧基)-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯(1-(Tert-butoxycarbonyl)piperidin-4-yl 3-(benzyloxy)-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)45j
根据合成上述化合物45a-j的一般程序，通过化合物44(30.0mg，0.064mmol，1.0当量)和溴环戊烷(101.4mg，0.384mmol，6.0当量)之间的反应获得化合物45j。
产量27.8mg(67％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 7.39-7.41(4H，m，苯基)，7.35-7.37(1H，m，苯基)，7.30-7.34(2H，m，苯基)，7.22(1H，t，J＝8Hz，苯基)，7.07-7.11(1H，m，J＝1.2Hz，7.6Hz，苯基)，6.97-6.99(2H，m，J＝1.2Hz，7.6Hz，苯基)，6.92-6.95(1H，m，J＝1.2Hz，7.6Hz，苯基)，6.87-6.88(1H，m，J＝1.6Hz，苯基)，6.81-6.84(1H，m，J＝0.8Hz，7.6Hz，苯基)，5.11-5.16(1H，m，J＝3.6Hz，CH)，4.91(2H，s，CH2)，4.14(2H，s，CH2)，3.60-3.70(2H，br，CH2)，3.13-3.20(2H，m，J＝3.6Hz，9.2Hz，CH2)，2.75-2.79(2H，m，J＝2Hz，8Hz，CH2)，2.14(3H，s，CH3)，1.79-1.88(2H，br，CH2)，1.72-1.76(2H，m，J＝1.6Hz，7.6Hz，CH2)，1.57-1.58(2H，d，J＝5.2Hz，CH2)，1.44-1.46(9H，m，CH3)，0.95(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝649.5[M+H]。
实施例41.制备化合物46a-j的一般程序
将Pd/C加入到溶解有化合物45a-j(1.0当量)的DCM/甲醇(1:3)混合溶液的溶液中，并将其在H2气氛(1atm)下于室温中搅拌30分钟。通过硅藻土过滤器进行过滤后，将混合物在真空下进行浓缩，然后利用正己烷:EA＝3:1作为洗脱液，通过硅胶柱层析进行纯化，从而获得化合物46a-j。
41-1.制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸苯乙酯(Phenethyl3-hydroxy-5-methyl-6-(3-phenoxybenzyl)-2-propylisonicotinate)46a
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45a(16.1mg，0.028mmol)进行反应，而获得化合物46a(3.0mg)。
产量22％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.96(3H，t，J＝7.3Hz，CH3)，1.56(3H，s，CH3)，1.69-1.75(2H，m，J＝7.6Hz，CH2)，2.21(3H，s，CH3)，2.80(2H，t，J＝7.6Hz，7.9Hz，CH2)，3.08(2H，t，J＝7.0Hz，CH2)，4.14(2H，s，CH2)，4.62(2H，t，J＝7.0Hz，CH2)，6.79(2H，s，苯基)，6.85(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.96(2H，d，J＝8.5Hz，苯基)，7.08(1H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，苯基)，7.16-7.25(5H，br，苯基)，7.27-7.41(8H，br，苯基)；MS(ESI)：m/z＝481.9[M+H]。
41-2.制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸辛酯46b
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45b(32.7mg，0.056mmol)进行反应，而获得化合物46b(15.4mg)。
收率56％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.87(3H，t，J＝6.7Hz，7.0Hz，CH3)，0.96(3H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，CH3)，1.23-1.42(10H，br，CH2)，1.66-1.77(4H，m，J＝7.0Hz，7.6Hz，7.9Hz，CH2)，2.35(3H，s，CH3)，2.81(2H，t，J＝6.7Hz，7.0Hz，CH2)，4.16(2H，s，CH2)，4.36(2H，t，J＝6.7Hz，CH2)，4.90(2H，s，CH2)，6.79(2H，d，J＝8.0Hz，苯基)，6.95(2H，d，J＝7.3Hz，苯基)，7.06(1H，t，J＝7.3Hz，苯基)，7.18(1H，t，J＝7.6Hz，7.9Hz，苯基)，7.29(1H，t，J＝7.3Hz，苯基)；MS(MALDI-TOF)：m/z＝489.4[M+H]。
41-3.制备2-邻苯二甲酰亚胺乙基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯46c
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45c(21.0mg，0.033mmol)进行反应，而得到化合物46c(17.6mg)。
收率＝98％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.95(3H，t，J＝7.3Hz，CH3)，1.65-1.71(2H，m，J＝7.3Hz，7.6Hz，7.9Hz，CH2)，2.25(3H，s，CH3)，2.80(2H，t，J＝7.6Hz，CH2)，4.13(4H，br，CH2)，4.64(2H，t，J＝4.8Hz，5.8Hz，CH2)，6.78(2H，s，苯基)，6.84(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.96(2H，d，J＝8.5Hz，苯基)，7.08(1H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，苯基)，7.17(1H，t，J＝7.6Hz，苯基)，7.30(2H，t，J＝7.3Hz，苯基)，7.71-7.74(2H，m，J＝2.4Hz，3.0Hz，邻苯二甲酰亚胺)，7.82-7.86(2H，m，J＝2.4Hz，3.0Hz，邻苯二甲酰亚胺基)；MS(ESI)：m/z＝550.9[M+H]。
41-4.制备4-邻苯二甲酰亚胺基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯46d
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45d(33.1mg，0.049mmol)进行反应，而获得化合物46d(22.7mg)。
收率＝79％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.96(3H，t，J＝7.3Hz，CH3)，1.67-1.73(2H，m，J＝7.6Hz，7.9Hz，CH2)，1.82-1.84(4H，br，CH2)，2.33(3H，s，CH3)，2.81(2H，t，J＝7.6Hz，CH2)，3.75(2H，t，J＝6.4Hz，CH2)，4.16(2H，s，CH2)，4.27(2H，t，J＝5.8Hz，CH2)，6.78(2H，d，J＝8.5Hz，苯基)，6.86(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.96(2H，d，J＝8.5Hz，苯基)，7.07(1H，t，J＝7.3Hz，苯基)，7.19(1H，d，J＝7.6Hz，7.9Hz，苯基)，7.30(2H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，苯基)，7.69-7.73(2H，m，J＝2.1Hz，3.1Hz，3.4Hz，邻苯二甲酰亚胺)，7.81-7.84(2H，m，J＝3.1Hz，邻苯二甲酰亚胺)，10.41(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝578.9[M+H]。
41-5.制备2-(吡咯烷-1-基)乙基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯46e
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45e(23.7mg，0.042mmol)进行反应，而获得化合物46e(7.4mg)。
收率＝37％；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.95(3H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，CH3)，1.64-1.71(2H，m，J＝7.3Hz，7.6Hz，CH2)，1.85-1.89(4H，br，CH2)，2.18(3H，s，CH3)，2.62-2.71(4H，br，CH2)，2.78(2H，t，J＝7.6Hz，7.9Hz，CH2)，2.84(2H，t，J＝5.2Hz，5.8Hz，CH2)，4.10(2H，s，CH2)，4.56(2H，t，J＝5.2Hz，6.1Hz，CH2)，6.78(1H，d，J＝7.9Hz，苯基)，6.84(1H，s，苯基)，6.88(1H，d，J＝7.6Hz，苯基)，6.96(2H，d，J＝7.6Hz，苯基)，7.07(1H，t，J＝7.3Hz，苯基)，7.18(1H，t，J＝7.6Hz，7.9Hz，苯基)，7.30(2H，t，J＝7.3Hz，7.6Hz，苯基)；MS(ESI)：m/z＝475.0[M+H]。
41-6.制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸异丙酯46f
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45f(20.2mg，0.040mmol)进行反应，而获得化合物46f。
产量13.0mg(78％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 10.43(1H，s，OH)，7.28-7.32(2H，m，苯基)，7.20(1H，t，J＝7.8Hz，苯基)，7.05-7.09(1H，m，苯基)，6.95-6.98(2H，m，苯基)，6.88(1H，d，J＝7.3Hz，苯基)，6.78-6.82(2H，m，苯基)，5.30-5.35(1H，m，CH)，4.17(2H，s，CH2)，2.81(2H，dd，J＝6.9Hz，8.7Hz，CH2)，2.35(3H，s，CH3)，1.66-1.75(2H，m，CH2)，1.39(6H，d，J＝6.4Hz，CH3)，0.97(3H，t，J＝7.6，CH3)；MS(ESI)：m/z＝419.6[M+H]。
41-7.制备戊-3-基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯46g
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45g(9.7mg，0.018mmol)进行反应，而获得化合物46g。
产量5.6mg(70％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 10.56(1H，s，OH)，7.28-7.32(2H，m，苯基)，7.20(1H，t，J＝8Hz，苯基)，7.05-7.10(1H，m，J＝7.2Hz，苯基)，6.95-6.98(2H，m，苯基)，6.88-6.90(1H，m，苯基)，6.82(1H，t，J＝1.6Hz，苯基)，6.79-6.81(1H，m，苯基)，5.12-5.15(1H，m，J＝6.4Hz，CH)，4.17(2H，s，CH2)，2.80-2.84(2H，m，J＝7.6Hz，CH2)，2.37(3H，s，CH3)，1.67-1.76(4H，m，J＝7.6Hz，CH2)，1.69-1.73(2H，m，CH2)，0.97(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，0.95(6H，t，J＝7.6Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝447.7[M+H]。
41-8.制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸环戊酯46h
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45h(15.8mg，0.029mmol)进行反应，而获得化合物46h。
产量11.7mg(89％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 10.57(1H，s，OH)，7.28-7.32(2H，m，J＝7.6Hz，苯基)，7.20(1H，t，J＝8Hz，苯基)，7.06-7.10(1H，m，J＝7.2Hz，苯基)，6.95-6.98(2H，m，苯基)，6.87-6.89(1H，m，苯基)，6.80-6.82(1H，m，苯基)，6.78-6.79(1H，m，苯基)，5.48-5.52(1H，m，J＝2.8Hz，CH)，4.17(2H，s，CH2)，2.80-2.84(2H，m，J＝7.6Hz，CH2)，2.34(3H，s，CH3)，1.94-1.97(2H，m，CH2)，1.83-1.88(4H，m，CH2)，1.68-1.73(4H，m，CH2)，0.97(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝445.7[M+H]。
41-9.制备四氢呋喃-3-基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯46i
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45i(22.7mg，0.035mmol)进行反应，而获化合物46i。
产量7.6mg(56％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 10.33(1H，s，OH)，7.29-2.33(2H，m，J＝2Hz，7.6Hz，苯基)，7.17-7.22(1H，m，J＝1.2Hz，8Hz，苯基)，7.06-7.10(1H，m，J＝1.2Hz，7.6Hz，苯基)，6.95-6.97(2H，J＝1.2Hz，7.6Hz，苯基)，6.87-6.89(1H，m，J＝7.6Hz，苯基)，6.80-6.82(1H，m，苯基)，6.78(1H，m，苯基)5.58-5.62(1H，m，J＝2Hz，CH)，4.17(2H，s，CH2)，3.97-4.00(2H，m，CH2)，3.93-3.96(2H，m，J＝4.4Hz，CH2)，2.80-2.84(2H，m，J＝2Hz，7.6Hz，CH2)，2.36(3H，s，CH3)，2.25-2.35(1H，m，J＝2.4Hz，6Hz，CH2)，2.17(1H，s，CH2)，1.67-1.75(2H，m，J＝1.6Hz，7.6Hz，CH2)，0.969(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝447.6[M+H]。
41-10.制备1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯46j
根据合成上述化合物46a-j的一般程序，通过使化合物45i(10.8mg，0.019mmol)进行反应，而获得化合物46j。
产量13.1mg(67％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 10.44(1H，s，OH)，7.28-7.33(2H，m，J＝2.4Hz，7.2Hz，苯基)，7.18-7.22(1H，m，J＝7.6Hz，苯基)，7.06-7.10(1H，m，J＝1.2Hz，7.6Hz，苯基)，6.95-7.00(2H，m，J＝1.2Hz，7.6Hz，苯基)，6.88(1H，d，J＝8Hz，苯基)，6.79-6.83(2H，m，苯基)，5.27-5.34(1H，br，CH)，4.17(2H，s，CH2)，3.66-3.76(2H，br，CH2)，3.31-3.40(2H，br，CH2)，2.80-2.84(2H，m，J＝8Hz，CH2)，2.37(3H，s，CH3)，1.95-2.04(2H，br，CH2)，1.73-1.82(2H，br，CH2)，1.68-1.72(2H，m，J＝1.2Hz，8Hz，CH2)，1.47(9H，s，CH3)，0.97(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝560.1[MH]。
实施例42.制备哌啶-4-基3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸酯47
将化合物46j(1.0当量)溶解在利用DCM稀释的20％TFA中。将混合物在室温下搅拌1小时，然后利用二氯甲烷来萃取。收集有机相，并利用无水Na2SO4进行干燥。过滤后，在真空下蒸发溶剂。并利用正己烷:EA＝5:1作为洗脱液将残余物通过硅胶柱层析进行纯化。
产量5.9mg(67％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 7.28-7.33(2H，m，J＝7.6Hz，苯基)，7.20(1H，t，J＝8Hz，苯基)，7.06-7.10(1H，m，J＝1.2Hz，7.2Hz，苯基)，6.95-6.98(2H，m，J＝1.2Hz，7.2Hz，苯基)，6.88-6.90(1H，m，J＝7.2Hz，6.78-6.84(2H，m，苯基)，5.22-5.29(1H，br，CH)，4.17(2H，s，CH2)，3.10-3.18(2H，br，CH2)，2.86-2.92(2H，br，CH2)，2.80-2.84(2H，m，J＝2Hz，7.6Hz，CH2)，2.38(3H，s，CH3)，2.04(2H，s，CH2)，1.70-1.74(4H，m，J＝2Hz，7.6Hz，CH2)，0.97(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(ESI)：m/z＝461.1[M+H]。
实施例43，制备3-羟基-5-甲基-6-(3-苯氧基苄基)-2-丙基异烟酸乙酯48
根据以下用于合成上述化合物12a-k的一般程序，通过化合物25(1.2g，3.6mmol)和巴豆酸乙酯(0.90μL，7.2mmol)来合成。
产量0.62g(42％)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δppm 0.95(3H，t，J＝7.6Hz，CH3)，1.30(3H，m，CH3)，1.64-1.73(2H，m，CH2)，2.39(3H，s，CH3)，2.77-2.84(2H，m，CH2)，4.16(2H，s，CH2)，4.21-4.29(2H，m，CH2)，6.73-6.79(2H，m，苯基)，6.83-6.86(1H，m，苯基)，6.92-6.96(2H，m，苯基)，7.02-7.08(1H，m，苯基)，7.13-7.18(1H，m，苯基)，7.25-7.31(2H，m，苯基)，10.31(1H，s，OH)；MS(ESI)：m/z＝406.3[M+H]。
实验例1.受体拮抗作用试验
为了试验上述实施例中制备的化合物对(1)重组小鼠P2X1和人类P2X3受体的拮抗活性；及对(2)人类P2X7受体中的溴化乙锭积累的影响，而进行了以下实验。
1-1.对重组mP2X1和hP2X3受体的双电极电压钳夹试验
对非洲蛙卵(爪蟾***)进行分离并与270U/mg胶原酶在23℃-24℃下培养1.5小时。在保持18℃下，将去除卵泡(defolliculated)的***在Barth溶液中培养24小时。一日后，通过mP2X1和hP2X3受体cRNA作为细胞质分别对去卵泡的***进行微注射，并在18℃下在Barth溶液中培养24小时。然后将注入有cRNA的***在4℃下保管12天。双电极电压钳技术(Axoclamp 2B amplifier)通过利用注入有cRNA的***来记录ATP激活的膜电流(Vh＝70mV)。电压记录(1-2MΩ尖端电阻)和电流记录微电极(5MΩ尖端电阻)含有3.0M KCl。将***的pH调整为7.5，并将***放置在连续地过量注入(superfused)包含110mM NaCl、2.5mM KCl、5mM HEPES和1.8mM BaCl2的林格氏溶液的电生理室中。为了诱导所诱发的电流，将2μM ATP过量注入60-120秒，并洗涤20分钟。为了进行数据分析，在PH7.5条件下对ATP诱发电流进行标准化。在暴露于ATP前20分钟，将上述化合物适用于固定在电生理室的***。IC50值通过使用化学式log(I/Imax-1)设计的希尔图(Hill plots)来进行确定，其中I是拮抗剂存在的条件下的ATP诱发电流。数据表示为来自互相不同***的批次(batch)的平均值±SEM(n≥3)。
1-2.表达hP2X7的HEK293细胞中的溴化乙锭积累实验
利用人类P2X7受体(P2X7R)稳定转化的HEK293细胞在5％CO2的湿润大气条件下于37℃中，利用补充有10％(v/v)FBS、2mML-谷氨酰胺和抗生素(50U/mL青霉素及50μg/ml链霉素)的DMEM进行维持。利用荧光酶标仪通过测量表达hP2X7的HEK293细胞中乙锭的细胞吸收来测量BzATP诱导孔的形成。利用适当的分析缓冲液将表达hP2X7的HEK293细胞洗涤一次，并在执行随后的分析之前将其去除。所有的研究都在室温下进行，并且最终分析体积为100μL。将上述细胞以2.5×106细胞/ml的浓度重悬于由10mM HEPES、5mM N-甲基-D-葡萄糖胺、5.6mM KCl、10mM D-葡萄糖和0.5mM CaCl2(pH 7.4)组成的分析缓冲液，并补充280mM蔗糖或140mM NaCl。
为了确定本发明5-羟基吡啶衍生物及参考化合物(AZD9056)的拮抗活性，将这些化合物与BzATP一起以10μM的浓度添加到细胞中，并且未进行预培养。将上述细胞在5％CO2的湿润的大气中培养2小时后，通过利用Bio-Tek仪器FL600荧光板读数器(530nm激发波长和590nm发射波长)测量荧光来观察乙锭染料的吸收。结果显示为对仅用BzATP刺激时溴化乙锭的最大累积量的相对百分比。
1-3.关于体外P2X受体拮抗性的化学结构-活性关系
为了调查本发明中所合成的化合物的结构-活性关系(SAR，构效关系)，因此，通过双电极电压钳(TEVC)的检验来评价上述化合物在分别表达重组mP2X1或hP2X3的非洲爪蟾(Xenopus)***中的拮抗活性。在稳定表达重组人类P2X7R的人类HEK293细胞中，通过使用乙锭离子积累试验来评价了hP2X7R拮抗活性。将化合物1、NF-499及AZD9056分别作为mP2X1，hP2X3和hP2X7R的阳性对照拮抗剂，并一起进行了试验。
尽管本发明人对于抑制性疼痛信号活性，报道了针对hP2X3R的IC50值为60nM的强效拮抗化合物7c，但是化合物7c的体外代谢稳定性极低(与S9微粒体组分一起培养30分钟后的剩余百分比％)，推断为这可能是由于4-醛导致的。因此，本发明人努力优化包括4-醛基的修饰在内的在5-羟基吡啶主链中3、4和6位上的部分(moiety)组合。
结果显示在表2
【表2】
(根据R1的变化，3,4-二羧基吡啶(3,4-Dicarboxypyridine)衍生物对mP2X1，hP2X3和hP2X7受体的拮抗效果)
测定了非洲爪蟾(aXenopus)***中所表达的重组P2X受体中，由2μMATP诱发的离子电流反应以及化合物在1μMb、10μMc或IC50 d值下对mP2X1受体和hP2X3受体的百分比抑制效果(平均±SEM，n≥3)。表达ehP2X7的HEK293细胞中测量溴化乙锭的积累，并且评价了10μM上述表的化合物对积累的抑制百分比(平均±SEM，n≥3)。f本发明人在之前的研究中报道了IC50值。其如下：g1(对A-317491、hP2X3受体的IC50值＝97nM)、hNF-449(对rP2X1受体的IC50值＝280pM)、iAZD9056(对hP2X1受体的IC50值＝13nM)。
如上述表2所示，对于3,4-二羧基吡啶衍生物的第6位碳中取代基的P2XR拮抗作用，对各种烷基、芳族和带负电原子的基团进行了调查。在直碳链长度的衍生物的SAR分析中，hP2X3R拮抗剂的活性随着碳链数从0增加到4而增加。特别是，碳链长度为3和4的化合物13d和13e相比于化合物13a至13c增加了4-5倍，从而显示出显著增加的IC50值(分别为93nM和95nM)。有趣的是，相比于hP2X3R，mP2X1R拮抗作用的顺序是逆向的，表明mP2X1R中的功效随着第6位碳上的碳链长度和体积的增加而依次显著降低。因此，通过使来自非选择性化合物13a和13b的碳链的长度优化为0和4，实现了hP2X3R对mP2X1R的约100倍的选择性(化合物13d和13e)。
当第6位碳上被异丙基(化合物13f)或异丁基(化合物13g)等大体积碳链取代时，化合物13f在hP2X3R中的活性(IC50＝466nM)类似于化合物13b(6-甲基类似物)的活性，而化合物13g的拮抗活性显著降低(抑制32％，1μM)，从而意味着在恒定距离处存在狭窄的结合口袋(narrow binding pocket)。因此，表明了具有在第6位碳上有不同碳链的非极性苯基的化合物13h和13i对具有700nM范围的IC50值的hP2X3R的拮抗作用较弱。与化合物13d相比，在第6位碳上具有不同静电势的衍生物(例如，羧酸13j、硫化物13k和砜13l)对hP2X3R拮抗活性未提供有利的影响，这意味着，对于拮抗效果来说，受体内的相应结合口袋主要基于第6位碳的取代基的位阻支配(steric management)来接近。
接下来，本发明人调查了第3位和第4位的羧酸残基的位置偏好(positionpreferences)和生物同位素取代。并且，如化合物18-23(表3)所示，针对各种电子效应进行了进一步的变形。
结果显示在表3
【表3】
根据吡啶的多种变化，对5-羟基吡啶衍生物的mP2X1、hP2X3和hP2X7受体的拮抗效果
测定了非洲爪蟾***中所表达的重组P2X受体中，由2μM ATP诱发的离子电流反应以及化合物在1μMb、10μMc或IC50 d值下对mP2X1受体和hP2X3受体的百分比抑制效果(平均±SEM，n≧3)。表达ehP2X7的HEK293细胞中测量溴化乙锭e的积累，并且评价了10μM上述表的化合物对积累的抑制百分比(平均±SEM，n≥3)。
如上述表3所示，本发明人引入了腈基(化合物16)和甲磺酰基(化合物20)作为氢键受体(hydrogen bond acceptor)，引入四唑作为4-羧酸基的生物电子等排体(bioisostere)，结果对P2X1R和P2X3R的拮抗活性显着降低。可能与P2X3R的ATP结合位点的赖氨酸残基相互作用的、具有稠合杂环基的衍生物，例如马来酸酐(maleic anhydride)(化合物18)和哒嗪(pyridazine)(化合物19)也表现出明显的拮抗活性损失。
这样的结果意味着，第4位碳的适量的酸性官能团在受体中的结合可能是必不可少的。因此，为了降低化合物13的二羧酸基的极性负性特性(polar negative property)为目的，在第3位碳利用-H或CH3来对羧酸进行变形。
与作为3,4-二羧酸类似物的化合物13b(IC50＝460nM)相比，作为吡啶的第4位碳上的一元羧酸类似物的化合物22a对hP2X3R的拮抗活性降低了近2倍。相反，作为3-甲基吡啶-4-羧酸衍生物的化合物22b(IC50＝384nM)，保持了对hP2X3R的拮抗活性。尝试通过利用6-正丙基(化合物22c，IC50＝303nM)取代化合物22b的6-甲基来提高hP2X3R的效力，导致仅稍微增加拮抗活性。在作为4-羧酰胺衍生物的化合物23(其酸度较低但具有相似的H键供体性质)(IC50＝709nM)的情况下，对hP2X3R的拮抗活性降低了2倍。这些结果表明，就hP2X3R中的拮抗活性而言，在第4位碳原子上与药效团(pharmacophore)的可能的离子相互作用(possible ionic interactions)可能比H键的相互作用更重要。
接下来，本发明人在以前报道的吡啶残基的第2位碳上引入了间苯氧基苯基(m-phenoxyphenyl group)，其为对于具有改善的选择性特征(improved selectivityprofile)的对甲氧基苯乙基(p-methoxyphenethyl group)的可选的药效团(表4)。结果显示在表4
【表4】
在吡啶的第2位碳上，根据间苯氧基苯基的变化，对5-羟基吡啶衍生物的mP2X1、hP2X3、和hP2X7受体的拮抗效果
测定了非洲爪蟾***中所表达的重组P2X受体中，由2μM ATP而诱发的离子电流反应以及化合物在1μMb、10μM或IC50值下对mP2X1受体和hP2X3受体的百分比抑制效果(平均±SEM，n≧3)。表达ehP2X7的HEK293细胞中测量溴化乙锭的积累，并且评价了10μM的上述表的化合物对积累的抑制百分比(平均±SEM，n≥3)。
但是，诸如化合物27(IC50＝301nM)的3,4-二羧基-2-间苯氧基苯基衍生物与相应的2-对甲氧基苯乙基类似物、化合物13d相比，未提高hP2X3R的拮抗效果或对mP2X1R的选择性。
另外，本发明人为了减少极性，引入了CH3(化合物29)来替代化合物27的3-羧酸。与化合物22c和化合物13d的情况不同，4-羧基-3-甲基-2-m-苯氧基苯基衍生物(化合物29，IC50＝245nM)保持了化合物27的hP2X3R拮抗功效。
进而，化合物29还显示了对异源(heterologous)rP2X2/3受体(其为在生理学上更具相关性的受体)的拮抗效果(图2)。
通过碳链延长的羧酸，如4-丙烯酸(化合物35)或4-丙酸(化合物37)、4-腈(化合物38)、4-甲胺(化合物41)及4-甲磺酸砜酰胺(化合物43)，对于化合物29的第4位碳上其他取代基的效果作了更多的研究。但是，在1μM浓度下所有化合物对hP2X3R均显示出不到50％的抑制效果。因此，可以预测吡啶环的第4位碳上的药效团的结合伴侣可以由具有与狭窄结合口袋的离子相互作用的性质的氨基酸构成。并且评价了5-羟基吡啶衍生物对mP2X1受体和hP2X7受体的亚型选择性。其结果，表3及表4中的10μM的浓度的所有化合物对mP2X1R仅显示出0％至43％的抑制活性，对hP2X7R显示出无活性。
在新型hP2X2受体拮抗剂中，为了进一步测试体内神经疼痛(NeP)动物模型中的功能活性，选择了化合物29。被认为是更有效的拮抗剂的化合物13d，由于其在早期动物实验中的体内功效较弱而被排除在外，这大概是由于其高极性理化性质。
实验例2.药代动力学(PK)和hERG通道试验
2-1.药代动力学试验方法
实验动物
从SAMTACO(京畿道乌山)购买7周龄至8周龄的雄性SD大鼠(体重250g-290g)，并且自由供应商业大鼠饲料和水。在12±12小时的明暗周期下，每个笼子在23±2℃的温度和50％至60％的相对湿度下饲养3只大鼠。实验是使大鼠在上述条件下适应至少一周的时间后开始的。实验开始前将大鼠禁食12小时，并自由供应自来水。将化合物28以5mg/kg的剂量给药于尾静脉。静脉内给药0.5小时、2小时和8小时后，通过颈椎脱臼处死每只动物。将血液样本在12000rpm下离心5分钟，然后立即在70℃下进行保存直至分析。收集血液样本后，收集脑。然后精确称脑组织重量，并利用4倍体积的蒸馏水使脑组织进行均质化(IKA T10基本均质机，IKA，Staufen，德国)。将均质化的脑样品以12000rpm离心10分钟，并在-20℃下保管直至将500μl分取液分析为止。样本的定量是通过利用LC-MS/MS系统来执行。HPLC系统由包含二元泵(型号：G4220A)自动进样器(型号：G4226)及柱温箱(型号：G1316C)的Agilent1290系列快速分离液相色谱系统构成。通过利用配备有电喷雾电力源的Sciex
微粒体稳定性(Microsomal Stability)
在大鼠肝微粒体(RLM，Rat Liver Microsome)中测试了化合物的代谢稳定性。在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中将微粒体(0.5mg/ml)和试验化合物(1μM)在37℃下震荡5分钟(100rpm)来进行预培养。通过NADPH生产系统(pH 7.4的60mM磷酸钾缓冲液、1.3mM NADP、3.3mM 6-磷酸葡萄糖、0.3μL6-磷酸葡萄糖脱氢酶(0.4U/mL)和3.3mM氯化镁)引发代谢反应，并在37℃下进行培养。将100μL等分试样(aliquots)在0分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟进行回收，并通过添加两倍体积的冰冷乙腈(ACN)来终止反应。通过涡旋及在4℃下离心分离(14000rpm)15分钟并混合后，将上清液转移至液相色谱瓶中，并通过LC-MS/MS系统进行分析。
血浆蛋白结合(plasma protein binding)
血浆蛋白结合可以通过快速平衡透析(RED，rapid equilibrium dialysis)方法来进行测定。将化合物的DMSO储备溶液制备为10mM浓度，并通过注入有磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7.4)的50％血浆稀释至5μM的浓度。将血浆样品(100μL)和PBS(300μL)分别添加到样品室和缓冲室中，然后运行RED设备，并将样品在37℃的振荡培养箱中培养4小时。透析后，从腔室的每一面收集50μl等分试样。将50μl空白血浆添加到缓冲液样品中，并将50μl的PBS也添加到血浆样品中。将200μL含有内标物的乙腈添加到每个样品中。将上述样品在4℃下以3200g离心20分钟，从而获得上清液并通过LC-MS/MS系统进行分析。
血浆蛋白结合率计算如下：
自由形式(Free form)(％)＝(缓冲室/血浆室)×100
结合形式(Bound form)(％)＝100-自由形式(％)
PAMPA(平行人工膜渗透性测定(Parallel Artificial Membrane PermeabilityAssay))分析
将实验化合物溶解在DMSO中，使其浓度能够达到10mg/mL。将化合物储备液通过PBS缓冲液稀释100倍并混合，从而制备最终浓度为100μg/mL的二级储备液。将二级储备液(200μL)添加到S7供体孔(pION Inc，比尔里卡，MA，USA)中。在pH 7.4下分析试验化合物。通过添加5μL GIT-O脂质(pION)将每个受体孔(acceptor well)底部的滤膜(pION)弄湿，并且在相同的pH(200μL，pION)下用下沉缓冲液(sink buffer)填充受体孔和供体孔(donorwell，pION)。将受体滤板小心地放在供体板上，并在Gut-BOX(pION)中培育4小时。
经过渗透时间后，通过使用UV酶标仪(Infinite 200 PRO；TECAN，曼尼多夫，CHE)进行定量，从而确定参考孔以及受体孔和供体孔中化合物的浓度。通过PAMPA Explorer软件(版本3.6.0.7，pION)来计算有效渗透系数(Pe，effective permeabilitycoefficient)。化合物反复被分析了三次。使用维拉帕米(Verapamil)作为高渗透率标准。
CYP抑制分析(CYP Inhibition Assay)
根据进行了一些修改的制造商的说明，在96孔黑板上，使用CYP450筛选试剂盒(Invitrogen，USA，CA)并通过荧光测定法执行CYP450(1A2、2C9、3A4)酶分析法。该分析在室温下进行，并且最终分析的体积为100μL。制备在DMSO中的最终浓度为10μM的代表性化合物和已知的CYP450抑制剂(1A2：α-萘黄酮；2C9：磺胺苯并唑；3A4：酮康唑)。
主预混合物(酶(0.5nmol重组人CYP450酶))/NADP再生溶液(pH 8.0，100mM KH2PO4溶液中溶解有333mM 6-磷酸葡萄糖、30U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶)制备为CYP450反应缓冲液(200mM KH2PO4，pH 8.0)。将主预混合物添加到96孔板的每个孔中，并添加媒介物DMSO(对照组)和试验化合物，然后为了读取背景将上述混合物在板中预培养10分钟。随后，通过添加CYP450底物/NADP+混合物来立即启动酶反应。培养40分钟后，通过使用CHAMELEONTM多技术酶标仪(2C9、3A4：激发波长530nm和发射波长590nm，1A2：激发波长415nm和发射波长460)测量产物的荧光nm)来测量产物(product)的荧光。试验化合物对CYP450(1A2、2C9、3A4)的影响可以通过酶活性的百分比来显示。
2-2.hERF通道测试方法
hERG K+通道常规膜片钳测定(hERG K+Channel Conventional Patch-ClampAssay)
通过诱导性Tet-On基因表达系统(CHO-K1Tet-On hERG细胞)来表达hERG通道的大鼠卵巢细胞购自IonGate Biosciences GmbH(法兰克福，德国)。将CHO-K1Tet-On hERG细胞在5％CO2的湿润条件下于37℃下，在含有选择性抗生素、遗传霉素G418(200μg/mL)、潮霉素(200μg/mL)和嘌呤霉素(2μg/mL)以及10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、两性霉素B(Fungizone)(2.5μg/mL)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium)培养基中进行培养。每三天通过胰蛋白酶-EDTA来处理使细胞传代。为了表达hERG通道，将5μg/mL的强力霉素(Sigma，St.Louis，MO，美国)添加至生长培养基以诱导Tet-On基因表达。为了自动膜片钳记录，将CHO-K1 Tet-On hERG细胞在100-mm培养皿中进行培养。通过用胰蛋白酶-EDTA处理收集50％-80％融合的细胞，洗涤两次，然后以1.5×106细胞/mL的最终细胞密度悬浮于细胞外溶液中。添加强力霉素后，将细胞用于全细胞记录约20小时至32小时。
作为自动化膜片钳设备的NPC-16 Patchliner(耐尼恩技术，德国慕尼黑)，用于全细胞记录。通过含有50KCl、60KF、10NaCl、2MgCl2、20EGTA和10HEPES(pH 7.2)的细胞内溶液(单位为mM)和细胞外溶液来记录全细胞电流；通过含有140NaCl、4KCl、2CaCl2、1MgCl2、5葡萄糖和10HEPES(pH 7.4)的细胞外溶液(单位为mM)来记录全细胞电流。为了帮助形成稳定的密封，仅在密封形成步骤中使用包含(以mM为单位)80NaCl、3KCl、35CaCl2、10MgCl2和10HEPES(pH 7.4)的密封增强剂。在全细胞记录之前，将外部密封增强溶液(external sealenhancer solution)与上述细胞外溶液进行交换。
通过使用平行EPC-10膜片钳放大器(HEKA Elektronik，Lambrecht/Pfalz，德国)来记录hERG通道电流，并使用4-极贝塞尔(Bessel)滤波器进行低通滤波(10kHz)(low-passfilter)。将细胞悬浮液和贴片溶液自动添加到微加工的一次性芯片(NPC-16 Chip，NanionTechnologies，德国慕尼黑)中的四个记录孔中。
为了获得抑制常数，在20秒的扫描间隔(sweep interval)、-80mV的保持电位、+20mV的去极化电位持续500ms的情况下，通过500ms期间达到50mV的再极化步骤来诱发hERG尾电流。通过使用Patchmaster(HEKA Elektronik，Lambrecht/Pfalz，德国)来收集全细胞电流，并在5kHz下进行数字化。然后以4μl/s的速率通过使用4倍容量的溶液(40μl)的NPC-16 Patchliner的四个移液器吸头来将细胞外溶液交换为含有每种阻滞剂的细胞外溶液，并监测hERG尾电流，100秒至200秒期间将交换的阻滞剂溶液添加到膜片钳细胞，直到阻滞剂的结合达到平衡。利用Patchmaster/Fitmaster(HEKA Elektronik，Lambrecht/Pfalz，德国)、IGOR Pro(WaveMetrics Inc.，美国俄勒冈州波特兰)和GraphPad Prism 4(GraphPadSoftware，Inc.，拉荷亚，美国加利福尼亚)分析全细胞记录。
2-3.本发明的化合物29的体外药代动力学和hERG通道测试的结果
在针对CYP酶(3A4、2C9和1A2)的体外抑制活性的测试中，化合物29显示为抑制效果较弱，并且在针对hERG通道的体外抑制活性测试中，化合物29没有显示任何抑制活性。这表明，化合物29在关于药物-药物相互作用和心脏毒性方面具有合理的特征(profile)(表5)。
【表5】
体外药代动力学(PK)及hERG通道的研究
然而，化合物29显示出血浆蛋白结合性强(>99％)、代谢稳定性低(30分钟后<5％)、细胞渗透性低(log Pe＝-7.04)的特征。因此，可以在体内转化为化合物29的相应甲酯类似物(化合物28)显示出具有改善的代谢稳定性(30分钟后保留33％)，、血浆蛋白结合性及中等的细胞渗透性(log Pe＝-4.8)。另外，在腹膜内和静脉内施用化合物29也没有在神经性疼痛动物模型中显示出抗痛觉过敏作用，因此，决定对化合物28的体内功效进行评价。
实验例3.本发明的化合物的体内功效试验方法
3-1.体内功效评价方法
根据先前报道的方案，利用大鼠来评价了抗痛觉过敏作用(机械性痛觉超敏，mechanical allodynia)。为了测定退缩阈值(withdrawal threshold)，将大鼠(幼稚，SNL和CIPN)放置在各个塑料笼子的塑料网地板上。使大鼠适应环境30分钟，并在鞘内或静脉内向尾静脉施用后检查大鼠。对照组施用与实验组相同体积的媒介物(鞘内注射生理盐水或DMSO，静脉内注射DMSO:PEG:PBS＝1:6:3v/v％)。机械退缩阈值的测定是利用‘升降法’，将校准的冯·弗雷细丝(vonFrey filaments)(Stoelting，Wood Dale，IL，美国)通过笼子下面网状地板上的孔施加到大鼠的后爪来进行测量。在弯曲头部的状态下，将连续的八根冯·弗雷细丝(0.4g、0.7g、1.2g、2.0g、3.6g、5.5g、8.5g和15g)垂直施加于后爪底部5秒钟。积极退缩或缩回爪子被认为是阳性反应。当在15g冯·弗雷细丝上施加压力时，在大鼠中无反应则被用作临界值。仅测试有明确异常性疼痛的大鼠(即机械退缩阈值：SNL后小于4g或CIPN后小于5g)作为对象来进行试验。实验结束后，通过施用过量的七氟醚(sevoflurane)使大鼠安乐死。冯·弗雷细丝测试的退缩阈值数据，根据％MPE＝[(药物后阈值-损伤后基线阈值)/(截止阈值-损伤后基线阈值)x 100]公式，以最大可能效果(maximum possibleeffect)来进行计算。剂量反应(Dose-response)数据是通过使用Scheffe事后检验和单向方差分析(ANOVA，one-way analysis of variance)来进行分析。
3-2.化合物29的神经性疼痛动物模型中的体内功效的评价
化合物29的抗痛觉过敏功效在脊神经结扎(SNL，spinal nerve ligation)中在鞘内给药后，通过使用冯·弗雷(von Frey)方法来进行评价。化合物29的结果作为SNL大鼠中抗痛觉过敏作用的指标，显示撤足阈值的增加(图4a)。
化合物29(1μg(0.0026μmol)时MPE％＝58±19)的抗痛觉过敏功效显示为比P2X3受体拮抗剂AF353(1μg(0.0023μmol)时MPE％＝32±11)的抗痛觉过敏功效更强。在SNL大鼠中显示为与钙通道调节剂普瑞巴林(pregabalin)(1μg(0.0063μmol)时MPE％＝65±9)相比，具有相同的抗痛觉过敏功效。但是，在腹膜内及静脉内给药后，在NeP动物模型中未观察到药理活性。
3-3.化合物28的神经性疼痛动物模型中的体内功效的评价
虽然化合物29的鞘内给药在NeP大鼠中显示出了强效的抗痛觉过敏作用，但是化合物29的静脉内注射未能提供抗痛觉过敏作用。最近，AbbVie,Inc.曾报道过，尽管在炎症性疼痛动物模型中并不是必须的，但是如果P2X3受体拮抗剂在神经性疼痛中有效对抗伤害感受性反应(anti-nociceptive responses)，就必须能够透过血脑屏障(BBB，blood brainbarrier)。因此，化合物29可能极性过大，而无法通过静脉注射的方式在NeP动物模型中透过血脑屏障来提供抗痛觉过敏作用。为了改善化合物29的血脑屏障(BBB)渗透理化性质，通过使用CNS中转换为化合物29来显示出抗痛觉过敏作用的化合物29的甲酯衍生物(化合物28)，研究了前药策略(prodrug strategy)。
结果显示在表6。
【表6】
化合物28
0.5hr
2hr
4hr
8hr
血浆(μg/mL)
0.62±0.14
0.08±0.02
0.06±0.01
0.02±0.01
脑(μg/g)
1.11±0.36
0.09±0.01
0.05±0.01
0.03±0.01
脑/血浆比率
1.79±0.44
1.13±0.25
0.94±0.21
1.19±0.41
化合物29
0.5hr
2hr
4hr
8hr
血浆(μg/mL)
0.11±0.05
0.03±0
0.02±0.01
0.01±0
脑(μg/g)
0.022±0.003
0.002±0.001
0.001±0
0.001±0.001
脑/血浆比率
0.24±0.13
0.08±0.02
0.05±0.03
0.1±0.12
大鼠中将化合物28(5mg/kg)静脉给药后，化合物28(前药)和化合物29(活性型)的浓度(平均±标准差)及比率(脑/血浆比率，平均±标准差)。
如上述表6所示，化合物28的静脉内给药0.5小时后，脑组织(1.11μL/g组织，表6)中的浓度比化合物29(0.022μL/g组织，表6)的浓度高50倍。化合物28的脑/血浆比率(1.13-1.79，表6)是化合物29(小于0.25，表6)的4.5至7倍。因此，本发明人在包括SNL大鼠和由化学疗法诱导的周围神经病(CIPN，chemotherapy-induced peripheral neuropathy)大鼠的NeP动物模型中通过腹膜内给药化合物28来调查体内药理效果。结果观察到强效的抗痛觉过敏作用，在SNL大鼠(图4)中ED50值为2.62mg/kg，在CIPN大鼠(图5)中ED50值为2.93mg/kg。上述结果暗示化合物28的理化特性(血脑屏障(BBB)渗透、代谢稳定性和血浆蛋白结合性质)的整体改善能够使得通过静脉内注射的NeP动物模型中具有有效的抗痛觉过敏功效。化合物28的体内功效高于目前已报道的作为用于NeP的临床药物的普瑞巴林(ED50＝4.21mg/kg)和曲马多(ED50＝4.67mg/kg)的功效。
3-4.化合物46a-i、化合物47、及化合物48的体内功效的评价
考虑到血脑屏障的渗透性和在CNS中转化为化合物29的可能性，开发了引入各种酯基的作为化合物29的前药的化合物46a-I、化合物47和化合物48。该药物在神经性疼痛动物模型SNL大鼠和CIPN大鼠中的静脉内注射后进行了药理研究。结果，表7的化合物46a-i、47和48在SNL大鼠中观察出具有ED50值为2.31mg/kg至3.64mg/kg的抗痛觉过敏功效，并且在CIPN大鼠中具有ED50值为2.93mg/kg至3.94mg/kg的抗痛觉过敏功效。
【表7】
实验例4.本发明的化合物的行为学功效试验
4-1.行为学功效试验
为了评价鞘内或静脉内向尾静脉给药后第5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟的行为变化，附加的大鼠接受了所使用的药物的最高容量。使用扶正和 放置踏步反射(righting and placing-stepping reflexes)检查运动功能。当将大鼠的背 部水平置于桌子侧时，通过能否将身体立即协调地扭转到直立位置 来评估正位反 射(righting reflex)。沿着桌子的边缘将后爪往背部牵拉的方式诱导放置-踏步反射。大鼠通常会通过可以行走的姿势尝试将其前爪放置在前面。耳廓(pinna)和角膜反射也进行评估，判定存在与不存在。并且还评估了其他异常行为并进行了评价，例如：蛇行运动或震颤。
4-2.行为学功效评价结果
鞘内或静脉内给药后，对化合物28和化合物29的行为反应的分析结果表明，本研究中使用的最大剂量下正位和放置-踏步反射是正常的，且存在耳廓(pinna)和角膜反射。另外，未观察到明显的异常行为变化。
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