阅读说明：本技术 一种吸烟对***质量影响的评估方法 ([db:专利名称-en]) 是由 程金妹 孙斐 陈爱春 范晓博 米盼盼 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种吸烟对卵母细胞质量影响的评估方法,具体是将卵母细胞放在含有不同浓度可替宁的培养液中成熟培养。最后通过检测卵母细胞成熟率、染色体非整倍性、肌动蛋白的分布、线粒体膜电位、胞内活性氧水平、纺锤体形态、成熟卵母细胞染色体排列形态、体外受精后精子结合数量和孤雌激活后原核形成率等这些指标来评估吸烟对卵母细胞质量的影响。本发明通过大量的客观试验,评估了吸烟对卵母细胞质量的影响,为吸烟女性生殖能的维持提供了理论数据的参考。([db:摘要-en])

一种吸烟对***质量影响的评估方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种吸烟对***质量影响的评估方法。

背景技术

据《光明日报》报道：在全球11亿吸烟者中，我国占了3.3亿，我国每年死于与吸烟有关疾病的约100万人，其余的吸烟者均处于亚健康状态。据研究报道，吸烟能够削减女性生殖能力。另外，如果女性在怀孕期间吸烟会使胎儿面临更高的自然流产和围产期死亡的风险，显著降低胎儿出生体重。但是关于吸烟是否直接对生殖系统，特别是对***质量的影响仍未有相关研究报道。

香烟能够使人成瘾的主要原因是其尼古丁成分。可替宁(cotinine)被报道是烟草中的尼古丁在体内经细胞色素氧化酶2A6(CYP2A6)代谢后的产物，即尼古丁在体内的主要代谢产物和代谢产物前体，主要以等离子体形式存在血浆中。可替宁有促进神经系统兴奋作用，并在某些鼠类试验中反映出一定的抗炎、减轻肺水肿程度的作用。由于可替宁的半衰期较长(3～4d)且较稳定，因此成为测量吸烟者和被动吸烟者吸烟量的主要生物标志，一般情况下，多以血清中的可替宁浓度来评价。近期有研究成果显示，血浆中的可替宁浓度与血清中的可替宁浓度具有一致性，同样具有检测意义。Kendall V等人发现当在小鼠早期胚胎培养液中添加8mM的可替宁时，能够导致小鼠囊胚形成率显著下降；但是，当在小鼠胚胎培养液中添加少于8mM可替宁时，囊胚形成率与正常对照组相比，并没有显著性差异。目前并没有关于可替宁对***质量影响的相关研究。

现有技术中并没有可替宁与***质量的相关性研究，本发明通过在***体外成熟培养液中添加不同浓度的可替宁来直接评估吸烟对***质量的影响，并进一步评估吸烟者和被动吸烟者吸烟量是多少时，会引起***质量下降，最终导致生殖能力减弱。本发明将为吸烟女性想要维持***质量和生殖能力提供数据参考。

发明内容

本发明针对现有技术中没有可替宁与***质量相关性的研究，提供了一种吸烟对***质量影响的评估方法，通过在***体外成熟培养液中添加不同浓度的可替宁来直接评估吸烟对***质量的影响，并进一步评估吸烟者和被动吸烟者吸烟量是多少时，会引起***质量下降，最终导致生殖能力减弱。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种吸烟对***质量影响的评估方法，具体为在***体外成熟培养液中添加不同浓度可替宁的溶液后，检测体外成熟***质量。

进一步地，所述***取自CD1小鼠。

进一步地，所述可替宁为(-)-cotinine。

进一步地，所述可替宁的溶液是采用DMSO配置得到。

进一步地，所述体外成熟***质量的评价参数包括：***成熟率、成熟***活性氧(ROS)水平、线粒体膜电位、染色体非整倍体、肌动蛋白(α-actin)分布表达、纺锤体形态、孤雌激活后原核率、体外受精结合***数量和染色体的排列。

进一步地，所述不同浓度可替宁的溶液中可替宁的浓度为0-1000μmol/L。

进一步地，所述不同浓度可替宁的溶液中可替宁的浓度为0μmol/L、100μmol/L、500μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L。

通过本发明的评估方法得知：(1)当体外成熟培养液中添加可替宁浓度达到500μmol/L时，就可以导致成熟后***内ROS水平、染色体非整倍性和染色体错误排列显著增加，线粒体膜电位显著下降。但是***成熟率、MII期***肌动蛋白、纺锤体形态、孤雌激活后原核率和体外受精结合***数量与正常对照组并没有显著性的差异。

(2)当体外成熟培养液中的可替宁浓度为800μmol/L和1000μmol/L时，与正常对照组相比，其***成熟率、线粒体膜电位和孤雌激活后原核率显著下降，以及成熟***周围肌动蛋白分布紊乱和纺锤体形态异常。此外，成熟后***内ROS水平、染色体非整倍性和染色体错误排列出现显著性的增加。

有益效果：

本发明通过动物实验证明，本发明所述的方法可用来评估吸烟对***质量的影响，并为主动吸烟和被动吸烟女性想要维持***质量和生殖能力时，提供吸烟量的数据参考。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度可替宁对体外成熟***α-actin蛋白分布和纺锤体形态的影响。

图2为实施例1中不同浓度可替宁对体外成熟***中的线粒体膜电位和ROS水平的影响。

图3为实施例2中不同浓度可替宁对体外成熟***结合***数量的影响。

图4为实施例3中不同浓度可替宁对体外成熟***内不同基因表达的影响。

图1-图4中所标显著性均是于0μM组相比得出的显著性；图1-图4中不同小写字母者表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。其中，可替宁的要求纯度达到99.8％浓度。

以下实施例中使用的动物为8-10周龄的CD1雌性小鼠，购置南通大学实验动物中心，自由采食和饮水。控光(光照12h/d)，室内温度为20～22℃。

生发泡时期(GV期)***的采集方法如下：

8-10周龄的CD1雌性小鼠，腹腔注射PMSG(10IU)，间隔46h，进行颈椎脱臼处死，取出卵巢组织。将卵巢放入提前在37℃预热的含有50μmol/L IBMX的M2操作液中，运用1mL的注射器针头对卵巢进行撕碎，运用口吸管和玻璃针收集90-120微米形态正常的GV期***。操作在25℃室温环境下、37℃的恒温台上进行。

实施例1

可替宁对***质量的影响

首先配置含有0、100、500、800和1000μmol/L可替宁的体外成熟培养液滴，并在37℃，5％CO₂细胞培养箱中预平衡2小时。然后在每个液滴中放入30-35枚采集的GV期***，置于培养箱中进行培养。培养16h后，统计***成熟率即第一极体排出率。结果表1所示：

表1不同浓度可替宁对***体外发育和质量的影响

注：表中肩注不同小写字母者表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。所有组均是于0μM组中相比得出显著性。

由上表可知，体外成熟液中添加可替宁浓度小于800μM时，与正常对照组(0μM)相比，小鼠***成熟率并没有受到显著性的影响。但是当体外成熟可替宁浓度达到800μmol/L和1000μmol/L时，小鼠***成熟率发生显著性下降。

收集上述排出第一极体的小鼠***，并将转移至新鲜配置的2％多聚甲醛固定20min，然后用0.15％Triton渗透15min，0.3％BSA封闭15min，37℃孵育一抗(α-actin和β-tubulin)1小时，利用磷酸盐缓冲溶液清洗3次，每次5分钟，然后室温孵育二抗1小时，利用磷酸盐缓冲溶液清洗3次，每次5分钟，DAPI染色，置于荧光显微镜下采集图片。结果如图1所示，当体外成熟液中可替宁浓度达到800μmol/L时，体外成熟***的α-actin分布(图1B)和β-tubulin形态(图1C)发生异常。其中图1A分别是0μmol/L cotinine和800μmol/Lcotinine组中体外成熟***中α-actin表达量的代表图片，以及0μmol/Lcotinine组中β-tubulin染色后纺锤体形态的代表性图片。

染色体非整倍性、线粒体膜电位、染色体中期排列和胞内ROS水平是***质量评价的重要指标之一。通过染色体展片技术、JC1染料、免疫荧光染色技术和ROS试剂盒等试验方法，发现当体外细胞成熟液中可替宁的浓度达到500μmol/L时，成熟***的染色体非整倍性(表1)、中期染色体排列错误比率(表1)和胞内ROS水平显著增加(图2B)以及线粒体膜电位显著下降(图2A)。并且随着体外成熟液中可替宁浓度的增加(800μmol/L和1000μmol/L时)，成熟***的染色体非整倍性(表1)、中期染色体排列错误比率(表1)和胞内ROS水平逐渐增加(图2B)以及线粒体膜电位逐渐下降(图2A)。

实施例2

可替宁对成熟***体外受精能力的影响

为了直观评价体外成熟***的质量，首先将成熟的***与小鼠***进行体外受精，检测成熟***能与多少***结合。

具体方法如下：(1)将12-13周龄的雄性小鼠颈椎脱臼处死，利用小剪刀将附睾尾部取出，并将其剪几个裂缝，在体外授***中将***释放出来，然后将其放入37℃，5％CO₂细胞培养箱培养，30分钟后取10⁶枚***放入到含有成熟***的液滴中，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养1小时，对其进行固定，渗透，DAPI染色，荧光显微镜下统计结合成熟***上的***数量。

(2)将成熟的***放入到孤雌激活液A(含100μM氯化锶和5mg/L细胞松弛素D的体外受***)中2.5h，利用玻璃针转移成熟***进入孤雌激活液B(含5mg/L细胞松弛素D的体外受***)中3.5h，然后统计原核率。

结果表明随着体外成熟液中可替宁浓度的增加，成熟***结合***的能力并没有显著性的下降(图3)，但是孤雌激活后原核形成率却显著性的下降(表1)。

实施例3

可替宁对成熟***不同基因表达水平的影响

为了探索可替宁导致体外成熟***质量下降的分子机制，采用荧光定量PCR技术，通过对每组50枚成熟***进行RNA提取，反转录成CDNA，通过SYBR Green荧光染料，检测每组抗氧化相关基因(sod1、sod2、glrx2和GPX1)和凋亡相关基因(p53、BAX和BCL-1)的相对表达量，其中GADPH作为内参基因。

结果如图4，随着体外成熟液中可替宁浓度的升高，抗氧化相关基因的表达量逐渐下降，在可替宁浓度达到800μmol/L和1000μmol/L时，与未添加可替宁组相比，这些基因发生差异显著以及极显著性的下降。与此同时，随着体外成熟液中可替宁浓度的增加，凋亡相关基因的表达量逐渐升高，其中在可替宁浓度达到800μmol/L和1000μmol/L时，与未添加可替宁组相比，这些基因发生差异显著以及极显著性的上升。

尽管以上具体实施方式中仅评估了吸烟对小鼠***质量的影响，但人类***成熟的过程和机制与小鼠的十分相似，该方法同样适用于吸烟对人类***质量影响的评估，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。