阅读说明：本技术 一种与猪***数相关的snp位点及其检测方法和应用 (SNP (Single nucleotide polymorphism) locus related to number of pig breasts as well as detection method and application thereof ) 是由 胡晓湘 郭晓莉 王宇哲 杨瑞飞 朱迪 李宁 于 2019-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种与猪乳头数相关的SNP位点及其检测方法和应用,所述SNP位点位于基因组版本Ensembl Sscrofa 11.1的chr7:97570528,该位点的等位基因为A和G。本发明利用Tn5转座酶建库,对3616头具有重要经济性能记录的杜洛克猪核心群体进行低深度测序,通过填充获得高质量的全基因组重测序数据。通过与猪乳头数性状的GWAS分析,检测到七个显著影响猪乳头数的SNP位点,包括一个新发现的影响最为显著的SNP位点SSC7:97570528。这些SNP位点可作为分子标记应用于猪乳头数优势群体的选育。(The invention relates to a SNP locus related to the number of pig breasts, and a detection method and application thereof, wherein the SNP locus is positioned at chr7:97570528 of a genome version Ensembl Sscrifa 11.1, and alleles of the locus are A and G. According to the invention, a Tn5 transposase is used for establishing a library, 3616 Duroc core populations with important economic performance records are subjected to low-depth sequencing, and high-quality whole genome re-sequencing data are obtained through filling. Through GWAS analysis of pig head number traits, seven SNP loci which significantly affect the pig head number are detected, and a newly found SNP locus which has the most significant effect SSC7:97570528 is included. The SNP loci can be used as molecular markers for breeding pig breast number dominant groups.)

一种与猪***数相关的SNP位点及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，尤其涉及一种与猪***数相关的SNP位点及其检测方法和应用，具体为一个新发现的猪***数相关的错义突变及其应用。

背景技术

我国是最大的生猪生产国和消费国，猪肉产量和质量的市场需求日益增加，提高猪肉产量、改善猪肉胴体质量，成为育种科学家长期以来不断探索的工作。早期的育种工作主要集中于猪的表型选择，随着基因组工作的不断推进和遗传标记的广泛开发，分子选择正逐渐成为可靠而有效的选择方法。

单核苷酸多态性(single nucleotide ploymophism，SNP)标记是第三代分子标记，是指在基因组DNA序列上有单个碱基的突变而产生的一种多态性，这种突变包括单碱基的颠换、转换、***和缺失。SNP具有量大、高频率、低突变率等有点，广泛应用于基因组分析、生物信息自动化检测、简单和复杂疾病的遗传研究、畜牧育种标记及全球种族遗传学等研究。分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可不受环境影响，通过遗传背景选择，减少连锁累赘，从而加速育种过程及精确度。

全基因组关联分析(Genome-wide association studies，GWAS)是畜禽经济性状遗传改良和机制解析的重要方法。随着二代测序技术的发展，全基因组重测序和简化基因组测序技术成为高通量SNP分型的有力工具。但简化基因组由于标记密度有限，限制了其在精细定位中的应用。全基因组关联分析涉及基因组上全部变异，但成本较高，无法实现大样本量测序。

目前最常用的两步法测序，即将小样本量进行高深度重测序(>10×)，获得高质量的SNP合集，然后对大样本量进行低深度测序，通过连锁不平衡定律，即可推断那些没有被测序完全覆盖区域的基因型情况。通过填充获得的全基因组重测序数据，与重要性状进行GWAS，获得与性状显著关联的SNP。低深度重测序的方法大大降低了成本，并且由于填充后获得的标记密度大，相比简化基因组，在精细定位中具有很大的优势。目前，低深度重测的方法在水稻(Huang et al.，2010)、小鼠(Nicod et al.，2016)和人(Rustagi et al.，2017；Liu et al.,2018)中均有应用。

猪***数性状与猪泌乳力、产仔数等繁殖性能相关，因此，研究猪的***数，在育种中具有重要的研究意义。

发明内容

本发明提供一种与猪***数相关的SNP位点及其检测方法和应用，用于解决现有技术存在的问题。

本发明的第一个目的在于提供与猪***数相关的SNP位点，所述SNP位点位于基因组版本Ensembl Sscrofa 11.1的chr7:97570528，该位点的等位基因为A和G。

进一步地，在所述SNP位点的等位基因为A的猪***数高于等位基因为G的猪。

进一步地，所述SNP位点位于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中第101位碱基。

本发明的第二个目的在于提供一种猪***数相关SNP位点的检测方法，包括：

(1)利用Th5转座酶对样品猪建立基因文库，并进行全基因组重测序；

(2)对步骤(1)全基因组重测序结果使用Basevar进行基因分型，STITCH进行填充获SNP位点基因数据；

(3)对所有样品猪的***数和步骤(2)获得的SNP位点基因数据段进行全基因组关联分析。

进一步地，对于此检测方法检测出的SNP位点采用独立标记数进行Bonferroni校正，独立标记数的计算使用PLINK indep-pairwise命令获得。

由此，本发明得到了7个和***数相关的SNP位点，其中SSC7:97570528为新发现的SNP位点，SSC7:98073927、SSC7:98074438、SSC7:98074524、SSC7:98074744和SSC7:98101170之间完全连锁不平衡且与SSC7:97570528高连锁不平衡，SSC7:97574214与其余6个SNP位点连锁不平衡程度较低。在***数少的群体中，通过以下方式选择优势基因型的猪进行选育可以提高群体的***数：

SSC7:97570528位点，AA为优势基因型。SSC7:97574214位点，CC为优势基因型；SSC7:98073927位点，AA为优势基因型；SSC7:98074438位点，TT为优势基因型；SSC7:98074524位点，TT为优势基因型；SSC7:98074744位点，CC为优势基因型；SSC7:98101170位点，GG为优势基因型。

进一步地，连锁不平衡的SNP位点即表示这些位点的基因型均与猪***数的性状相关，并呈现一致的趋势，意味着当选育的猪在SSC7:97570528位点为优势基因型时，与其连锁不平衡的SNP位点也表现为优势基因型。

本发明的第三个目的是提供上述七个SNP位点及检测方式在猪***数性状的标记辅助选择育种的应用。

所述SNP位点可以用于鉴定猪***数优势群体。

进一步地，包括以下步骤：

(1)检测样品猪在所述SNP位点的基因型；

(2)选择具有优势等位基因基因型的样品猪进行***数优势群体的选育。

进一步地，步骤(1)可采用直接测序，或先扩增含所述SNP位点的片段再检测的方式进行。

本发明的另一目的在于提供一种用于扩增含有本发明所述新发现SNP片段的引物对。所述引物对的作用为：从SEQ ID NO.1所示的序列中扩增出含有所述SNP位点的片段。

本发明提供一种与猪***数相关的SNP位点及其应用，具有如下有益效果：

本发明利用Tn5转座酶建库，对3616头具有重要经济性能记录的杜洛克猪核心群体进行低深度测序，通过填充，获得高质量的全基因组重测序数据。通过与猪***数性状的GWAS分析，获得一个显著影响猪***数的LD block，对该区间进一步分析，检测到7个错义突变，其中最显著的SSC7:97570528位点为新发现的SNP位点，该SNP位点可以应用于猪***数优势群体的选育，通过选择SSC7:97570528位点等位基因AA的个体进行育种，可以提高猪群体的***数。本发明通过检测SNP位点能够早期、快速、低成本、有效的预测猪***数，在猪种改良方面具有广阔的应用前景，并能够取得优异的经济价值。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的猪***数性状的GWAS分析结果的曼哈顿图；

图2为本发明实施例1提供的猪***数性状在GWAS获得候选QTL区域内，精细定位的分析结果图；

图3为本发明实施例1提供的SNP位点SSC7:97570528、SSC7:97574214、SSC7:98073927、SSC7:98074438、SSC7:98074524、SSC7:98074744和SSC7:98101170的连锁不平衡关系图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中所用试剂及设备均可通过市售购得。

实施例1猪***数性状全基因组关联分析

以杜洛克猪纯种群体为研究对象，收集2007年8月至2016年1月出生的33,960头个体(12,987头公猪和20,973头母猪)的生产性能记录用于本研究。

2.试验方法

2.1***数表型：个体出生一周内记录每头猪的左***数、右***数以及总***数。

2.2Tn5转座酶建库：

(1)基因组统一稀释至40ng/μl，每个样品取50ng作为起始量。Tn5原酶与特定的Tn5ME-A/Tn5Merev以及Tn5ME-B/Tn5MErev接头72℃包埋2h，以获得具有剪切-粘贴活性的Tn5工作酶。接头结构与文献《Tn5 transposase and tagmentation procedures formassively scaled sequencing projects》所公开的Tn5ME-A,Tn5ME-B,Tn5Merev结构相同。

(2)Tn5工作酶稀释至16.5ng/μl，在4μl 5×TAPS-MgCl₂,2μl dimethylformamide(DMF)(Sigma Aldrich)和Nuclease-free water的条件下酶切50ng基因组底物。酶切总体积为20μl，条件为55℃酶切10min。随后每个反应中加入3.5μl 0.2％SDS，再次在55℃条件下孵育10min。

(3)PCR反应用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(Roche)酶进行，引物中包括96种不同的index，以区分个体。PCR程序为：1×(72℃，9min)；1×(98℃，30sec)；9×(98℃，30sec；63℃，30sec；72℃，3min)。

每个体的PCR产物经Qubit Fluorometric Quantitation(Invitrogen)定量后，96个体各取等量混池，用AMPure XP beads(Beckmann)在0.55×留上清，0.1×留磁珠的条件下进行纯化，纯化产物进行浓度检测后，用Agilent Bioanalyzer 2100检测文库片段大小，确保文库质量合格。

2.3全基因组重测序：对杜洛克猪纯种群体的37个体在Illumina平台进行高深度测序(>10×)，3616个体进行低深度测序，其中Illumina平台测序192个体，BGI平台测序3424个体，平均测序深度0.74×。

2.4基因分型及填充：使用Basevar进行基因分型，STITCH进行填充，共获得约11.6M的SNP位点。

2.5全基因组关联分析：对3616头杜洛克猪群体的***数进行了全基因组关联分析。

2.6与***数显著相关的SNP位点：基因组水平显著位点的检测，采用独立标记数进行Bonferroni校正，独立标记数的计算使用PLINK indep-pairwise命令获得。

根据该标准，得到一个与猪***数达到Bonferroni校正的5％基因组水平显著的QTL区域。对该区域进行精细定位，发现一个LD block,对该区间进一步分析，发现7个错义突变，分别为SSC7:97570528、SSC7:97574214、SSC7:98073927、SSC7:98074438、SSC7:98074524、SSC7:98074744和SSC7:98101170其中最显著的SSC7:97570528位点为新发现的SNP位点，其GWAS分析结果所得曼哈顿图如图1所示。

2.7对上述7个错义突变位点的连锁不平衡分析：用SHEsis软件分析7个位点在杜洛克猪种的连锁不平衡关系，结果如图3所示，尽管7个点位于同一LD block中，SSC7:98073927，SSC7:98074438，SSC7:98074524，SSC7:98074744，SSC7:98101170完全连锁不平衡，SSC7:97570528与这5个点高连锁不平衡，而SSC7:97574214与它们连锁不平衡程度较低。

2.8结果与分析：本发明通过Tn5建库，低深度重测序结合填充的策略获得了11.6M的SNP，对影响猪***数性状的变异进行定位，确定了一个LD block，对该区间进一步分析，分析结果如图2所示，发现7个错义突变，能引起氨基酸的改变。其中最显著的SSC7:97570528位点为新发现的SNP位点，如表1所示。

表1 错义突变位点

位置	dbSNP	Gene	Variation	-logP
					7:97570528	De novo	ABCD4	c.1472T>C,p.Leu491Pro	21.21
7:97574214	rs1108260317	ABCD4	c.940A>G,p.Thr314Ala	7.87
					7:98073927	rs329005836	PROX2	c.896T>C,p.Val299Ala	16.88
7:98074438	rs322346679	PROX2	c.385A>G,p.Ser129Gly	16.88
					7:98074524	rs343896124	PROX2	c.299A>G,p.Gln100Arg	16.88
7:98074744	rs345122460	PROX2	c.79G>A,p.Gly27Arg	17.12
					7:98101170	rs80784631	DLST	c.667G>T,p.Ala223Ser	17.4

实施例2：SNP位点(SSC7:97570528)在猪***数性状中的育种应用

1、试验材料

具有***数性状的杜洛克纯种猪群体。

2、试验方法

错义突变与***数性状的关联分析：对7个错义突变位点进行基因分型，基因型与杜洛克猪***数性状进行关联分析。

7个错义突变位点基因型与***数性状关联分析结果如表2所示。SSC7:97570528位点，AA为优势基因型。SSC7:97574214位点，CC为优势基因型；SSC7:98073927位点，AA为优势基因型；SSC7:98074438位点，TT为优势基因型；SSC7:98074524位点，TT为优势基因型；SSC7:98074744位点，CC为优势基因型；SSC7:98101170位点，GG为优势基因型。

表2-错义突变基因型与***数性状的最小二乘均值及标准误

由此，得到了七个与猪***数性状相关的SNP位点，尤其是一个新发现的SNP位点，在***数少的群体中，通过选择基因组版本Ensembl Sscrofa 11.1的Chr7：97570528等位基因AA的个体进行育种，可以提高育种群体的***数。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种与猪***数相关的SNP位点及其检测方法和应用

<130> KHP191114337.0

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agctggctct ggagcagccc aacctccttc ttaccagttc caatcgacct gctggtccag 60

accctctgtc cttgccacca agctggactg taacacaccc agagggaagg aagtccgtga 120

aagggtccaa cccagctccc tgccattccg aggatgtccc cgtgccatcc cacacccggg 180

gcacatctac cccagtggcg t 201