一种荧光探针
阅读说明：本技术 一种荧光探针 (Fluorescent probe ) 是由 唐卓 陈刚毅 董娟 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子生物学技术领域,提供一种可以实现靶分子定性和实时荧光定量检测的特异性核酸探针。探针的5’和3’端分别标记淬灭基团和荧光基团,与靶序列互补之后在3’末端形成至少1个碱基错配,并能在3’末端错配核苷酸剪切酶作用下被剪切而释放荧光信号。将探针3’末端最后一个碱基设计在单核苷酸多态性位点上,可实现单核苷酸多态性的检测。探针还可结合核酸扩增策略对靶核酸进行更为灵敏的检测。探针设计简单,可广泛适用于所有可引入3’末端错配核苷酸剪切酶的核酸检测体系。(The invention belongs to the technical field of molecular biology, and provides a specific nucleic acid probe capable of realizing qualitative and real-time fluorescent quantitative detection of target molecules. The 5 'end and the 3' end of the probe are respectively marked with a quenching group and a fluorescent group, at least 1 base mismatch is formed at the 3 'end after the probe is complementary with a target sequence, and the probe can be sheared under the action of 3' end mismatch nucleotide shear enzyme to release a fluorescent signal. The last base at the 3' end of the probe is designed on the single nucleotide polymorphism site, so that the detection of the single nucleotide polymorphism can be realized. The probe may also be combined with a nucleic acid amplification strategy to provide more sensitive detection of the target nucleic acid. The probe has simple design and can be widely applied to all nucleic acid detection systems capable of introducing 3' end mismatch nucleotide splicing enzymes.)
技术领域
本发明涉及核酸探针技术，具体涉及一种可以实现靶分子实时荧光定量和特异性检测的核酸探针。
背景技术
核酸探针是一段序列已知的，带有检测标记，与目的基因序列互补的核酸序列。核酸探针通常会被标记一定的化学基团，当核酸探针通过分子杂交与目的基因结合之后产生杂交信号，从而将核酸序列信号转换成光学或电学的易于读取和分析的信号，将目的序列从大量无关的核酸序列中检测出来，核酸探针也因此成为了基因检测领域普遍使用的强大的分析工具。最早使用的核酸探针通常标记放射性同位素进行示踪和信号读取，如Northern和Southern分别采用放射性标记的寡核苷酸探针与膜上的RNA或者DNA进行杂交，通过磷屏扫描仪检测目的序列的位置的浓度。然而同位素存在半衰期短，操作困难、污染环境和影响人身健康等一系列问题。因此，后来发展的核酸探针通常采用非放射性标记，如荧光分子、生物素和酶等。
非放射性标记的核酸探针中应用最广泛的是荧光标记的核酸探针，而荧光标记的核酸探针除了可以直接用于组织和细胞中的核酸定位(如荧光原位杂交)还可以用于在扩增过程中通过酶的剪切作用释放荧光信号的方法达到目的序列的特异性检测。目前用于扩增反应中荧光探针主要是TaqMan探针，TaqMan探针的使用很大程度上提高了PCR方法的特异性和准确度。然而，TaqMan探针依赖于Taq酶的5’-3’外切酶活性，因此不适用于使用了不具有5’-3’外切酶活性的聚合酶的扩增反应，如现有的大部分等温扩增反应(SDA，RPA，LAMP，RCA，CPA，HAD，EXPAR,NASBA,MDA)。因此，开发一种既能用于PCR一类的变温反应又能用于等温扩增反应中的适用性更广泛的的核酸探针对于基因检测领域具有重要的意义。
发明内容
本发明结合荧光共振能量转移原理和具有能够识别3’末端碱基错配并剪切释放错配核苷酸的酶，提供一种易制备、高稳定、高特异的寡核苷酸探针，能够与靶序列互补杂交并被剪切，产生仪器可读的精确的光、电信号，最终实现靶核酸的实时荧光定量和特异性检测。
本发明的技术方案如下：一种荧光探针，探针的5’末端标记淬灭基团，3’末端标记荧光基团，探针序列设计为与靶核酸上一定长度的序列不完全互补；不完全互补具体为至少探针的3’末端与靶序列存在至少1个碱基的错配。
本发明所述荧光探针，其结构完整时，3’端荧光基团发射的荧光与5’端淬灭基团的吸收光满足荧光共振能量转移，3’端荧光基团发射的荧光会被5’端的淬灭基团吸收，探针不发生荧光；当探针断裂，导致5’端淬灭基团与3’端荧光基团分离而丧失荧光共振能量转移的发生条件，探针发生荧光。
本发明所述荧光探针，探针除3’末端错配碱基外的5’端序列可以是与靶分子完全互补，也可以在保证探针与靶分子稳定结合的前提下在5’端序列引入少量碱基错配。
本发明所述荧光探针既可对一段核酸序列进行检测，也能对一段核酸序列中的单核苷酸多态性(SNP)进行检测。
本发明所述荧光探针检测靶核酸序列：当探针特异性识别到靶序列并与之杂交后，具有能够识别3’末端碱基错配并剪切释放错配核苷酸的酶(下称“3’末端错配核苷酸剪切酶”)可将探针3’末端核苷酸剪切释放，从而使标记在探针3’末端的荧光基团与5’末端的淬灭基团分离，释放出荧光；探针未识别到靶序列时，探针将保持完整单链结构，不被3’末端错配核苷酸剪切酶剪切，荧光基团发射的荧光被淬灭基团所淬灭，无荧光信号产生；根据荧光信号实现靶核酸信息的报告。
本发明所述荧光探针检测单核苷酸多态性：设计探针的3’末端最后一个核苷酸正好对应于靶核酸序列的单核苷酸多态性位点。如果设计的探针与正常序列完美互补而与突变序列形成3’末端碱基错配，当检测到正常序列时，探针与正常序列完全互补，探针不能被3’末端错配核苷酸剪切酶剪切，无荧光信号产生；当检测到突变序列时，探针与突变序列杂交后在3’末端存在一个碱基错配，此时探针3’末端的错配核苷酸可被3’末端错配核苷酸剪切酶识别并剪切，荧光信号得到释放。同理，如果探针与突变序列完美互补而与正常序列形成3’末端碱基错配，那么检测到正常序列时会产生荧光信号，而检测到突变序列时没有荧光信号产生。根据荧光信号的差异即可判断单核苷酸多态性的基因型。
本发明所述荧光探针可结合核酸扩增技术对靶核酸信息进行更为灵敏的检测。
本发明所述荧光探针结合基于引物的核酸扩增策略对靶核酸序列进行检测：针对靶核酸上引物结合区域之间的序列设计本发明所述探针，并将其引入扩增体系。当样本中不含靶核酸时，无引物引发的扩增产物形成，探针保持单链结构，不被3’末端错配核苷酸剪切酶剪切，不释放荧光信号；若引物发生非特异扩增，其扩增产生的中间产物不含有探针互补序列，探针保持单链结构，不能被3’末端错配核苷酸剪切酶剪切，无荧光信号产生，可有效控制假阳性扩增；当样本中含靶核酸时，探针特异性识别基于引物的扩增产物并与之互补，3’末端错配核苷酸被3’末端错配核苷酸剪切酶识别并剪切，标记在3’末端核苷酸上的荧光基团与5’末端的淬灭基团分离，释放出荧光信号从而报告靶核酸信息。
本发明所述探针结合基于引物的核酸扩增策略进行单核苷酸多态性检测：针对靶核酸上引物结合区域之间的序列设计本发明所述探针，使探针的3’末端最后一个核苷酸正好对应于靶核酸序列的单核苷酸多态性位点。如果设计的探针与正常序列完美互补而与突变序列形成3’末端碱基错配，当检测到正常序列时，探针与正常序列的扩增产物完全互补，此时探针不能被3’末端错配核苷酸剪切酶剪切，探针保持完整，荧光基团发射的荧光被淬灭基团所淬灭，无荧光信号产生；当检测到突变序列时，探针与突变序列的扩增产物杂交后在3’末端存在一个碱基错配，此时探针3’末端的错配核苷酸可被3’-错配核苷酸剪切酶识别并剪切，从而标记在3’末端核苷酸上的荧光基团与5’末端的淬灭基团分离，释放出荧光。同理，如果探针与突变序列完美互补而与正常序列形成3’末端碱基错配，那么检测到正常序列时会产生荧光信号，而检测到突变序列时没有荧光信号产生。从而可以根据荧光信号的有无判断单核苷酸多态性的基因型。
本发明所述荧光探针的长度根据反应的温度和探针的GC含量确定，一般地，探针Tm值高于反应温度2-3℃。
本发明所述3’末端错配核苷酸剪切酶可以是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，优选为高保真DNA聚合酶(Pfu DNApolymerase)。
如本文所用，除另外特殊说明，下列词语/术语具有下列含义。
“DNA”：脱氧核糖核酸，是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′,5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。
“寡核苷酸”：小分子核酸，由核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成。
“靶序列/靶核酸”：与本发明的探针特异结合或能通过其他过程产生与本发明的探针特异结合的待检核酸分子。
“碱基”：碱基是合成核苷、核苷酸和核酸的基本组成单位，是一类含氮碱基。
“核苷酸”：一类由嘌呤碱或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物，是核酸的基本组成单位。
“错配”：指双链核酸分子中存在的非互补性碱基配对的现象，即一条链上的碱基与另一条链上相应的碱基不是互补的。
“淬灭基团”：与荧光基团在一定距离范围内，能吸收荧光基团发射的荧光的化学基团。
“荧光基团”：在特定波长的激光照射下，可以发射更长波长的光的化学基团。
“荧光能量共振转移”：指在两个不同的基团中，如果一个荧光基团(供体)的发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于
“Tm值”：双链DNA在热变性时吸光度的增高是温度的函数，吸光度增加一半时的温度，即为Tm值。
本发明所公开的探针关键在于结合荧光共振能量转移原理和3’末端错配核苷酸剪切酶的作用，通过与靶序列特异识别并在3’末端形成核苷酸错配，被3’末端错配核苷酸剪切酶剪切，从而释放荧光信号，实现直接或间接对靶分子进行定性或定量分析。该探针稳定、简单易制备、适用范围广，可以用于各种核酸检测体系，特别是对于传染性疾病、癌症早期检测和靶向用药检测等有很高的实用价值。本发明在现有探针技术发展过程中，主要体现出以下几个突出的优点：
1.通用性。本发明的寡核苷酸探针，适用于所有可引入3’末端错配核苷酸剪切酶的核酸检测体系。
2.简便性。只需针对不同样品中的目标核酸序列进行相应的序列设计，便可用于目标核酸的检测。
3.实用性。本发明的探针用于核酸检测时，荧光信号的释放使整个反应过程可以实时监测，既可实现靶分子的定性检测还可以对靶分子进行定量检测，在对真实样品的检测分析中具有很大的实用价值。
附图说明
图1是荧光探针设计及工作原理示意图；
图2是荧光探针用于单核苷酸多态性检测的设计及工作原理示意图；
图3是荧光探针应用于环介导扩增中的原理示意图。
图4是本发明的探针用于环介导扩增反应中对核酸进行定量检测结果图。
图5是本发明的探针用于环介导扩增反应中对核酸进行定量检测的原理和结果图。
图6是本发明的探针用于环介导扩增反应中实现特异性检测的结果图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1、荧光探针应用于环介导扩增反应定量检测示例
将BRAF基因的片段克隆到质粒T1上，并对重组质粒进行测序验证，得到重组质粒T1-BRAF作为扩增反应的模板。针对BRAF基因序列设计环介导扩增引物和荧光探针。
BRAF基因片段序列:
5’-TAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGCACCAGAAGTCATCAGAATGCAAGATAAAAATCCATACAGCTTTCAGTCAGATGTATATGC-3’
(1)环介导扩增引物及荧光探针序列：
FIP：5’-AGACAACTGTTCAAACTGATGGGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGC-3’
BIP：5’-TCCATTTTGTGGATGGCACCGCATATACATCTGACTGAAAGC-3’
LB:5’-GCAAGATAAAAATCCATACA-3’
F3:5’-TATTTCTTCATGAAGACC-3’
B3:5’-CCAGTCATCAATTCATAC-3’
PM(荧光探针):5’-BHQ1-ACCCACTCCATCGAGATTTCT-FAM-3’
(2)反应体系及反应条件
最终将反应体系用灭菌去离子水补足至25μL。
反应条件是：60℃反应60min。
(3)检测方法
利用实时荧光PCR仪，设置FAM通道在100min内进行实时记录，得到实时荧光曲线图。将达到荧光阈值经历的时间(Tt值)作为纵坐标，模板数量的对数值作为横坐标进行作图。
(4)检测结果
如附图4所示，加入了模板的反应均出现了阳性荧光信号，并且随着模板浓度的降低，荧光信号出现的时间靠后。达到荧光阈值经历的时间与模板数量的对数值在102到108的模板数量范围了具有很好的线性关系，可以对模板进行精确定量。
实施例2、单核苷酸多态性检测示例
将实施例1中的重组质粒进行突变，得到对应于BRAF(V600E)的突变质粒，分别以T1-BRAF和T1-BRAF-M作为模板进行检测。
突变模板序列：
TAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGCACCAGAAGTCATCAGAATGCAAGATAAAAATCCATACAGCTTTCAGTCAGATGTATATGC
其中斜体碱基表示突变位点。
运用实施例1中所设计的引物及探针用于区分正常质粒和突变质粒的检测。
(1)反应体系及反应条件
最终将反应体系用灭菌去离子水补足至25μL。
反应条件是：60℃反应70min。
(3)检测方法
利用实时荧光PCR仪，设置FAM通道在100min内进行实时记录，得到实时荧光曲线图。
(4)检测结果
如附图5所示，加入正常质粒作为模板的反应比加入突变质粒作为模板的反应荧光信号出现的时间提前了至少15分钟，利用这个时间窗口可以对单核苷酸多态性进行判断。
实施例3、荧光探针实现环介导扩增反应的特异性检测示例
将实施例1中重组质粒T1-BRAF与荧光探针互补配对的序列替换成任意序列，替换后的序列不能与荧光探针互补配对，得到新的质粒T1-BRAF-N，分别以T1-BRAF和T1-BRAF-N作为模板进行检测。
替换后模板序列如下：
TAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCATGTCGCAACAATATTTATGACTATACCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGCACCAGAAGTCATCAGAATGCAAGATAAAAATCCATACAGCTTTCAGTCAGATGTATATGC
其中斜体部分是替换的序列。
(1)反应体系及反应条件
最终将反应体系用灭菌去离子水补足至25μL。
反应条件是：60℃反应90min。
(3)检测方法
利用实时荧光PCR仪，设置FAM通道在90min内进行实时记录，得到实时荧光曲线图，反应结束后从两管反应中取5ul用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
(4)检测结果
如附图6所示，加入正常质粒T1-BRAF作为模板的反应有荧光信号产生，序列替换后的模板T1-BRAF-N没有产生荧光信号，而琼脂糖凝胶电泳显示两种质粒作为模板都能产生环介导扩增反应的特征性梯状条带，因此即使引物发生非特异性扩增，荧光探针可以准确地将特异性扩增和非特异扩增分开，提高检测反应的准确度。