定量检测oc-stamp基因表达水平的成套试剂及其应用
阅读说明：本技术 定量检测oc-stamp基因表达水平的成套试剂及其应用 (Complete set of reagent for quantitatively detecting OC-STAMP gene expression level and application thereof ) 是由 阮国瑞 黄晓军 王子龙 周亚兰 吴利新 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了定量检测OC-STAMP基因表达水平的成套试剂及其应用。所述成套试剂包括由引物OC-FP和引物OC-RP组成的引物对甲、探针甲、由引物ABL1-F和引物ABL1-R组成的引物对乙、探针乙、阳性对照和内参对照质粒。所述引物OC-FP如序列1所示,所述引物OC-RP如序列2所示,所述探针甲如序列3所示,所述引物ABL1-F如序列4所示,所述引物ABL1-R如序列5所示,所述探针乙如序列6所示。本发明提供的成套试剂可定量检测OC-STAMP基因的表达水平,用于多发性骨髓瘤患者辅助诊断、病程进展和/或复发及缓解深度的监测,将在医学检测领域发挥重要的作用。(The invention discloses a complete set of reagent for quantitatively detecting OC-STAMP gene expression level and application thereof. The kit comprises a primer pair A consisting of a primer OC-FP and a primer OC-RP, a probe A, a primer pair B consisting of a primer ABL1-F and a primer ABL1-R, a probe B, a positive control and an internal reference control plasmid. The primer OC-FP is shown as a sequence 1, the primer OC-RP is shown as a sequence 2, the probe A is shown as a sequence 3, the primer ABL1-F is shown as a sequence 4, the primer ABL1-R is shown as a sequence 5, and the probe B is shown as a sequence 6. The kit provided by the invention can quantitatively detect the expression level of the OC-STAMP gene, is used for the auxiliary diagnosis of multiple myeloma patients, and monitoring the disease progression and/or recurrence and remission depth, and plays an important role in the field of medical detection.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及定量检测OC-STAMP基因表达水平的成套试剂及其应用，特别涉及定量检测OC-STAMP基因表达水平的引物对和探针及其在多发性骨髓瘤诊断中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是起源于浆细胞的第二常见的血液恶性肿瘤，占全部血液肿瘤的10-15％。骨髓瘤细胞在骨髓中恶性增殖并分泌单克隆免疫球蛋白，将会导致器官和组织损伤。骨髓浸润会导致正常造血受到抑制从而出现贫血、感染和出血症状。骨质中的浸润会刺激破骨细胞增强其溶骨作用，会导致骨痛、骨缺损、高钙血症和病理性骨折。本病好发于老年人，平均发病年龄70岁左右，男女比例为(1.6-3):1。目前MM的治疗以药物治疗为主。在预后分层和疗效评判方面，往往依靠细胞遗传学指标和生化指标，缺乏特异性的分子生物学标记物。
OC-STAMP(osteoclast stimulatory trans-membrane protein)是在破骨细胞中发现的新基因，其在单核细胞分化为破骨细胞的过程中表达被上调。OC-STAMP的基因表达产物与DC-STAMP(Dendrocyte Expressed Seven Transmembrane Protein)蛋白家族有高度的相似性，在其羧基末端保守，它的主要作用是作为破骨细胞的融合和分化过程中的关键分子。近期的研究表明OC-STAMP基因在RANKL(receptor activator of nuclearfactor-κB ligand)的诱导下编码一个细胞膜锚定受体，并且在单核细胞融合形成破骨细胞的过程中与DC-STAMP相互作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于多发性骨髓瘤辅助诊断的成套试剂。
本发明提供的用于多发性骨髓瘤辅助诊断的成套试剂包括引物对甲和探针甲；所述引物对甲由引物OC-FP和引物OC-RP组成；
所述引物对甲的靶序列含有特异DNA片段甲；所述特异DNA片段甲为序列表中序列7所示的DNA分子；
所述探针甲为20-35个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段甲中的部分区段相同或互补。
上述成套试剂中，所述引物OC-FP为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述引物OC-RP为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述探针甲为序列表中序列3所示的单链DNA分子。
上述成套试剂还包括引物对乙和探针乙；所述引物对乙由引物ABL1-F和引物ABL1-R组成；
所述引物对乙的靶序列含有特异DNA片段乙；所述特异DNA片段乙为序列表中序列8所示的DNA分子；
所述探针乙为20-35个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段乙中的部分区段相同或互补。
上述成套试剂中，所述引物ABL1-F为序列表中序列4所示的单链DNA分子；
所述引物ABL1-R为序列表中序列5所示的单链DNA分子；
所述探针乙为序列表中序列6所示的单链DNA分子。
上述成套试剂还包括阳性对照和/或内参对照质粒；
所述阳性对照为多发性骨髓瘤患者的骨髓单个核细胞的cDNA；
所述内参对照质粒为向克隆载体或表达载体***序列表中序列8所示的DNA分子后得到的重组质粒。所述克隆载体具体可为pMD18-T载体。
上述成套试剂中，所述探针甲的末端具有荧光标记；进一步的，所述探针甲的5’末端和3’末端具有荧光标记；更进一步的，所述探针甲的5’末端具有FAM荧光标记，3’末端具有BHQ荧光标记；
所述探针乙的末端具有荧光标记；进一步的，所述探针乙的5’末端和3’末端具有荧光标记；更进一步的，所述探针乙的5’末端具有FAM荧光标记，3’末端具有BHQ荧光标记。
上述成套试剂中，
所述引物OC-FP、所述引物OC-RP和所述探针甲的摩尔比可为90:90:25；
所述引物ABL1-F、所述引物ABL1-R和所述探针乙的摩尔比可为90:90:25。
上述任一所述成套试剂的制备方法也属于本发明的保护范围。
上述任一所述成套试剂的制备方法可为将所述引物OC-FP和/或所述引物OC-RP和/或所述探针甲和/或所述引物ABL1-F和/或所述引物ABL1-R和/或所述探针乙和/或所述阳性对照和/或所述内参对照质粒分别单独包装。
上述成套试剂在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围；所述产品的功能为如下K1)-K8)中至少一种：
K1)诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤；
K2)诊断或辅助诊断待测者是否为多发性骨髓瘤患者；
K3)鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为多发性骨髓瘤细胞；
K4)检测OC-STAMP基因；
K5)检测OC-STAMP基因的表达水平；
K6)预测或辅助预测多发性骨髓瘤的治疗效果；
K7)预测或辅助预测多发性骨髓瘤的病程进展和/或复发；
K8)预测或辅助预测多发性骨髓瘤的缓解深度。
本发明另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品包括上述成套试剂。
上述产品的功能为如下K1)-K8)中至少一种：
K1)诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤；
K2)诊断或辅助诊断待测者是否为多发性骨髓瘤患者；
K3)鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为多发性骨髓瘤细胞；
K4)检测OC-STAMP基因；
K5)检测OC-STAMP基因的表达水平；
K6)预测或辅助预测多发性骨髓瘤的治疗效果；
K7)预测或辅助预测多发性骨髓瘤的病程进展和/或复发；
K8)预测或辅助预测多发性骨髓瘤的缓解深度。
所述产品还包括具有如下X1)或X2)或X3)或X4)或X5)或X6)或X7)的数据处理和结论显示功能的装置：
X1)诊断或辅助诊断待测者是否为多发性骨髓瘤患者：检测待测者的cDNA和正常人的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平，如果待测者的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平高于正常人的cDNA，则待测者为或候选为多发性骨髓瘤患者；如果待测者的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平为正常人的cDNA以下，则待测者不为或候选不为多发性骨髓瘤患者；
X2)诊断或辅助诊断待测者是否为多发性骨髓瘤患者：检测待测者的cDNA和正常人的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平，如果待测者的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平高于正常人的cDNA，则待测者为或候选为多发性骨髓瘤患者；如果待测者的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平为正常人的cDNA以下，则待测者不为或候选不为多发性骨髓瘤患者；
X3)鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为多发性骨髓瘤细胞：检测待测细胞的cDNA和正常细胞的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平，如果待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平高于正常细胞的cDNA，则待测细胞为或候选为多发性骨髓瘤细胞；如果待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平为正常细胞的cDNA以下，则待测细胞不为或候选不为多发性骨髓瘤细胞；
X4)鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为多发性骨髓瘤细胞：检测待测细胞的cDNA和正常细胞的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平，如果待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平高于正常细胞的cDNA，则待测细胞为或候选为多发性骨髓瘤细胞；如果待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平为正常细胞的cDNA以下，则待测细胞不为或候选不为多发性骨髓瘤细胞；
X5)检测OC-STAMP基因的表达水平：包括以待测样本的cDNA为模板，采用上述成套试剂中引物对甲和探针甲进行RQ-PCR扩增的步骤；
X6)检测OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平：包括以待测样本的cDNA为模板，采用上述成套试剂中引物对甲和探针甲进行RQ-PCR扩增的步骤和采用上述成套试剂中引物对乙和探针乙进行RQ-PCR扩增的步骤；
X7)预测或辅助预测多发性骨髓瘤患者的缓解深度：按照X5)或X6)所述的方法，得到多发性骨髓瘤患者cDNA中OC-STAMP基因的表达水平或OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平：所述多发性骨髓瘤患者cDNA中OC-STAMP基因的表达水平或OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平越低，多发性骨髓瘤患者缓解深度越深。所述多发性骨髓瘤患者为初诊多发性骨髓瘤患者且经过治疗得到缓解的多发性骨髓瘤患者。
OC-STAMP基因作为标志物在制备开发诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂中的应用也属于本发明保护的范围。
如下Y1)或Y2)或Y3)或Y4)或Y5)或Y6)或Y7)也属于本发明保护的范围：
Y1)诊断或辅助诊断待测者是否为多发性骨髓瘤患者的方法：检测待测者的cDNA和正常人的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平，如果待测者的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平高于正常人的cDNA，则待测者为或候选为多发性骨髓瘤患者；如果待测者的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平为正常人的cDNA以下，则待测者不为或候选不为多发性骨髓瘤患者；
Y2)诊断或辅助诊断待测者是否为多发性骨髓瘤患者的方法：检测待测者的cDNA和正常人的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平，如果待测者的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平高于正常人的cDNA，则待测者为或候选为多发性骨髓瘤患者；如果待测者的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平为正常人的cDNA以下，则待测者不为或候选不为多发性骨髓瘤患者；
Y3)鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为多发性骨髓瘤细胞的方法：检测待测细胞的cDNA和正常细胞的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平，如果待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平高于正常细胞的cDNA，则待测细胞为或候选为多发性骨髓瘤细胞；如果待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平为正常细胞的cDNA以下，则待测细胞不为或候选不为多发性骨髓瘤细胞；
Y4)鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为多发性骨髓瘤细胞的方法：检测待测细胞的cDNA和正常细胞的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平，如果待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平高于正常细胞的cDNA，则待测细胞为或候选为多发性骨髓瘤细胞；如果待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平为正常细胞的cDNA以下，则待测细胞不为或候选不为多发性骨髓瘤细胞；
Y5)检测OC-STAMP基因的表达水平的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用上述成套试剂中引物对甲和探针甲进行RQ-PCR扩增的步骤；
Y6)检测OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用上述成套试剂中引物对甲和探针甲进行RQ-PCR扩增的步骤和采用上述成套试剂中引物对乙和探针乙进行RQ-PCR扩增的步骤；
Y7)预测或辅助预测多发性骨髓瘤患者缓解深度的方法，包括如下步骤：按照X5)或X6)所述的方法，得到多发性骨髓瘤患者cDNA中OC-STAMP基因的表达水平或OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平：所述多发性骨髓瘤患者cDNA中OC-STAMP基因的表达水平或OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平越低，缓解深度越深。所述多发性骨髓瘤患者为初诊多发性骨髓瘤患者且经过治疗得到缓解的多发性骨髓瘤患者。
上述特异DNA片段甲也属于本发明的保护范围。
上述任一所述待测者的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平高于正常人的cDNA，具体可为待测者的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平显著高于正常人的cDNA。
上述任一所述待测者的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平高于正常人的cDNA，具体可为待测者的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平显著高于正常人的cDNA。
上述任一所述待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平高于正常细胞的cDNA，具体可为待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因的表达水平显著高于正常细胞的cDNA。
上述任一所述待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平高于正常细胞的cDNA，具体可为待测细胞的cDNA中OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平显著高于正常细胞的cDNA。
上述任一所述OC-STAMP基因参比内参基因的相对表达水平具体可为OC-STAMP的表达量与内参基因的表达量之比。
上述任一所述OC-STAMP基因的表达量和上述任一所述内参基因的表达量均可为根据标准曲线和CT值得到的拷贝数。
所述内参基因可为人ABL1基因等。
上述任一所述OC-STAMP基因序列如序列表中序列9所示。
本发明申请人前期通过基因芯片技术筛查6名MM患者与6名正常人骨髓细胞差异表达基因，发现MM患者骨髓细胞中异常高表达OC-STAMP基因，本发明中申请人设计了用于定量检测OC-STAMP基因的引物对和探针，并在大量MM患者中对该结果进行验证，验证结果表明，OC-STAMP基因的表达水平可用于多发性骨髓瘤患者的诊断/辅助诊断、病程进展/复发及缓解深度的监测，将在医学检测领域发挥重要的作用。
附图说明
图1为内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线。
图2为阳性对照cDNA的RQ-PCR荧光标准曲线。
图3为OC-STAMP基因在MM不同疾病状态标本和健康对照标本中的表达情况。
图4为OC-STAMP基因的表达水平的变化与患者疾病状态的关系。
图5为OC-STAMP基因的表达水平与缓解深度的关系。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的生物材料、试剂及其来源如下：
下述实施例中的多发性骨髓瘤诊断及分期标准参照文献：Greipp PR，San MiguelJ，Durie BG,et al.International Staging System for Multiple Myeloma.Journal ofClinical Oncology,2005,15:3412-3420.。疗效的评价标准(包括缓解深度的分组标准)参照文献：Durie BG,Harousseau JL,Miguel JS,et al.International uniform responsecriteria for multiple myeloma.Leukemia.2006,20:1467-1473.中的方法。
下述实施例中的数据结果应用SPSS22.0、Graphpad Prism 7进行统计学分析。两组数据差异性的比较，分类变量数据采用卡方检验，连续变量数据采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
实施例1、特异性引物对和探针的设计与合成
一、特异性引物对和探针的设计
针对OC-STAMP基因(NCBI基因库序列号：NM_080721.3)设计的特异性引物对甲(由上游引物OC-FP和下游引物OC-RP组成，扩增产物大小为101bp，其核苷酸序列如序列7所示)和探针甲(探针OC-T-probe)：
上游引物OC-FP：5'-TGTGGACTGGGCTCAGAAGTT-3’(序列表的序列1)；
下游引物OC-RP：5'-TTCATCCCTTTCCTCTTCAACC-3’(序列表的序列2)；
探针OC-T-probe：FAM-CACGGTCAAGTATGATGTGGCATACACTGTC-BHQ(核苷酸序列为序列表的序列3)。
针对ABL1基因(内参基因；NCBI基因库序列号：NM_005157)设计的特异性引物对乙(由上游引物ABL1-F和下游引物ABL1-R组成，扩增产物大小为124bp，其核苷酸序列如序列8所示)和探针乙(探针ABL1-T-probe)：
上游引物ABL1-F：5'-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’(序列表的序列4)；
下游引物ABL1-R：5'-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’(序列表的序列5)；
探针ABL1-T-probe：FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-BHQ(核苷酸序列为序列表的序列6)。
二、特异性引物对和探针的合成
分别合成步骤一设计的特异性引物对甲、探针甲、特异性引物对乙和探针乙。特异性引物对乙和探针乙可参考文献“Gabert J,Beillard E,van der Velden VH,etal.Standardization and quality control studies of'real-time'quantitativereverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcriptsfor residual disease detection in leukemia-a Europe Against Cancerprogram.Leukemia.2003，17:2318-57.”中的合成方法。
实施例2、特异性引物对和探针检测阳性对照细胞的灵敏度检测
一、相关阳性对照/质粒的制备
1、阳性对照cDNA(含有OC-STAMP基因片段的cDNA)的制备
以OC-STAMP基因表达阳性的多发性骨髓瘤患者的骨髓单个核细胞的cDNA为阳性对照。
2、内参对照质粒(含有ABL1基因片段的质粒)的制备
以正常人(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，采用上游引物：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’和下游引物：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列8所示(124bp)，扩增产物经纯化后，克隆入pMD18-T质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，将测序正确的质粒记作内参对照质粒。
内参对照质粒为将序列8所示的DNA分子***pMD18-T质粒的ECOR V酶切位点间得到的载体。
3、阴性对照质粒
pMD18-T质粒。
二、阳性对照cDNA的灵敏度检测
将步骤一得到的阳性对照cDNA用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个稀释液(每微升分别含有104、103、102、101、100个拷贝的OC-STAMP基因片段)；将实施例2得到的内参对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个稀释液(每微升分别含有106、105、104、103、102、101、100个拷贝的ABL1基因片段)；通过测定吸光度值计算OC-STAMP基因片段或ABL1基因片段的拷贝数。
将各个阳性对照cDNA稀释液采用实施例1得到的特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。将各个内参对照质粒采用实施例1得到的特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。
PCR反应体系(10μl)：上游引物0.9μM，下游引物0.9μM，探针0.25μM，2×TaqMan通用PCR公共体系5μl(ABI公司，美国)，质粒1μl；其余为去离子水。
PCR反应条件：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃1min，40个循环。
内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线见图1(阈值为0.082)，函数为log10 ABL1＝(Ct-38.57)/-3.3，相关系数均达到0.99以上，检测内参基因的灵敏度达10个拷贝。阳性对照cDNA的RQ-PCR荧光标准曲线见图2(阈值为0.082)，函数为log10OC-STAMP＝(Ct-41.37)/-3.6，相关系数均达到0.99以上，检测OC-STAMP基因片段的灵敏度可达10个拷贝。
实施例3、检测细胞系及多发性骨髓瘤患者
一、试剂盒的组装
试剂盒由如下组件组成：实施例1制备的针对OC-STAMP基因的特异性引物对甲和探针甲、针对ABL1基因的特异性引物对乙和探针乙；实施例2制备的阳性对照cDNA和内参对照质粒。
二、应用步骤一的试剂盒检测细胞系
分别检测各个细胞系中的OC-STAMP基因的表达水平。每个细胞系样本皆重复检测3次。具体步骤如下：
1、提取各个细胞的总RNA，反转录为cDNA。
2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为0.082。
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例2。
分别用阳性对照cDNA和内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各细胞系中OC-STAMP基因和ABL1基因的拷贝数。以OC-STAMP基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示OC-STAMP基因的相对表达水平(％)。
结果见表1。结果显示：OC-STAMP在多发性骨髓瘤细胞系(U266和RPMI-8226)中高表达，在其他血液肿瘤细胞系中表达量较低，在正常人骨髓细胞中的相对表达水平为阴性。
表1在血液肿瘤细胞系中OC-STAMP基因的相对表达水平
三、应用步骤一的试剂盒检测多发性骨髓瘤患者
分别对若干多发性骨髓瘤患者及健康志愿者进行检测。具体步骤如下：
1、用TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取各骨髓标本的RNA(或外周血标本的RNA也可)，反转录为cDNA。
2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为0.082。
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例2。
分别用阳性对照cDNA和内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各患者中OC-STAMP基因和ABL1基因的拷贝数。以OC-STAMP基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示OC-STAMP基因的相对表达水平(％)。
共检测157例多发性骨髓瘤患者的288份骨髓标本，其中初诊标本157份，治疗后获得缓解(完全缓解、非常好的部分缓解和部分缓解)标本99份，疾病进展或复发标本32份。另外检测健康志愿者骨髓标本42份。
各个基因的相对表达量检测方法同实施例2。结果见图3。OC-STAMP基因的表达水平在初诊标本中(中位值0.50％；范围0-120.73％)和疾病进展/复发标本中(中位值0.25％；范围0-47.22％)显著高于缓解标本(中位值0.02％，范围0-4.69％；P<0.001)和健康志愿者标本(中位值0.02％，范围0-0.10％；P<0.001)。
实施例4、OC-STAMP基因的表达水平与患者疾病状态的关系
按照实施例3步骤三中的方法对如下若干多发性骨髓瘤患者的OC-STAMP基因表达水平进行分析：99套初诊-缓解跟踪骨髓标本和29套初诊-缓解-疾病进展/复发连续跟踪骨髓标本(其中缓解标本均来自上述缓解标本)。根据缓解深度，将缓解标本分为完全缓解(CR，N＝27)、非常好的部分缓解(VGPR，N＝33)和部分缓解(PR，N＝39)3组。
结果见图4。结果显示：在CR组，26例患者在获得缓解时OC-STAMP的表达水平下降；在VGPR组，28例患者在获得缓解时OC-STAMP的表达水平下降；在PR组，32例患者在获得缓解时OC-STAMP的表达水平下降；在患者出现疾病进展/复发时，OC-STAMP的表达水平在27例患者中上升。
上述结果表明，在个体患者的骨髓跟踪样本中OC-STAMP基因表达水平的变化趋势与该患者的疾病状态相一致。初诊患者随着治疗介入获得完全缓解(CR)、非常好的部分缓解(VGPR)和部分缓解(PR)时，上述OC-STAMP基因表达水平下降。而出现疾病进展/复发的患者，OC-STAMP基因表达水平升高。
实施例5、OC-STAMP基因的表达水平与缓解深度的关系
按照实施例4步骤三中的方法对实施例4中的99份缓解标本进行分析。根据缓解深度，缓解标本分为完全缓解(CR，N＝27)、非常好的部分缓解(VGPR，N＝33)和部分缓解(PR，N＝39)3组。
结果见图5。结果显示：OC-STAMP基因的表达水平在完全缓解(CR)组中最低(中位值0.01％；范围0-0.07％)并显著低于非常好的部分缓解(VGPR)组(中位值0.04％；范围0-4.69％；P＝0.0012)和部分缓解(PR)组(中位值0.06％；范围0-1.48％；P＝0.0002)。然而OC-STAMP基因在VGPR组和PR组之间的表达水平则未见明显差异(P＝0.60)。
上述结果表明，OC-STAMP基因的表达水平随多发性骨髓瘤缓解深度的加深而降低。
序列表
<110>北京大学人民医院（北京大学第二临床医学院）
<120>定量检测OC-STAMP基因表达水平的成套试剂及其应用
<160>9
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
tgtggactgg gctcagaagt t 21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
ttcatccctt tcctcttcaa cc 22
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>3
cacggtcaag tatgatgtgg catacactgt c 31
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>4
tggagataac actctaagca taactaaagg t 31
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>5
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>6
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
<210>7
<211>101
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>7
tgtggactgg gctcagaagt tgccaactgt gcccatcacg ctcacggtca agtatgatgt 60
ggcatacact gtcctgggct tcatcccttt cctcttcaac c 101
<210>8
<211>124
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>8
tggagataac actctaagca taactaaagg tgaaaagctc cgggtcttag gctataatca 60
caatggggaa tggtgtgaag cccaaaccaa aaatggccaa ggctgggtcc caagcaacta 120
catc 124
<210>9
<211>2123
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>9
agggattccc aagtcccagc gattccccca cttcctctcc acctgccaca gctgccagcg 60
accgcccgcc tgaaaccact gccatttgga cagcatgcca ggccacccag gagcagctga 120
gcaacttgtc aagaccgggt ggaggtcctg gcacttgggg ttctggaagg cccttgcccc 180
actgcaggct gcctgggacg ccttctccca gcctgttcca gccagctgtg gccagctgct 240
gacccagctc ctcctgtgtg cctccctggc tgctgctgct gcaggtctgg tttatcactg 300
gctggcatcc ttgctgcttt atcctcctgg accttcagcc atggttgcca ctgtctgtgg 360
cctcctggtc ttcctgagcc tgggcctggt acccccagtc cgctgcctgt ttgcactcag 420
cgtgcccacc ctgggtatgg agcagggccg ccggctgctc ctgtcctaca gcactgccac 480
cctggccatt gctgtggtgc ccaacgtcct ggccaacgtg ggtgcggccg ggcaggtgct 540
gaggtgtgtc accgagggct ccctggagag tctcctcaat accactcacc agctgcatgc 600
agcatccagg gctctgggcc ccacaggcca ggcaggcagc cggggcctga catttgaggc 660
ccaggacaat ggctctgcct tctaccttca catgctcagg gtcactcagc aggtcctgga 720
ggatttctct ggcctggagt ccctggcccg ggcagcagcg ctagggaccc agcgagtggt 780
cacagggctg tttatgttgg gcctcctggt ggagtcggca tggtacctcc attgctacct 840
gacagacctg cggtttgaca atatctacgc cactcaacag ctgacccagc ggttggcaca 900
ggcccaggct acacacctcc tggcccctcc acccacctgg ctgctccagg cggctcagct 960
gaggctgtca caggaggagc tgttgagttg tcttctaagg ctggggctgc ttgccctgct 1020
cctcgtggcc acggctgtgg cggtggccac agaccatgta gccttcctcc tggcacaggc 1080
tactgtggac tgggctcaga agttgccaac tgtgcccatc acgctcacgg tcaagtatga 1140
tgtggcatac actgtcctgg gcttcatccc tttcctcttc aaccagctgg ctccggagag 1200
ccccttcctc tccgtccaca gctcctacca atgggagctc cgcctcacct ccgcccgctg 1260
cccactgcta cccgcccggc gtccccgcgc agctgccccg ctggccgcgg gggccctgca 1320
gctcctggcg ggctccacgg tgctcctgga ggcctacgcc cgccgcctgc ggcatgccat 1380
cgccgcttcc ttcttcacag cccaggaggc gaggagggtc cgccacctgc acgcccggct 1440
ccagcgaaga cacgacaggc accaaggcca gcagctgccc ctaggggatc cttcttgcgt 1500
ccccacaccc agacctgcct gcaagcctcc ggcatggata gactacaggc tggatgcctt 1560
aagaaccgag agcagtgagg gagaagggaa agagctttgg agttgcagag acctgagttg 1620
taaccttggt cctgtgccgc ctccctgtgt gaccttgggt aagtcacttc acctctctga 1680
gcctcggttt ctacatctgc ataacgacag catatttacc attgatgtga cctacttccc 1740
acgcagggat gtggtcagga tggaaggaaa tactgggcat gataggcctg gataaccggt 1800
aaagaaccat gcaaaggcga agacaaggag tgcagagaga gctcatggtt cctccaggct 1860
ggttggcgat caggctcatc tcatctgcac caactgctct acttgttaga tggagacctt 1920
gcatcatgaa tttctcgaaa tgctcctgga acttatttat atgcctcaaa atcctctaaa 1980
ctcatttata gtaacccata gttttaattt tataaataaa cgtatttatt aaatcttaga 2040
ttacgttatt cctctgcctc aaattccttc agggcctttc cattgccagg attagatttt 2100
gccaaattaa aatataggac act 2123