阅读说明：本技术 用于连接荧光标记与用于dna合成测序的碱基的具有不同可裂解连接子的3’-o-改性的核苷酸类似物 (3' -O-modified nucleotide analogs with different cleavable linkers for linking fluorescent labels to bases for DNA sequencing by synthesis ) 是由 静岳·具 李晓旭 陈鑫 希夫·库马尔 詹姆士·鲁索 闵辰·简 于 2018-03-28 设计创作，主要内容包括：本文中尤其公开具有可裂解的正交连接子的核苷酸类似物和其使用方法。(Disclosed herein, inter alia, are nucleotide analogs having cleavable orthogonal linkers and methods of using the same.)

用于连接荧光标记与用于DNA合成测序的碱基的具有不同可 裂解连接子的3′-O-改性的核苷酸类似物

相关申请案的交叉引用

本申请案要求2017年3月28日提交的美国临时申请案第62/477,947号的权利，其以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的。

遍及本申请案，参考各种公开案和专利案。这些参考文献的完整引用在紧接在权利要求书前的说明书的结尾处可见。这些公开案和专利案的公开内容在此以全文引用的方式并入本申请案中以更充分地描述本发明所涉及的现有技术水平。

背景技术

DNA测序是生物学和医学研究中的基本工具，并且对于个体化医疗尤其重要。已经研究各种新的DNA测序方法，其目的在于最终实现$1,000基因组的目标；主要方法是合成测序(SBS)，一种在聚合酶反应期间测定DNA序列的方法(Hyman 1988；罗纳吉等人1998；Ju等人2003；Li2003；Braslavsky等人2003；Ruparel等人2005；Margulies等人2005；Ju等人2006；Wu等人2007；Guo等人2008；Bentley等人2008；Harris等人2008；Eid等人2009；Rothberg等人2011)。当前广泛使用的高通量SBS技术(Bentley等人2008)使用先前研发的可裂解荧光核苷酸可逆终止子(NRT)测序化学方法(Ju等人2003；Ju等人2006)。这些可裂解荧光NRT是以下原理设计：四个核苷酸(A、C、G、T)中的每一个藉由使独特的可裂解荧光团连接到碱基的特定位置并且用小型可逆部分将3'-OH基团封端使得其仍被DNA聚合酶识别为底物来修饰。因此，可裂解荧光NRT涉及两个位点修饰(Ju等人2003；Ju等人2006)：荧光染料，其充当碱基上的报道基团，和小型化学部分，其用于将3'-OH封端以在用于序列测定的核苷酸并入之后暂时终止聚合酶反应。在并入和信号检测之后，荧光团裂解并且去除3'-OH封端部分以在下一循环中恢复聚合酶反应。已经证明这些可裂解荧光NRT是被重新工程改造的聚合酶的良好底物并且已经广泛用于下一代DNA测序系统中(Ju等人2006；Bentley等人2008)。此外，其使得能够精确测定均聚物序列，因为每个循环中仅鉴别一个碱基。

已经使用一种使用可裂解荧光核苷酸类似物作为可逆终止子以对表面固定的DNA进行测序的SBS方法(Ju等人2003；Li等人2003；Ruparel等人2005；Ju等人2006；Wu等人2007；Guo等人2008)。在这种方法中，在两个特定位置修饰核苷酸使得其仍被DNA聚合酶识别为底物：(i)具有不同荧光发射的不同荧光团经由可裂解连接子连接到四个碱基中的每一个的特定位置，和(ii)用小型化学可逆部分将3'-OH基团封端。DNA聚合酶仅并入与共价连接到表面的DNA模板上的碱基互补的单核苷酸类似物。在并入之后，检测独特的荧光发射以鉴别所并入的核苷酸。接着，去除荧光团并且以化学方式再生3'-OH基团，其使得能够进行聚合酶反应的下一循环。因为DNA芯片上的大表面可以具有高密度的不同的点状DNA模板，因此每个循环可以并行鉴别多个碱基，实现大量DNA分子的同时测序。先前研究成果已牢固地确立SBS的分子级策略，其通过使可裂解荧光染料连接到碱基并且用小型部分以可逆方式封端3'-OH来合理地修饰核苷酸。

已经报道一种具有未受保护的3'-OH和在碱基与荧光染料之间连接的可裂解二硫键连接子的核苷酸类似物(Turcatti等人2008；Mitra等人2003)。然而，在引物/模板上的DNA聚合酶催化的延伸反应和对所并入的碱基进行成像之后，二硫键的裂解产生游离反应性-SH基团，其必须在可以进行第二延伸反应之前用烷基化剂(如下文所示，碘乙酰胺)封端。这一封端步骤不仅在过程中增加额外步骤，而且由于核苷酸碱基部分上的长残留尾区而限制连续添加多个核苷酸。在这种方法中，测序读段长度仅限于10个碱基(Turcatti等人2008)。其它基于二硫键的方法需要类似的封端反应以使游离SH基团不发生反应(Mitra等人2003)。

对于长读段SBS策略，优选的是，可裂解连接子在测序反应期间稳定，需要较少的操作并且在裂解反应之后不在碱基上留存长尾区。

发明内容

本发明提供一种核苷酸类似物，其包含：(i)脱氧核糖或核糖，(ii)碱基，其连接到脱氧核糖或核糖的1'位置，其中所述碱基是选自由以下组成的组：A、T、C、G和U或其衍生物，(iii)阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，和(iv)可检测标记，其经由可裂解连接子结合于碱基。

本发明还提供一种组合物，其包含四种不同类型的核苷酸类似物，其中每种类型的核苷酸类似物包含：碱基，其选自由以下组成的组：A、T、C、G或U或其衍生物；脱氧核糖或核糖；和阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，以及

(i)第一类型的核苷酸类似物包含经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；

(ii)第二类型的核苷酸类似物包含经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(iii)第三类型的核苷酸类似物包含经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iv)第四类型的核苷酸类似物包含经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同。

本发明提供一种用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包含：

a)使单链核酸与核酸聚合酶和四种类型的加标签的核苷酸类似物在允许核酸聚合酶催化一种加标签的核苷酸类似物在其与单链核酸的核苷酸残基互补时并入引物的条件下接触，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，以便形成核酸延伸产物，

其中所述至少四种类型的加标签的核苷酸类似物中的每一种包含：碱基，其是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其各自的衍生物；脱氧核糖或核糖；和可裂解阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入，以及

(i)第一类型的核苷酸类似物包含第一类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；

(ii)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(iii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iv)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

其中第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且其中第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同；

b)鉴别在步骤(a)中是否并入包含第一类型或第二类型的可检测标记的核苷酸类似物；

c)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第一类型的连接子的工具接触；

d)测定在步骤(c)中标记是否被用于裂解的工具去除，以便由此测定所并入的核苷酸类似物的一致性；

e)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第二类型的连接子的工具接触；

f)使3'-氧阻断基团裂解以便由此形成3'-OH；

g)对被测序的单链核酸的每个核苷酸残基反复进行步骤(a)-(f)，其中在步骤(a)的每次重复中，如果加标签的核苷酸与单链核酸的核苷酸残基互补，那么将其并入由步骤(a)的前一次重复产生的核酸延伸产物，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与核酸延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，

以便由此测定单链核酸的核苷酸序列。

本发明提供一种用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包含：

a)使单链核酸与核酸聚合酶和第一类型的加标签的核苷酸类似物在允许核酸聚合酶催化加标签的核苷酸类似物在其与单链核酸的核苷酸残基互补时并入引物的条件下接触，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，以便形成DNA延伸产物，

其中加标签的核苷酸类似物包含第一类型的碱基，其是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其各自的衍生物；脱氧核糖或核糖；可裂解阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入；以及经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记，

并且如果未并入加标签的核苷酸，那么反复重复与第二、第三和第四类型的加标签的核苷酸类似物接触直到并入加标签的核苷酸类似物，其中

(i)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(ii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iii)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

其中第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且其中第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同；

b)鉴别在步骤(a)中是否并入包含第一类型或第二类型的可检测标记的核苷酸类似物；

c)使所并入的核苷酸类似物与用于裂解第一类型的连接子的工具接触；

d)测定在步骤(c)中可检测标记是否被用于裂解的工具去除，以便由此测定所并入的核苷酸类似物的一致性；

e)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第二类型的连接子的工具接触；

f)使3'-氧阻断基团裂解，以便由此形成3'-OH，

g)对被测序的单链核酸的每个核苷酸残基反复进行步骤(a)-(f)，其中在步骤(a)的每次重复中，如果加标签的核苷酸与单链核酸的核苷酸残基互补，那么将其并入由步骤(a)的前一次重复产生的核酸延伸产物，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与核酸延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，

以便由此测定单链核酸的核苷酸序列。

本发明提供一种用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包含：

a)使单链核酸与核酸聚合酶和四种类型的加标签的核苷酸类似物在允许核酸聚合酶催化一种加标签的核苷酸类似物在其与单链核酸的核苷酸残基互补时并入引物的条件下接触，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，以便形成核酸延伸产物，

其中所述至少四种类型的加标签的核苷酸类似物中的每一种包含：碱基，其是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其各自的衍生物；脱氧核糖或核糖；和阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入，以及

(i)第一类型的核苷酸类似物包含第一类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；

(ii)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(iii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iv)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

并且其中第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同；

b)在以下条件下，使单链核酸与四种类型的核苷酸可逆终止子在允许核酸聚合酶催化一个核苷酸可逆终止子并入引物的条件下接触，其中每个核苷酸可逆终止子包含针对脱氧核糖或核糖的3'-氧的阻断基团，其阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入：

(i)在步骤a)中聚合酶未能并入加标签的核苷酸类似物，

(ii)核苷酸可逆终止子与单链核酸的核苷酸残基互补，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，和

c)鉴别在步骤(a)中是否并入包含第一类型或第二类型的可检测标记的核苷酸类似物；

d)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第一类型的连接子的工具接触；

e)测定在步骤(c)中标记是否被用于裂解的工具去除，以便由此测定所并入的核苷酸类似物的一致性；

f)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第二类型的连接子的工具接触；

g)使3'-氧阻断基团裂解以便由此形成3'-OH；

h)对被测序的单链核酸的每个核苷酸残基反复进行步骤(a)-(g)，其中在步骤(a)的每次重复中，如果加标签的核苷酸与单链核酸的核苷酸残基互补，那么将其并入由步骤(a)的前一次重复产生的核酸延伸产物，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与核酸延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，

以便由此测定单链核酸的核苷酸序列。

本发明提供一种用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包含：

a)使单链核酸与核酸聚合酶和第一类型的加标签的核苷酸类似物在允许核酸聚合酶催化加标签的核苷酸类似物在其与单链核酸的核苷酸残基互补时并入引物的条件下接触，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，以便形成DNA延伸产物，

其中加标签的核苷酸类似物包含第一类型的碱基，其是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其各自的衍生物；脱氧核糖或核糖；阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入；以及经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记，

并且如果未并入加标签的核苷酸，那么反复重复与第二、第三和第四类型的加标签的核苷酸类似物接触直到并入加标签的核苷酸类似物，其中

(i)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(ii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iii)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

其中第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且其中第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同；

b)在以下条件下，使单链核酸与四种类型的核苷酸可逆终止子在允许核酸聚合酶催化一个核苷酸可逆终止子并入引物的条件下接触，其中每个核苷酸可逆终止子包含针对脱氧核糖或核糖的3'-氧的阻断基团，其阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入：

(i)在步骤a)中聚合酶未能并入加标签的核苷酸类似物，和

(ii)核苷酸可逆终止子与单链核酸的核苷酸残基互补，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'；

c)鉴别在步骤(a)中是否并入包含第一类型或第二类型的可检测标记的核苷酸类似物；

d)使所并入的核苷酸类似物与用于裂解第一类型的连接子的工具接触；

e)测定在步骤(c)中可检测标记是否被用于裂解的工具去除，以便由此测定所并入的核苷酸类似物的一致性；

f)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第二类型的连接子的工具接触；

g)使3'-氧阻断基团裂解，以便由此形成3'-OH，

h)对被测序的单链核酸的每个核苷酸残基反复进行步骤(a)-(g)，其中在步骤(a)的每次重复中，如果加标签的核苷酸与单链核酸的核苷酸残基互补，那么将其并入由步骤(a)的前一次重复产生的核酸延伸产物，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与核酸延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，

以便由此测定单链核酸的核苷酸序列。

本发明还提供用于核酸测序的试剂盒，其在分开的隔室中包含：

a)四种类型的加标签的核苷酸类似物，其中每种类型的加标签的核苷酸类似物包含选自由A、T、C、G或U或其衍生物组成的组的碱基；脱氧核糖或核糖；以及阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，和

(i)第一类型的核苷酸类似物包含第一类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；

(ii)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(iii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iv)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

其中第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同。

附图说明

图1：对于使用方案1中描述的方法的2色DNA SBS，3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-Dyes(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox和3'-O-SS-dUTP-5-SS-BodipyFL)和3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-Azo-Dyes(3'-O-SS-dGTP-7-Azo-Rox或3'-O-SS-dGTP-7-SS-Azo-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-Azo-BodipyFL或3'-O-SS-dCTP-5-SS-Azo-BodipyFL)。

图2：Azo连接子的合成和用于合成3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-Azo-Dye的一般方法。使用公认的重氮偶合反应合成Azo连接子分子的氨基酸衍生物。所得化合物与Dye NHS酯偶合，产生被染料标记的Azo连接子的酸衍生物，其可以通过用DSC和TEA处理而进一步转化成NHS酯。接着，使产物与3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-NH₂的氨基偶合，产生3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-Azo-Dye。

图3：3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-Azo-Rox和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-Azo-BodipyFL的合成实例。使被Rox和BodipyFL标记的Azo连接子NHS酯与3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-NH₂和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-NH₂偶合，产生3'-O-SS(DTM)-dGTP-SS-Azo-Rox和3'-O-SS(DTM)-dTTP-SS-Azo-BodipyFL。

图4：3'-O-SS(DTM)-dATP-SS-Rox的合成。

图5：3'-O-SS(DTM)-dUTP-SS-BodipyFL的合成。

图6：方案1：使用3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-Dyes(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-Azo-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-Azo-BodipyFL)进行2色DNA SBS。步骤1，向固定的预致敏DNA模板中添加DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-Azo-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-Azo-BodipyF)，使得能够将互补核苷酸类似物并入正在生长的DNA链以终止DNA合成。步骤2，追踪：向固定的预致敏DNA模板中添加DNA聚合酶和四个种3'-O-SS(DTM)-dNTPs(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)，使得能够将互补型3'-O-SS-核苷酸类似物并入集合中在步骤1中未延伸具有被染料标记的dNTP中的任一个的正在生长的DNA链的子集。用四种被染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或不具有染料的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种将正在生长的DNA链封端。步骤3，在洗去未并入的被染料标记的核苷酸之后，检测来自DNA产物上的每一种荧光染料的独特荧光信号，使得能够鉴别用于序列测定的所并入的核苷酸，Rox信号指示A和G的并入，BodipyFL信号指示T和C的并入。步骤4，通过向伸长的DNA链添加连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)使Azo连接子裂解，引起从所并入的G去除Rox和从所并入的C去除BodipyFL。步骤5，在洗去裂解的染料之后，进行DNA产物上的每种荧光染料的独特荧光信号的第二轮检测，使得能够鉴别用于序列测定的所并入的核苷酸。Rox信号消失指示G的并入，并且BodipyFL信号消失指示C的并入。保留Rox信号指示A的并入，并且保留BodipyFL信号指示T的并入。接着，在步骤6中，用THP处理DNA产物会使SS连接子裂解，引起去除残余的荧光染料和DNA延伸产物上游离3'-OH基团的再生，使DNA延伸产物准备用于DNA测序反应的下一循环。Azo基团与碱基之间存在另一个SS键会引起在THP处理之后，所并入的核苷酸上产生较短的疤痕，所述所并入的核苷酸应产生更长的读段。这一方案中使用的被修饰的核苷酸的结构展示于图1中。

具体实施方式

虽然已在本文中展示和描述了本发明的各种实施例，但所属领域的技术人员应显而易见，这类实施例是仅作为实例而提供。可在不脱离本发明的情况下进行多种变化、改变和替代。应理解，可以使用本文中描述的本发明的实施例的各种替代例。

术语

如本文中所使用，并且除非另外说明，否则以下术语中的每一个都应具有下文所阐述的定义。

A-腺嘌呤；

C-胞嘧啶；

G-鸟嘌呤；

T-胸腺嘧啶；

U-尿嘧啶；

DNA-脱氧核糖核酸；

RNA-核糖核酸；

除非另外说明，否则“核酸”应意指任何核酸分子，包括(但不限于)DNA、RNA和其杂合物。在一个实施例中，形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及其衍生物。

这些碱基的衍生物是所属领域中众所周知的，并且例示于《PCR系统、试剂以及消费品(PCR Systems,Reagents and Consumables)》(《珀金埃尔默目录(Perkin ElmerCatalogue)》1996-1997,Roche Molecular Systems,Inc.,Branchburg,New Jersey,USA)中。

“核苷酸残基”是呈在并入聚核苷酸中并且由此变成聚核苷酸的单体之后所存在的状态的单核苷酸。因此，核苷酸残基是聚核苷酸(例如DNA)的核苷酸单体，其经由其糖的3'位置处的磷酸二酯键结合于聚核苷酸的相邻核苷酸单体，并且经由其磷酸酯基结合于第二相邻核苷酸单体，但以下除外：(i)3'端核苷酸残基通过来自其磷酸酯基的磷酸二酯键仅结合于聚核苷酸的一个相邻核苷酸单体，和(ii)5'端核苷酸残基通过来自其糖的3'位置的磷酸二酯键仅结合于聚核苷酸的一个相邻核苷酸单体。

“底物”或“表面”应意指核酸或试剂可附着的以固相形式存在的任何适合的培养基。非限制性实例包括芯片、珠粒、纳米孔结构和柱。在一个实施例中，固体底物可存在于溶液(包括水性溶液、凝胶或流体)中。

“杂交”应意指基于充分理解的序列互补性原理使一个单链核酸粘接到另一核酸。在一个实施例中，另一核酸是单链核酸。核酸之间杂交的倾向取决于其环境的温度和离子强度、核酸的长度以及互补性程度。这些参数对杂交的影响是所属领域中众所周知的(参见Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.1989.《分子克隆：实验指南(Molecular cloning:alaboratory manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)。如本文中所使用，引物序列或DNA延伸产物与另一核酸的杂交应意指充分粘接使得引物或DNA延伸产物分别可以通过与能够形成磷酸二酯键的可用的核苷酸或核苷酸类似物产生磷酸二酯键而延伸。

如本文中所使用，除非另外说明，否则“独特的”或“不同于”另一碱基或所列举的碱基清单的碱基应意指所述碱基具有与另一碱基或其它碱基不同的结构。举例来说，“独特的”或“不同于”腺嘌呤、胸嘧啶和胞嘧啶的碱基可以包括鸟嘌呤碱基或尿嘧啶碱基。

如本文中所使用，除非另外说明，否则“不同于”参考分子的标记或标签部分的标记或标签部分意指所述标记或标签部分具有与另一/参考标记或标签部分的化学结构不同的化学结构。

如本文中所使用，除非另外说明，否则“引物”意指满足以下条件的寡核苷酸：在与聚核苷酸模板形成双螺旋时，能够充当聚合酶并入点并且从其3'端沿模板延伸，由此产生延伸的双螺旋。

如本文中所使用，“烷基”包括具有指定数目的碳原子的支链和直链饱和脂肪族烃基，并且可以是未被取代或被取代的。因此，如“C1-Cn烷基”中的C1-Cn包括呈直链或支链排列形式的具有1、2、……、n-1或n个碳的基团。举例来说，“C1-C5烷基”包括呈直链或支链排列形式的具有1、2、3、4或5个碳原子的基团，并且尤其包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基以及戊基。

如本文中所使用，“烯基”是指直链或支链非芳香族烃基，其含有至少1个碳-碳双键且可能存在多达最大可能数目的非芳香族碳-碳双键，并且可以是未被取代或被取代的。举例来说，“C2-C5烯基”意指分别具有2、3、4或5个碳原子和最多1、2、3或4个碳-碳双键的烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基和丁烯基。

术语“炔基”是指直链或支链烃基，其含有至少1个碳-碳三件且可能存在多达最大可能数目的非芳香族碳-碳三键，并且可以是未被取代或被取代的。因此，“C2-C5炔基”意指具有2或3个碳原子和1个碳-碳三键或具有4或5个碳原子和最多2个碳-碳三键的炔基。炔基包括乙炔基、丙炔基和丁炔基。

术语“被取代的”是指其中至少一个与其中所含的氢原子的键由与非氢或非碳原子的键置换的如上文所描述的官能团，如烷基或烃基，限制条件是保持正常价数并且所述取代产生稳定的化合物。被取代的基团还包括其中与碳或氢原子的一个或多个键由与杂原子的一个或多个键(包括双或三键)置换的基团。取代基的非限制性实例包括上文所描述的官能团，和例如N，例如以便形成-CN。

本文中公开核苷酸类似物，其含有3'-O-烷基二硫基甲基(3′-O-DTM)阻断基团和经由DTM或其它可裂解连接子(Azo、烯丙基、2-硝基苯甲基、叠氮基甲基或二甲基缩酮)连接到碱基的荧光团。两种核苷酸在碱基上具有DTM连接子并且另两种核苷酸在碱基上具有替代性连接子。一种具有DTM连接子的核苷酸具有连接的Dye1并且另一种具有DTM连接子的核苷酸具有连接的Dye2。类似地，一种具有Azo连接子的核苷酸具有连接的Dye1并且另一种具有Azo连接子的核苷酸具有连接的Dye 2。因此，染料以正交方式连接到连接子。在并入以上核苷酸集合之后，将进行成像以指示已并入哪两个可能的核苷酸，但不特定地指示哪一个。接着，Azo连接子和其连接的染料的裂解以及第二轮成像将测定所并入的确切核苷酸。如果染料被去除，那么并入具有Azo连接子的核苷酸。如果保留染料，那么并入在碱基上具有SS连接子的核苷酸。最终，DTM连接子的裂解将去除碱基上残留的任何荧光团以及恢复3'-OH基团以用于合成测序(SBS)的后续循环。

本发明提供用于核酸测序的方法，其包含：a)通过将被荧光标记的核苷酸并入致敏DNA链来延伸所述致敏链；和b)鉴别被荧光标记的核苷酸，以便对核酸进行测序。

在另一实施例中，所述被荧光标记的核苷酸具有连接到碱基的标记和3'-羟基上的可裂解阻断基团。

在另一实施例中，标记经由可裂解连接子连接到碱基。

在另一实施例中，3'OH阻断基团经由可裂解连接子连接到脱氧核糖。在另一实施例中，可裂解连接子包含正交可化学裂解连接子。在另一实施例中，正交可化学裂解连接子包含二硫基甲基SS(DTM)、Azo、烯丙基、2-硝基苯甲基和二甲基缩酮。在另一实施例中，3'OH阻断基团包含SS(DTM)、叠氮基甲基、Azo、烯丙基和2-硝基苯甲基。

在另一实施例中，核苷酸类似物包含脱氮嘌呤碱基。

本发明还提供核酸测序方法，其包含：a)提供与引物杂交的核酸模板；b)用被荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物延伸与所述核酸模板杂交的引物，其中所述被荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物具有连接到碱基的标记和3'-羟基上的阻断基团；和c)鉴别被荧光标记的核苷酸，以便对核酸进行测序。

在另一实施例中，所述被荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物具有碱基上的标记和3'-羟基上的阻断基团。在另一实施例中，标记经由可裂解连接子连接到碱基。

在另一实施例中，核苷酸类似物包含脱氮嘌呤碱基。

在另一实施例中，标记经由可裂解连接子连接到碱基。在另一实施例中，3'OH阻断基团经由可裂解连接子连接到脱氧核糖。在另一实施例中，可裂解连接子包含正交可化学裂解连接子。在另一实施例中，正交可化学裂解连接子包含二硫基甲基SS(DTM)、Azo、烯丙基和2-硝基苯甲基。在另一实施例中，3'OH阻断基团包含SS(DTM)、叠氮基甲基、Azo、烯丙基、2-硝基苯甲基和二甲基缩酮。

本发明还提供同时对多个不同核酸进行测序的方法，其包含：a)通过并入被荧光标记的核苷酸来延伸与模板DNA杂交的多个致敏DNA链，所述模板DNA各自包含一个所述致敏DNA链；和b)鉴别每个被荧光标记的核苷酸，以便同时对多个不同核酸进行测序。

在另一实施例中，所述被荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物具有碱基上的标记和3'-羟基上的阻断基团。

在另一实施例中，标记经由可裂解连接子连接到碱基。在另一实施例中，核苷酸类似物包含脱氮嘌呤碱基。在另一实施例中，标记经由可裂解连接子连接到碱基。在另一实施例中，3'OH阻断基团经由可裂解连接子连接到脱氧核糖。在另一实施例中，可裂解连接子包含正交可化学裂解连接子。在另一实施例中，正交可化学裂解连接子包含二硫基甲基SS(DTM)、Azo、烯丙基、2-硝基苯甲基和二甲基缩酮。在另一实施例中，3'OH阻断基团包含SS(DTM)、叠氮基甲基、Azo、烯丙基和2-硝基苯甲基。

在另一实施例中，核苷酸类似物包含脱氮嘌呤碱基。

本发明提供一种核苷酸类似物，其包含：(i)脱氧核糖或核糖，(ii)碱基，其连接到脱氧核糖或核糖的1'位置，其中所述碱基是选自由以下组成的组：A、T、C、G和U或其衍生物，(iii)阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，和(iv)可检测标记，其经由可裂解连接子结合于碱基。

在另一实施例中，阻断基团经由可裂解连接子连接到核糖或脱氧核糖。在另一实施例中，连接到阻断基团的可裂解连接子包含正交可化学裂解连接子。在另一实施例中，阻断基团包含二硫基甲基、叠氮基甲基、偶氮基、烯丙基及/或2-硝基苯甲基。在另一实施例中，阻断基团包含烷基二硫基甲基。在另一实施例中，碱基是脱氮嘌呤碱基。

在另一实施例中，连接到碱基的可裂解连接子包含正交可化学裂解连接子。在另一实施例中，连接到碱基的可裂解连接子是烷基二硫基甲基连接子、偶氮基连接子、烯丙基连接子、硝基苯甲基连接子、叠氮基甲基连接子和/或二甲基缩酮连接子。在另一实施例中，可检测标记是染料、荧光团、荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、电泳、单核苷酸、寡核苷酸中的一种或多种，或其组合。在另一实施例中，可检测标记是荧光团。在另一实施例中，可检测标记是BodipyFL、R6G、ROX、Cy5或Alexa488。在另一实施例中，核苷酸类似物是3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-Azo-Rox或3'-O-SS-dCTP-5-Azo-BodipyFL。

在另一实施例中，可裂解连接子是烷基二硫基甲基连接子。在另一实施例中，核苷酸类似物具有以下结构：

在另一实施例中，可裂解连接子是偶氮基连接子。在另一实施例中，核苷酸类似物具有以下结构：

本发明还提供一种组合物，其包含四种不同类型的核苷酸类似物，其中每种类型的核苷酸类似物包含：碱基，其选自由以下组成的组：A、T、C、G或U或其衍生物；脱氧核糖或核糖；和阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，以及

(i)第一类型的核苷酸类似物包含经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；

(ii)第二类型的核苷酸类似物包含经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(iii)第三类型的核苷酸类似物包含经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iv)第四类型的核苷酸类似物包含经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同。

在另一实施例中，阻断基团经由可裂解连接子连接到核糖或脱氧核糖。在另一实施例中，连接到阻断基团的可裂解连接子包含正交可化学裂解连接子。在另一实施例中，阻断基团包含二硫基甲基、叠氮基甲基、偶氮基、烯丙基及/或2-硝基苯甲基。在另一实施例中，阻断基团包含烷基二硫基甲基。

在另一实施例中，第一、第二、第三和/或第四类型的核苷酸类似物中的一个或多个的碱基包含脱氮嘌呤碱基。在另一实施例中，第一碱基是A或其衍生物，和：

(i)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(iii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，或

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是T/U或其衍生物，和：

(i)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(iii)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，或

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是C或其衍生物，和：

(i)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(iii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是G或其衍生物，和：

(i)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(ii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(iii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(iv)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(v)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，或

(vi)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

在另一实施例中，第一类型的连接子和/或第二类型的连接子包含正交可化学裂解连接子。

在另一实施例中，第一和/或第二类型的连接子包含烷基二硫基甲基连接子、偶氮基连接子、烯丙基连接子、硝基苯甲基连接子、叠氮基甲基连接子和/或二甲基缩酮连接子中的一种或多种。在另一实施例中，第一和/或第二类型的连接子为可化学裂解或可光裂解的。在另一实施例中，第一和/或第二类型的连接子可以被水溶性膦裂解，由此产生3'-OH。在另一实施例中，水溶性膦是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)或三(羟基丙基)膦(THP)。在另一实施例中，第一和/或第二类型的连接子可以被连二亚硫酸钠裂解。

在另一实施例中，第一和/或第二类型的可检测标记是染料、荧光团、荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、电泳、单核苷酸、寡核苷酸中的一种或多种，或其组合。在另一实施例中，第一和/或第二类型的可检测标记是荧光团。在另一实施例中，第一和/或第二类型的可检测标记是BodipyFL、R6G、ROX、Cy5或Alexa488。

在另一实施例中，组合物包含3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-Azo-Rox或3'-O-SS-dCTP-5-Azo-BodipyFL中的一种或多种。

在另一实施例中，第一类型的连接子是烷基二硫基甲基连接子并且第二类型的连接子是偶氮基连接子。在另一实施例中，核苷酸类似物是选自包含以下的组：

本发明提供一种用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包含：

a)使单链核酸与核酸聚合酶和四种类型的加标签的核苷酸类似物在允许核酸聚合酶催化一种加标签的核苷酸类似物在其与单链核酸的核苷酸残基互补时并入引物的条件下接触，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，以便形成核酸延伸产物，

其中所述至少四种类型的加标签的核苷酸类似物中的每一种包含：碱基，其是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其各自的衍生物；脱氧核糖或核糖；和可裂解阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入，以及

(i)第一类型的核苷酸类似物包含第一类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；

(ii)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(iii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iv)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

其中第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且其中第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同；

b)鉴别在步骤(a)中是否并入包含第一类型或第二类型的可检测标记的核苷酸类似物；

c)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第一类型的连接子的工具接触；

d)测定在步骤(c)中标记是否被用于裂解的工具去除，以便由此测定所并入的核苷酸类似物的一致性；

e)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第二类型的连接子的工具接触；

f)使3'-氧阻断基团裂解以便由此形成3'-OH；

g)对被测序的单链核酸的每个核苷酸残基反复进行步骤(a)-(f)，其中在步骤(a)的每次重复中，如果加标签的核苷酸与单链核酸的核苷酸残基互补，那么将其并入由步骤(a)的前一次重复产生的核酸延伸产物，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与核酸延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，

以便由此测定单链核酸的核苷酸序列。

本发明提供一种用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包含：

a)使单链核酸与核酸聚合酶和第一类型的加标签的核苷酸类似物在允许核酸聚合酶催化加标签的核苷酸类似物在其与单链核酸的核苷酸残基互补时并入引物的条件下接触，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，以便形成DNA延伸产物，

其中加标签的核苷酸类似物包含第一类型的碱基，其是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其各自的衍生物；脱氧核糖或核糖；可裂解阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入；以及经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记，

并且如果未并入加标签的核苷酸，那么反复重复与第二、第三和第四类型的加标签的核苷酸类似物接触直到并入加标签的核苷酸类似物，其中

(i)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(ii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iii)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

其中第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且其中第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同；

b)鉴别在步骤(a)中是否并入包含第一类型或第二类型的可检测标记的核苷酸类似物；

c)使所并入的核苷酸类似物与用于裂解第一类型的连接子的工具接触；

d)测定在步骤(c)中可检测标记是否被用于裂解的工具去除，以便由此测定所并入的核苷酸类似物的一致性；

e)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第二类型的连接子的工具接触；

f)使3'-氧阻断基团裂解，以便由此形成3'-OH，

g)对被测序的单链核酸的每个核苷酸残基反复进行步骤(a)-(f)，其中在步骤(a)的每次重复中，如果加标签的核苷酸与单链核酸的核苷酸残基互补，那么将其并入由步骤(a)的前一次重复产生的核酸延伸产物，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与核酸延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，

以便由此测定单链核酸的核苷酸序列。

本发明提供一种用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包含：

a)使单链核酸与核酸聚合酶和四种类型的加标签的核苷酸类似物在允许核酸聚合酶催化一种加标签的核苷酸类似物在其与单链核酸的核苷酸残基互补时并入引物的条件下接触，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，以便形成核酸延伸产物，

其中所述至少四种类型的加标签的核苷酸类似物中的每一种包含：碱基，其是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其各自的衍生物；脱氧核糖或核糖；和阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入，以及

(i)第一类型的核苷酸类似物包含第一类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；

(ii)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(iii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iv)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

并且其中第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同；

b)在以下条件下，使单链核酸与四种类型的核苷酸可逆终止子在允许核酸聚合酶催化一个核苷酸可逆终止子并入引物的条件下接触，其中每个核苷酸可逆终止子包含针对脱氧核糖或核糖的3'-氧的阻断基团，其阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入：

(i)在步骤a)中聚合酶未能并入加标签的核苷酸类似物，

(ii)核苷酸可逆终止子与单链核酸的核苷酸残基互补，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，和

c)鉴别在步骤(a)中是否并入包含第一类型或第二类型的可检测标记的核苷酸类似物；

d)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第一类型的连接子的工具接触；

e)测定在步骤(c)中标记是否被用于裂解的工具去除，以便由此测定所并入的核苷酸类似物的一致性；

f)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第二类型的连接子的工具接触；

g)使3'-氧阻断基团裂解以便由此形成3'-OH；

h)对被测序的单链核酸的每个核苷酸残基反复进行步骤(a)-(g)，其中在步骤(a)的每次重复中，如果加标签的核苷酸与单链核酸的核苷酸残基互补，那么将其并入由步骤(a)的前一次重复产生的核酸延伸产物，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与核酸延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，

以便由此测定单链核酸的核苷酸序列。

本发明提供一种用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包含：

a)使单链核酸与核酸聚合酶和第一类型的加标签的核苷酸类似物在允许核酸聚合酶催化加标签的核苷酸类似物在其与单链核酸的核苷酸残基互补时并入引物的条件下接触，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，以便形成DNA延伸产物，

其中加标签的核苷酸类似物包含第一类型的碱基，其是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其各自的衍生物；脱氧核糖或核糖；阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入；以及经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记，

并且如果未并入加标签的核苷酸，那么反复重复与第二、第三和第四类型的加标签的核苷酸类似物接触直到并入加标签的核苷酸类似物，其中

(i)第二类型的核苷酸类似物包含第二类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(ii)第三类型的核苷酸类似物包含第三类型的碱基和经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iii)第四类型的核苷酸类似物包含第四类型的碱基和经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

其中第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且其中第一类型的可检测标记与第二类型的可检测标记不同；

b)在以下条件下，使单链核酸与四种类型的核苷酸可逆终止子在允许核酸聚合酶催化一个核苷酸可逆终止子并入引物的条件下接触，其中每个核苷酸可逆终止子包含针对脱氧核糖或核糖的3'-氧的阻断基团，其阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入：

(i)在步骤a)中聚合酶未能并入加标签的核苷酸类似物，和

(ii)核苷酸可逆终止子与单链核酸的核苷酸残基互补，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与引物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'；

c)鉴别在步骤(a)中是否并入包含第一类型或第二类型的可检测标记的核苷酸类似物；

d)使所并入的核苷酸类似物与用于裂解第一类型的连接子的工具接触；

e)测定在步骤(c)中可检测标记是否被用于裂解的工具去除，以便由此测定所并入的核苷酸类似物的一致性；

f)使所并入的加标签的核苷酸类似物与用于裂解第二类型的连接子的工具接触；

g)使3'-氧阻断基团裂解，以便由此形成3'-OH，

h)对被测序的单链核酸的每个核苷酸残基反复进行步骤(a)-(g)，其中在步骤(a)的每次重复中，如果加标签的核苷酸与单链核酸的核苷酸残基互补，那么将其并入由步骤(a)的前一次重复产生的核酸延伸产物，所述单链核酸的核苷酸残基紧邻与核酸延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的单链核酸的核苷酸残基位于5'，

以便由此测定单链核酸的核苷酸序列。

在另一实施例中，核苷酸可逆终止子的3'-氧阻断基团通过至少一个正交可化学裂解连接子结合于3'-氧。在另一实施例中，核苷酸可逆终止子的阻断基团包含二硫基甲基、叠氮基甲基、偶氮基、烯丙基和/或2-硝基苯甲基。在另一实施例中，核苷酸可逆终止子的阻断基团包含烷基二硫基甲基。在另一实施例中，核苷酸可逆终止子的阻断基团是化学裂解或光裂解。在另一实施例中，核苷酸可逆终止子的阻断基团是被水溶性膦裂解，由此产生3'-OH。在另一实施例中，水溶性膦是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)或三(羟基丙基)膦(THP)。

在另一实施例中，核苷酸可逆终止子是3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP以及3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)。

在另一实施例中，核苷酸可逆终止子的阻断基团是被连二亚硫酸钠裂解。

在另一实施例中，加标签的核苷酸类似物的3'-氧阻断基团通过至少一个正交可化学裂解连接子结合于3'-氧。在另一实施例中，加标签的核苷酸类似物的阻断基团包含二硫基甲基、叠氮基甲基、偶氮基、烯丙基和/或2-硝基苯甲基。在另一实施例中，加标签的核苷酸类似物的阻断基团包含烷基二硫基甲基。

在另一实施例中，第一、第二、第三和/或第四类型的核苷酸类似物中的一个或多个的碱基包含脱氮嘌呤碱基。

在另一实施例中，第一碱基是A或其衍生物，和：

(i)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(iii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，或

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是T/U或其衍生物，和：

(i)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(iii)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，或

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是C或其衍生物，和：

(i)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(iii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，或

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是G或其衍生物，和：

(i)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(ii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(iii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(iv)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(v)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，或

(vi)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

在另一实施例中，第一类型的连接子和/或第二类型的连接子包含正交可化学裂解连接子。

在另一实施例中，第一和/或第二类型的连接子包含烷基二硫基甲基连接子、偶氮基连接子、烯丙基连接子、硝基苯甲基连接子、叠氮基甲基连接子和/或二甲基缩酮连接子中的一种或多种。

在另一实施例中，第一和/或第二类型的连接子为可化学裂解或可光裂解的。在另一实施例中，第一和/或第二类型的连接子可被水溶性膦裂解，由此产生3'-OH。在另一实施例中，水溶性膦是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)或三(羟基丙基)膦(THP)。在另一实施例中，第一和/或第二类型的连接子可以被连二亚硫酸钠裂解。

在另一实施例中，第一和/或第二类型的可检测标记是染料、荧光团、荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签、电泳、单核苷酸、寡核苷酸中的一种或多种，或其组合。在另一实施例中，第一和/或第二类型的可检测标记是荧光团。在另一实施例中，第一和/或第二类型的可检测标记是BodipyFL、R6G、ROX、Cy5或Alexa488。在另一实施例中，加标签的核苷酸是选自包含以下中的一个或多个的组：3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-Azo-Rox或3'-O-SS-dCTP-5-Azo-BodipyFL。

在另一实施例中，第一类型的连接子是烷基二硫基甲基连接子并且第二类型的连接子是偶氮基连接子。

在另一实施例中，加标签的核苷酸类似物是选自包含以下的组：

以及

本发明还提供用于核酸测序的试剂盒，其在分开的隔室中包含：

a)四种类型的加标签的核苷酸类似物，其中每种类型的加标签的核苷酸类似物包含选自由A、T、C、G或U或其衍生物组成的组的碱基；脱氧核糖或核糖；和阻断基团，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，和

(i)第一类型的核苷酸类似物包含经由第一类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；

(ii)第二类型的核苷酸类似物包含经由第二类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

(iii)第三类型的核苷酸类似物包含经由第二类型的连接子结合于碱基的第一类型的可检测标记；以及

(iv)第四类型的核苷酸类似物包含经由第一类型的连接子结合于碱基的第二类型的可检测标记；

其中每种类型的核苷酸具有不同的碱基，

b)第一类型的连接子与第二类型的连接子不同，并且第一类型和第二类型的可检测标记是适用于核酸聚合的不同试剂；以及

c)使用说明书。

在另一实施例中，第一类型的连接子是可裂解烯丙基连接子并且第二类型的连接子是可裂解偶氮基连接子或二硫基甲基连接子。

在另一实施例中，试剂盒进一步包含四种类型的核苷酸可逆终止子，其中每个核苷酸可逆终止子包含针对脱氧核糖或核糖的3'-氧的阻断基团，其阻止聚合酶催化后续核苷酸的并入。

在另一实施例中，第一碱基是A或其衍生物，和：

(i)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(iii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，或

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是T/U或其衍生物，和：

(i)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(iii)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，或

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是C或其衍生物，和：

(i)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(ii)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(iii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是G或其衍生物，

(iv)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是G或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(v)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，或

(vi)第二碱基是G或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

在另一实施例中，第一碱基是G或其衍生物，和：

(i)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(ii)第二碱基是C或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物，

(iii)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是A或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，

(iv)第二碱基是T/U或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是A或其衍生物，

(v)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是T/U或其衍生物，并且第四碱基是C或其衍生物，或

(vi)第二碱基是A或其衍生物，第三碱基是C或其衍生物，并且第四碱基是T/U或其衍生物。

本发明提供一种核苷酸类似物，其包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，和(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或替代性可裂解连接子(如Azo)结合于碱基。

本发明还提供一种组合物，其包含四种不同类型的具有结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧的烷基二硫基甲基的上述核苷酸类似物：(1)包含碱基与Dye1之间的可裂解Azo连接子的核苷酸；(2)包含碱基与Dye2之间的可裂解Azo连接子的核苷酸；(3)包含碱基与Dye1之间的可裂解DTM连接子的核苷酸；以及(4)包含碱基与Dye2之间的可裂解DTM连接子的核苷酸。

本发明还提供核酸测序方法，其包含：

a)提供

1)核酸，

2)核酸聚合酶，

3)能够与所述核酸杂交的引物，以及

4)四种不同的被标记的核苷酸类似物，各自包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，以及(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或Azo连接子结合于碱基，以及染料和可裂解连接子的四种直系同源组合：(1)可裂解Azo连接子和Dye1；(2)可裂解Azo连接子和Dye2；(3)可裂解DTM连接子和Dye1；以及(4)可裂解DTM连接子和Dye2；

b)将所述核酸聚合酶与所述核苷酸类似物中的一种或多种一起并入所述引物以产生延伸链；

c)检测每个并入的核苷酸类似物的所述独特可检测标记，以便由此在两个步骤中鉴别所述延伸链中的每个并入的核苷酸，

1)在并入之后进行成像以提供两个可能的核苷酸，

2)在用连二亚硫酸钠使Azo连接子裂解之后进行成像，以测定所并入的确切核苷酸；

d)使连接到3'-OH上的任何残留Dye和DTM阻断基团的DTM可裂解连接子裂解以准备用于下一循环；以及

e)重复步骤a)到d)；

由此对核酸进行测序。

本发明还提供用于核酸测序的试剂盒，其在分开的隔室中包含：

a)多个核苷酸类似物，各自包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，以及(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或偶氮基连接子结合于碱基，以及染料和可裂解连接子的四种直系同源组合：(1)可裂解偶氮基连接子和Dye1；(2)可裂解Azo连接子和Dye2；(3)可裂解DTM连接子和Dye1；以及(4)可裂解DTM连接子和Dye2；

b)适用于核酸聚合的试剂；以及

c)使用说明书。

本发明提供一种核苷酸类似物，其包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，和(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或替代性可裂解连接子(如Azo)结合于碱基。

本发明还提供一种组合物，其包含四种不同类型的具有结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧的烷基二硫基甲基的上述核苷酸类似物：(1)包含碱基与Dye1之间的可裂解Azo连接子的核苷酸；(2)包含碱基与Dye2之间的可裂解Azo连接子的核苷酸；(3)包含碱基与Dye1之间的可裂解DTM连接子的核苷酸；以及(4)包含碱基与Dye2之间的可裂解DTM连接子的核苷酸。

本发明还提供核酸测序方法，其包含：

a)提供

1)核酸，

2)核酸聚合酶，

3)能够与所述核酸杂交的引物，以及

4)四种不同的被标记的核苷酸类似物，各自包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，以及(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或Azo连接子结合于碱基，以及染料和可裂解连接子的四种直系同源组合：(1)可裂解2-硝基苯甲基(2NB)连接子和Dye1；(2)可裂解2NB连接子和Dye2；(3)可裂解DTM连接子和Dye1；以及(4)可裂解DTM连接子和Dye2；

b)将所述核酸聚合酶与所述核苷酸类似物中的一种或多种一起并入所述引物以产生延伸链；

c)检测每个并入的核苷酸类似物的所述独特可检测标记，以便由此在两个步骤中鉴别所述延伸链中的每个并入的核苷酸，

1)在并入之后进行成像以提供两个可能的核苷酸，

2)在用340nm光使2-硝基苯基连接子光裂解之后进行成像，以测定所并入的确切核苷酸；

d)使连接到3'-OH上的任何残留Dye和DTM阻断基团的DTM可裂解连接子裂解以准备用于下一循环；以及

e)重复步骤a)到d)；

由此对核酸进行测序。

本发明还提供用于核酸测序的试剂盒，其在分开的隔室中包含：

a)多个核苷酸类似物，各自包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，以及(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或2-硝基苯甲基(2NB)连接子结合于碱基，以及染料和可裂解连接子的四种直系同源组合：(1)可裂解2NB连接子和Dye1；(2)可裂解2NB连接子和Dye2；(3)可裂解DTM连接子和Dye1；以及(4)可裂解DTM连接子和Dye2；

b)适用于核酸聚合的试剂；以及

c)使用说明书。

本发明提供一种核苷酸类似物，其包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，和(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或替代性可裂解连接子(如Azo)结合于碱基。

本发明还提供一种组合物，其包含四种不同类型的具有结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧的烷基二硫基甲基的上述核苷酸类似物：(1)包含碱基与Dye1之间的可裂解2-硝基苯甲基(2NB)连接子的核苷酸；(2)包含碱基与Dye2之间的可裂解2NB连接子的核苷酸；(3)包含碱基与Dye1之间的可裂解DTM连接子的核苷酸；以及(4)包含碱基与Dye2之间的可裂解DTM连接子的核苷酸。

本发明还提供核酸测序方法，其包含：

a)提供

1)核酸，

2)核酸聚合酶，

3)能够与所述核酸杂交的引物，以及

4)四种不同的被标记的核苷酸类似物，各自包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，以及(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或Azo连接子结合于碱基，以及染料和可裂解连接子的四种直系同源组合：(1)可裂解烯丙基连接子和Dye1；(2)可裂解烯丙基连接子和Dye2；(3)可裂解DTM连接子和Dye1；以及(4)可裂解DTM连接子和Dye2；

b)将所述核酸聚合酶与所述核苷酸类似物中的一种或多种一起并入所述引物以产生延伸链；

c)检测每个并入的核苷酸类似物的所述独特可检测标记，以便由此在两个步骤中鉴别所述延伸链中的每个并入的核苷酸，

(i)在并入之后进行成像以提供两个可能的核苷酸，

(ii)在用Pd(0)使烯丙基连接子裂解之后进行成像，以测定所并入的确切核苷酸；

d)使连接到3'-OH上的任何残留Dye和DTM阻断基团的DTM可裂解连接子裂解以准备用于下一循环；以及

e)重复步骤a)到d)；

由此对核酸进行测序。

本发明还提供用于核酸测序的试剂盒，其在分开的隔室中包含：

a)多个核苷酸类似物，各自包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)烷基二硫基甲基部分，其结合于脱氧核糖或核糖的3'-氧，以及(iv)可检测标记，其经由二硫基甲基连接子或Azo连接子结合于碱基，以及染料和可裂解连接子的四种直系同源组合：(1)可裂解烯丙基连接子和Dye1；(2)可裂解烯丙基连接子和Dye2；(3)可裂解DTM连接子和Dye1；以及(4)可裂解DTM连接子和Dye2；

b)适用于核酸聚合的试剂；以及

c)使用说明书。

实验讨论

方案1：

使用3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-Dye(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-Azo-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-Azo-BodipyFL)进行2色DNA SBS。

步骤1，向固定的预致敏DNA模板中添加DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-O-SS-dATP-7-SS-Rox、3'-O-SS-dTTP-5-SS-BodipyFL、3'-O-SS-dGTP-7-Azo-Rox和3'-O-SS-dCTP-5-Azo-BodipyF)，使得能够将互补核苷酸类似物并入正在生长的DNA链以终止DNA合成。

步骤2，追踪：向固定的预致敏DNA模板中添加DNA聚合酶和四种3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)，使得能够将互补型3'-O-SS-核苷酸类似物并入集合中在步骤1中未延伸具有被染料标记的dNTP中的任一个的正在生长的DNA链的子集。用四种被染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或不具有染料的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种将正在生长的DNA链封端。

步骤3，在洗去未并入的被染料标记的核苷酸之后，检测来自DNA产物上的每一种荧光染料的独特荧光信号，使得能够鉴别用于序列测定的所并入的核苷酸，Rox信号指示A和G的并入，BodipyFL信号指示T和C的并入。

步骤4，通过向伸长的DNA链添加连二亚硫酸钠(Na2S2O4)使Azo连接子裂解，引起从所并入的G去除Rox和从所并入的C去除BodipyFL。

步骤5，在洗去裂解的染料之后，进行DNA产物上的每种荧光染料的独特荧光信号的第二轮检测，使得能够鉴别用于序列测定的所并入的核苷酸。Rox信号消失指示G的并入，并且BodipyFL信号消失指示C的并入。保留Rox信号指示A的并入，并且保留BodipyFL信号指示T的并入。

接着，在步骤6中，用THP处理DNA产物会使SS连接子裂解，引起去除残余的荧光染料和DNA延伸产物上游离3'-OH基团的再生，使DNA延伸产物准备用于DNA测序反应的下一循环。Azo基团与碱基之间存在另一个SS键会引起在THP处理之后，所并入的核苷酸上产生较短的疤痕，所述所并入的核苷酸应产生更长的读段。本方案中使用的被修饰的核苷酸的结构展示于图1中。

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