阅读说明：本技术 一种用于癌症预后检测试剂盒 (Kit for cancer prognosis detection ) 是由 叶定伟 于 2018-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于癌症预后检测试剂盒,试剂盒包括可检测ASPA、TMEM38B、PTGR2、TXLNB、ADGRE2表达水平的检测试剂；本发明提供了可高效预测癌症的预后的试剂盒。(The invention discloses a cancer prognosis detection kit, which comprises a detection reagent capable of detecting expression levels of ASPA, TMEM38B, PTGR2, TXLNB and ADGRE 2; the present invention provides a kit that can efficiently predict the prognosis of cancer.)

一种用于癌症预后检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医药卫生领域，尤其涉及一种用于癌症预后检测试剂盒。

背景技术

肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，学术名词全称为肾细胞癌。肾癌约占成人恶性肿瘤的2％～3％，占成人肾脏恶性肿瘤的80％～90％。世界范围内各国或各地区的发病率各不相同，总体上发达国家发病率高于发展中国家，城市地区高于农村地区，男性多于女性，男女患者比例约为2∶1，发病年龄可见于各年龄段，高发年龄50～70岁。据全国肿瘤防治研究办公室和***卫生统计信息中心统计我国试点市、县肿瘤发病及死亡资料显示我国肾癌发病率呈逐年上升趋势，至2008年已经成为我国男性恶性肿瘤发病率第10位。

外科手术治疗早期肾癌通常是首选治疗方法，也是目前被公认可治愈肾癌的手段。对早期肾癌患者可采用保留肾单位手术或根治性肾切除术。但是，早期和中期肾癌患者手术后尚无可推荐的辅助治疗方案用来有效预防复发或转移。当患者发生复发和转移后，可以采用新型靶向方案用于转移性肾癌患者的一线或二线治疗。但是这部分患者预后大多不佳。在临床工作中，如何区分高危和低危的肾癌患者，从而有目的性采用辅助治疗仍是一大难题。

功能基因组学(Functional genomics)又往往被称为后基因组学(Postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入对基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括:生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等。采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析，新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析(serialanalysis of gene expression,SAGE)，cDNA微阵列(cDNA microarray)，DNA芯片(DNAchip)和序列标志片段显示(sequence tagged fragments display，中科院曾邦哲提出，20th ICG德国柏林)技术、微流控芯片实验室等。

现有研究已经发现了大量的与肾癌预后相关基因，但是大多数现有研究都只有单个数据集，如2016年(Oncotarget)的一篇论文，A four-gene signature predictssurvival in clear-cell renal-cell carcinoma，只有TCGA一个数据集，缺乏验证，会有较大偏倚。而医学中的计算和数学方法杂志(Computational and Mathematical Methodsin Medicine)的一篇论文A Five-Gene Signature Predicts Prognosis in Patientswith Kidney Renal Clear Cell Carcinoma，公开了CKAP4，SLC40A1，OTOF，MAN2A2和ISPD共5个基因的表达用于预测肾透明细胞癌的预后的模型。该论文还公开了采用该模型预测肾癌的结果：发现集中HR值为0.37，95％CI：0.30-0.46，测试集中HR值为0.52，95％CI：0.43-0.62。

虽然现有技术公开了大量的与肾癌相关基因，但是肾癌相关基因在实际应用中用于评估肾癌的预后却受限。现有模型的预测效果仍有待增强，需要从大量的肾癌基因中建立能够更加精准预测肾癌风险的模型。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种多基因试剂盒。

本发明的一个方面，公开了一种用于癌症预后的多基因检测试剂盒，所述试剂盒包括可检测ASPA、TMEM38B、PTGR2、TXLNB、ADGRE2表达水平的检测试剂。

优选地，所述检测试剂为多核苷酸引物或探针。

优选地，多核苷酸引物的序列如SEQ ID NO:1-10所示。

优选地，其中所述癌症选自肾癌，优选的，所述试剂盒用于肾癌根治术后预后的评估。

优选地，本发明的癌症预后方法包括以下步骤：

(a)检测样本中ASPA、TMEM38B、PTGR2、TXLNB、ADGRE2的mRNA表达水平；

(b)根据步骤(a)获得的表达水平数据评估患者的癌症复发风险。

优选地，步骤(b)中通过以下方法评估患者的癌症复发风险：

风险值＝(1.6631×ASPA表达水平)+(0.2026×TMEM38B表达水平)+(0.1667×PTGR2表达水平)+(-2.3969×TXLNB表达水平)+(-2.0618×ADGRE2表达水平)，其中所述的表达水平为步骤(a)中检测获得的mRNA表达值。

优选的，所述检测mRNA表达水平的方法包括：Affymetrix/Illumina的芯片检测、全转录组鸟枪法测序、RT-PCR。

本发明的另一个方面，检测ASPA、TMEM38B、PTGR2、TXLNB、ADGRE2表达水平的检测试剂在制备用于癌症预后的产品中的用途。

优选地，本发明可用于肾癌预后预测，优选的，本发明可用于肾癌根治术后预后的评估。

优选地，所述癌症预后方法包括以下步骤：

(a)检测样本中ASPA、TMEM38B、PTGR2、TXLNB、ADGRE2的mRNA表达水平；

(b)根据步骤(a)获得的表达水平数据评估患者的癌症复发风险。

优选地，步骤(b)中通过以下方法评估患者的癌症复发风险：

风险值＝(1.6631×ASPA表达水平)+(0.2026×TMEM38B表达水平)+(0.1667×PTGR2表达水平)+(-2.3969×TXLNB表达水平)+(-2.0618×ADGRE2表达水平)，其中所述的表达水平为步骤(a)中检测获得的mRNA表达值。

优选的，所述检测mRNA表达量的方法包括：Affymetrix/Illumina的芯片检测、全转录组鸟枪法测序、RT-PCR。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：本发明的试剂盒和方法能够准确预测癌症预后后果，尤其是对于肾癌的高风险诊断具有较高的预测价值和重要的基础及临床价值和广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例的5个基因为基础的基因决策模型；

图2是本发明实施例的80例患者ROC曲线图；

图3是本发明实施例的80例患者生存曲线图；

图4是本发明实施例的515例患者ROC曲线图；

图5是本发明实施例的515例患者生存曲线图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

术语“癌症”和“癌”是指或者描述哺乳动物中通常以异常或失控的细胞生长为特征的生理状态。癌症和癌症病理可以伴随着例如转移、干扰邻近细胞的正常机能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌产物、抑制或加重炎性或免疫应答、瘤形成、癌前病变、恶性肿瘤、周围或远距离组织或器官如***的浸润等。尤其包括的是肾癌。

术语“预后”指对医学结果(medical outcome)，例如不良或良好结果的预测(例如长期存活的可能性)；消极的预后或不良结果包括复发、疾病进展(例如肿瘤生长或转移或耐药性)或死亡的预测。积极的预后或良好结果包括疾病好转(例如无疾状态)、改善(例如肿瘤消退)或稳定的预测。

本发明所述的ASPA，同SCI论文(Expression of aspartoacylase(ASPA)andCanavan disease.期刊年卷：Gene 2012 Sep 01；505(2))中的ASPA。

本发明所述的TMEM38B，同SCI论文(Absence of the ER Cation ChannelTMEM38B/TRIC-B Disrupts Intracellular Calcium Homeostasis and DysregulatesCollagen Synthesis in Recessive Osteogenesis Imperfecta..期刊年卷：PLoSGenet.2016 07；12(7))中的TMEM38B

本发明所述的PTGR2，同SCI论文(Targeting the 15-keto-PGE2-PTGR2axismodulates systemic inflammation and survival in experimental sepsis.期刊年卷：Free Radic.Biol.Med.2018 Feb 01；115)中的PTGR2。

本发明所述的TXLNB，同SCI论文(RNA interference targeting CUG repeats ina mouse model of myotonic dystrophy.期刊年卷：Mol.Ther.2013 Feb；21(2))中的TXLNB

本发明所述的ADGRE2，同SCI论文(Membrane-association of EMR2/ADGRE2-NTFis regulated by site-specific N-glycosylation.期刊年卷：Sci Rep 2018Mar 14；8(1))中的ADGRE2。

实施例1肾癌复发和/或存活后果或预后的评估模型的建立

通过从复旦大学附属肿瘤医院，筛选了80例肾癌患者作为发现集，通过RNA-seq即转录组测序技术从其中提取了相应的基因表达数据，应用Lasso Cox回归模型分析预测这些患者生化复发密切相关的基因。最终确定和构建了以5个基因为基础的基因决策模型(见图1)。并根据决策模型的风险，采用以下评分公式，得出风险值，将患者分为肾癌高危组和低危组。

风险值＝(1.6631×ASPA表达水平)+(0.2026×TMEM38B表达水平)+(0.1667×PTGR2表达水平)+(-2.3969×TXLNB表达水平)+(-2.0618×ADGRE2表达水平)。

决策基因mRNA表达值代入模型中计算出风险值，风险值大于0判定为肾癌高危组，风险值小于0判定为肾癌低危组。

将80例肾癌患者的风险值分别计算出，结合患者的临床资料，绘制ROC曲线，见图2，可见五年总体生存的AUC值为0.828。并根据risk score分为的肾癌高危组和低危组，绘制生存曲线，见图3，可见两组总体生存存在着显著差异，HR＝0.05,95％CI：0.01-0.24。

实施例2用于肾癌预后的多基因试剂盒

本实施例中用于肾癌预后的多基因试剂盒包括：

总RNA提取试剂Trizol；

氯仿(三氯甲烷)；

异戊醇；

无水乙醇；

DEPC水(DD1005)；

焦磷酸乙二酯(DEPC)；

抗RNA酶液(RNaseZap)；

反转录试剂盒；

iQ SYBR Green Supermix；

序列为SEQ ID NO:1-10的多核苷酸引物。

利用试剂盒对各基因进行实时定量PCR(qRT-PCR)检测后，初始数据结果以Ct值(cycle threshold)表示，即每个反应体系内的荧光信号达到设定的阈值所需要的循环数。每一样品的Ct值与该样品起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则Ct值越小。采用ΔΔCT法计算各基因mRNA表达水平，并进行标准化处理。

根据上述步骤获得的各基因mRNA表达水平，代入以下肾癌生化复发预测模型计算肾癌生化复发的风险值，风险值大于0判定为肾癌生化复发高危组，风险值小于0判定为肾癌生化复发低危组。

风险值＝(1.6631×ASPA表达水平)+(0.2026×TMEM38B表达水平)+(0.1667×PTGR2表达水平)+(-2.3969×TXLNB表达水平)+(-2.0618×ADGRE2表达水平)。

实施例3样本RNA的制备和预处理

(1)组织RNA提取实验用枪头、镊子在DEPC水中浸泡过夜后高温高压灭菌，预冷4℃离心机，实验台、移液枪、手套等用抗RNA酶液(RNase Zap)擦拭。

(2)组织匀浆取50～100mg组织样品，用无菌手术刀片稍切碎后置于1.5mL EP管中，加入500μL Trizol试剂，用电动组织研磨器充分匀浆，然后补充加入500μL Trizol试剂。

(3)每1mL Trizol试剂匀浆样品中加入0.2mL氯仿，盖紧EP管盖。剧烈振荡15秒，室温放置3min。4℃12,000rpm离心15min(提前预冷离心机)。离心后混合体系将分为上层的无色水相，中层的蛋白质和下层的红色酚氯仿相。DNA溶于氯仿分布于下层，RNA溶于水相分布于上层。水相的体积为匀浆时加入Trizol试剂体积的60％左右。

(4)RNA沉淀，将上层水相转移至新的EP管中。每1mL Trizol试剂匀浆样品中加入0.5mL异丙醇。混匀后室温放置10min，4℃下12,000rpm离心10min。离心后将在管壁底部和侧壁上可见白色沉淀物。

(5)RNA清洗，轻轻弃去上清，向每1mL Trizol试剂匀浆样品中加入1mL 75％的乙醇，清洗RNA沉淀。振荡，4℃下10,000rpm离心5min。

(6)RNA溶解，轻弃乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀约5～10min。注意切勿完全干燥RNA沉淀，否则将大大降低RNA的可溶性。溶解RNA时，加入适量无RNase的DEPC水，用移液枪反复吹打，确保RNA充分溶解后，将RNA溶液保存于-80℃冰箱。

(7)RNA浓度测定和质控，使用

ND-2000紫外分光光度计测定RNA溶液的浓度和纯度。

1)测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零；

2)用移液枪吸取2μL RNA样品滴加至测量基座的表面；

3)轻轻合上基座后，液滴会自动在上下基座之间形成液柱，完成测定后电脑中即显示RNA溶液的各种参数包括RNA浓度和纯度等。A260/A280的比值是一种常用的评估RNA纯度的参数，一般认为其比值范围1.8～2.1表示RNA纯度较好。

4)一次检测完成后，用擦镜纸轻轻擦去上下基座表面液体，即可进行下一个样品的检测

ii)琼脂糖凝胶电泳

1)制胶：称取1g琼脂糖加入100mL 1×TAE buffer中，置于微波炉加热至沸腾，灌制凝胶板，待胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加入适量的1×TAE buffer至液面完全覆盖胶面。

2)准备RNA样品：取3μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，再加EB于甲醛上样染液中至EB终浓度为10ug/mL，将体系加热至70℃孵育5min使样品变性。

3)电泳：上样后，5～6V/cm电压下电泳，至溴酚蓝指示剂进入胶内至少2～3cm。

4)紫外透射光下观察结果：经过变性RNA电泳后，在凝胶成像系统上可见28SrRNA、18S rRNA和5S rRNA三条带。观察到28S rRNA条带的强度约为18S rRNA的2倍，而且5SrRNA条带较弱，说明总RNA未发生明显降解。

实施例4决策基因mRNA检测

(1)采用全式金公司的TransScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix进行第一链cDNA的合成，反应体系的配制在冰上进行，反应体系如下：

(2)采用Bio-Rad公司的iQ SYBR Green Supermix进行实时定量PCR反应。一般引物终浓度为0.2μM可以得到较好的结果，反应性能不佳时，可在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度。

(3)反应体系

PCR引物分别为：ASPA基因的扩增引物为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2；

TMEM38B基因的扩增引物为：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；

PTGR2基因的扩增引物为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6；

TXLNB基因的扩增引物为：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8；

ADGRE2基因的扩增引物为：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。

(4)反应程序

(5)对各基因mRNA的表达进行定量

实时定量PCR反应结束后对Real time PCR扩增曲线及熔解曲线进行数据分析处理，初始数据结果以Ct值(cycle threshold)表示，即每个反应体系内的荧光信号达到设定的阈值所需要的循环数。每一样品的Ct值与该样品起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则Ct值越小。采用ΔΔCT法计算各基因mRNA表达水平。

实施例5肾癌预后预测模型与肾癌总体生存的相关性分析

采用本发明的试剂盒进行预测，对515例验证集的肾癌患者进行了验证，通过上述实施例的方法，将验证人群风险值计算出并分为高危组和低危组，绘制ROC曲线及生化复发曲线，见图4和图5，结果显示在验证人群中本发明的方法对肾癌患者总体预后有很强的预测价值，五年的总体生存ACU值分别为0.671，HR＝0.37,95％CI：0.27-0.52。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属肿瘤医院

<120> 一种用于癌症预后检测试剂盒

<141> 2018-06-20

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tgcgaccact cgttccatag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ctcagaaccc cttgaggctg 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcagatctgt cattgcaaag taac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aattctgctg aactaaagct caaa 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cccagctgga gtggatgttt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gggatagcgg gggaggataa 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atgaggctta caaaccaaca cg 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tgccttctcc tgaatcctca c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tgagcaacaa cgacacccaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atccattctg gccatgctcc 20