阅读说明：本技术 维生素d3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法 (Experimental method for influence of vitamin D3 on immunity and reproductive function of sheep ) 是由 庞全海 李振 王天元 陈昱筱 王帅 秦红 张娟 梁睿 李颖平 赵礼军 谢莹 赵 于 2019-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法,包括以下步骤：步骤一,试验动物分组与饲养；步骤二,绵羊组织取样；步骤三,绵羊组织总RNA提取；步骤四,cDNA合成；步骤五,细胞凋亡相关基因及VDR的引物设计；步骤六,荧光定量PCR；步骤七,数据统计与分析；对照组维生素D3的添加量为0IU/kg,试验组维生素D3的添加量分别为300IU/kg、600IU/kg、900IU/kg和1200IU/kg；该维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法,通过微贮豆秸中添加不同浓度维生素D3饲喂绵羊探索研究维生素D3对绵羊细胞凋亡的作用机制,最后得出维生素D3添加水平在300IU/kg时有利于提高绵羊免疫力及降低组织细胞凋亡,实验过程严谨,结果可靠。(The invention discloses an experimental method for influence of vitamin D3 on immunity and reproductive function of sheep, which comprises the following steps: grouping and feeding test animals; sampling sheep tissues; step three, extracting total RNA of the sheep tissue; step four, cDNA synthesis; designing primers of apoptosis related genes and VDRs; step six, performing fluorescence quantitative PCR; seventhly, data statistics and analysis are carried out; the addition amount of the control group vitamin D3 is 0IU/kg, and the addition amounts of the test group vitamin D3 are 300IU/kg, 600IU/kg, 900IU/kg and 1200IU/kg respectively; according to the experimental method for the influence of the vitamin D3 on the immunity and reproductive function of sheep, the vitamin D3 with different concentrations is added into the micro-storage beanstalk to feed the sheep to explore and research the action mechanism of the vitamin D3 on sheep apoptosis, and finally, the vitamin D3 is obtained, when the addition level is 300IU/kg, the sheep immunity is favorably improved, the tissue apoptosis is favorably reduced, the experimental process is rigorous, and the result is reliable.)

维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法

技术领域

本发明涉及维生素D3受体技术领域，具体为维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法。

背景技术

我国作为农业大国，有十分丰富的农作物秸秆，对于秸秆的再利用一直是社会关注的问题。秸秆焚烧是最经济、最快捷、最有效的秸秆处理方法。然而，焚烧秸秆会导致燃烧不完全，释放出大量的有毒空气污染物，如挥发性有机化合物、一氧化碳、细颗粒物/可吸入颗粒物、致癌的多环芳香烃等，在日本，研究发现秸秆焚烧与儿童哮喘病有关。秸秆焚烧还会引起诸多环境问题和秸秆营养成分的流失。因此，秸秆资源的再利用问题已经迫在眉睫。近年来，人们对于维生素D3受体(VDR)的关注越来越多，其生理功能也依次被发现。VDR最早的报道是其在维持骨骼健康和钙稳态方面发挥着重要作用。此外，VDR在炎症、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、细胞增殖和分化、肿瘤组织等方面发挥着重要的作用。维生素D3可以提高VDR的表达能力，VDR水平通过转录和翻译后也可调节维生素D3。由此可见，通过研究组织中的VDR的作用可探索维生素D3的生理病理学作用。因此设计维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法，包括以下步骤：步骤一，试验动物分组与饲养；步骤二，绵羊组织取样；步骤三，绵羊组织总RNA提取；步骤四，cDNA合成；步骤五，细胞凋亡相关基因及VDR的引物设计；步骤六，荧光定量PCR；步骤七，数据统计与分析；

其中在上述步骤一中，试验动物分组与饲养包括以下步骤：

1)选取25只2月龄的公绵羊，体重在20-25kg之间，随机分为5组，每组5个重复，每个重复1只绵羊；

2)预饲期10d，试验期70d，所有分组均饲喂基础日粮和微贮豆秸，对照组维生素D3的添加量为OIU/kg，试验组维生素D3的添加量分别为300IU/kg、600IU/kg、900IU/kg和1200IU/kg；

3)将豆秸揉搓成1-3cm的长度，将微生物菌剂、红糖和水混匀，然后均匀的撒在秸秆上，密封时用打包机器压紧密封打包，发酵一个月后即可开启使用微生物发酵豆秸；

4)每只绵羊的日进食量根据绵羊的日增重随时进行调整，精粗比为1∶2(以干物质为基础)，试验期饲喂2次，以先粗后精顺序饲喂，自由饮水；

其中在上述步骤二中，在试验期的最后一天，每组随机挑选4只绵羊进行屠宰取样，分别采集肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和肠系膜淋巴置于冻存管中，放入液氮备用；

其中在上述步骤三中，绵羊组织总RNA提取包括以下步骤：

1)先将研钵进行高压灭菌，然后用液氮对其进行遇冷处理，随后迅速将绵羊组织从液氮中取出，置于研钵中研磨，将研碎的组织置于EP管中，加入适量Trizol，做好标记，用力震荡混匀，即可静置于冰上；

2)将混合液置于4℃离心机中，离心10min；缓慢吸取上清，将其移入另一EP管中，室温孵育5min；加入200μL的氯仿，用力震荡混匀，4℃下离心15min；缓慢吸取上清，移入另一EP管，再加入等体积异丙醇，室温静置10min，4℃下离心10min，出现白色沉淀；

3)弃去EP管中的异丙醇，加入适量1mL的冰乙醇，4℃下离心15min；弃去冰乙醇，于室温条件下干燥10min，加入适量20μL无菌RNase H₂O溶解白色沉淀；取适量1μL提取出的总RNA，利用核酸测定仪测定其浓度，将剩余的总RNA样品放入-80℃冰箱保存备用；其中在上述步骤四中，cDNA合成包括以下步骤：

1)按照4μL的RNA样品、2μL的AccuRT Reaction Mix(4×)、2μL的Nuclease-freeH₂O、2μL的AccuRT Reaction Stopper、4μL的5×All-In-One RT MasterMix和6μL的Nuclease-free H₂O配置cDNA反应体系；

2)将配置好的试剂放入预热的PCR仪中，分别在25℃下反应10min、42℃下反应50min和85℃下反应5min；

其中在上述步骤五中，由NCBI查找绵羊VDR、Bcl2、BAX、Caspase9、Caspase3、18s的基因序列，再根据各基因的保守区(CDs)利用Priem 5.0软件进行引物设计，委托其他生物工程公司合成引物序列；

其中在上述步骤六中，荧光定量PCR包括以下步骤：

1)按10μL的EvaGreen 2×qPCR MasterMix、0.6μL的Forward Primer、0.6μL的Reverse Primer、2μL的cDNA和6.8μL的RNase FreeddH₂O的比例配制成20μL的Real-timePCR反应体系；

2)将反转录合成的cDNA样品进行稀释，加入反应体系离心，充分混匀，置于预热的qRT-PCR仪中，反应步骤如下：

①酶激活，95℃，10min，循环数为1；

②改性，95℃，15secs，循环数为40；

③退火扩展，60℃，60secs，循环数为40；

④曲线融化，55℃/95℃，30secs/60secs，循环数为81；

其中在上述步骤七中，荧光定量的CT值按照2^-ΔΔCT算法计算相对表达量，采用Graphpad Prism5软件中的One-way analysis of variance(ANOVA)对试验数据进行分析。

根据上述技术方案，所述步骤一3)中，微生物菌剂、红糖和水的比例为1∶20∶80，微贮菌剂的益生菌总数≥5×10⁷个/g。

根据上述技术方案，所述步骤一4)中，所有试验绵羊的饲养管理均符合动物伦理福利保护规定。

根据上述技术方案，所述步骤一4)中，基础日粮由42％的玉米、30％的麦麸、24％的豆粕和4％的预混料组成。

根据上述技术方案，所述步骤一4)中，饲喂时间为每天8：00和18：00。

根据上述技术方案，所述步骤三2)中，离心速度为12000r/min。

根据上述技术方案，所述步骤七中，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：该维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法，通过微贮豆秸中添加不同浓度维生素D3饲喂绵羊探索研究维生素D3对绵羊细胞凋亡的作用机制，最后得出维生素D3添加水平在300IU/kg时有利于提高绵羊免疫力及降低组织细胞凋亡，实验过程严谨，结果可靠。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1、2、3、4和5均为本发明实验中维生素D3对凋亡基因及VDR在肝脏中表达的影响示意图；

图6、7、8、9和10均为本发明实验中维生素D3对凋亡基因及VDR在肾脏中表达的影响示意图；

图11、12、13、14和15均为本发明实验中维生素D3对凋亡基因及VDR在脾脏中表达的影响示意图；

图16、17、18、19和20均为本发明实验中维生素D3对凋亡基因及VDR在胸腺中表达的影响示意图；

图21、22、23、24和25均为本发明实验中维生素D3对凋亡基因及VDR在肠系膜淋巴中表达的影响示意图；

图26是本发明的整体流程图；

图中：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-26，本发明提供一种技术方案：维生素D3对绵羊的免疫力和生殖功能的影响实验方法，包括以下步骤：步骤一，试验动物分组与饲养；步骤二，绵羊组织取样；步骤三，绵羊组织总RNA提取；步骤四，cDNA合成；步骤五，细胞凋亡相关基因及VDR的引物设计；步骤六，荧光定量PCR；步骤七，数据统计与分析；

其中在上述步骤一中，试验动物分组与饲养包括以下步骤：

1)选取25只2月龄的公绵羊，体重在20-25kg之间，随机分为5组，每组5个重复，每个重复1只绵羊；

2)预饲期10d，试验期70d，所有分组均饲喂基础日粮和微贮豆秸，对照组维生素D3的添加量为OIU/kg，试验组维生素D3的添加量分别为300IU/kg、600IU/kg、900IU/kg和1200IU/kg；

3)将豆秸揉搓成1-3cm的长度，将微生物菌剂、红糖和水按照1∶20∶80的比例混匀，然后均匀的撒在秸秆上，密封时用打包机器压紧密封打包，发酵一个月后即可开启使用微生物发酵豆秸；

4)每只绵羊的日进食量根据绵羊的日增重随时进行调整，精粗比为1∶2(以干物质为基础)，试验期饲喂2次，饲喂时间为每天8：00和18：00，以先粗后精顺序饲喂，自由饮水，所有试验绵羊的饲养管理均符合动物伦理福利保护规定，基础日粮组成及营养水平见表1，微生物发酵豆秸的营养成分见表2；

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

原料	含量	营养水平	含量
				玉米	42.00	干物质DM	89.79
麦麸	30.00	粗蛋白质CP	18.14
				豆粕	24.00	粗脂肪EE	2.29
预混料	4.00	中性洗涤纤维NDF	13.36
				合计	100.00	酸性洗涤纤维ADF	5.66
		钙Ca	0.86
						总磷	0.68

注：粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙、总磷为实测值，干物质为计算值。下表同。

表2 微生物发酵豆秸的营养成分(干物质基础)

其中在上述步骤二中，在试验期的最后一天，每组随机挑选4只绵羊进行屠宰取样，分别采集肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和肠系膜淋巴置于冻存管中，放入液氮备用；

其中在上述步骤三中，绵羊组织总RNA提取包括以下步骤：

1)先将研钵进行高压灭菌，然后用液氮对其进行遇冷处理，随后迅速将绵羊组织从液氮中取出，置于研钵中研磨，将研碎的组织置于EP管中，加入适量Trizol，做好标记，用力震荡混匀，即可静置于冰上；

2)将混合液置于4℃离心机中，离心10min，离心速度为12000r/min；缓慢吸取上清，将其移入另一EP管中，室温孵育5min；加入200μL的氯仿，用力震荡混匀，4℃下离心15min，离心速度为12000r/min；缓慢吸取上清，移入另一EP管，再加入等体积异丙醇，室温静置10min，4℃下离心10min，离心速度为12000r/min，出现白色沉淀；

3)弃去EP管中的异丙醇，加入适量1mL的冰乙醇，4℃下离心15min，离心速度为12000r/min；弃去冰乙醇，于室温条件下干燥10min，加入适量20μL无菌RNase H₂O溶解白色沉淀；取适量1μL提取出的总RNA，利用核酸测定仪测定其浓度，将剩余的总RNA样品放入-80℃冰箱保存备用；

其中在上述步骤四中，按表3反应体系配制，放入预热的PCR仪中，反应条件如表4所示：

表3 cDNA反应体系

表4 PCR反应条件

温度(℃)	时间(min)
		25	10
42	50
		85	5

其中在上述步骤五中，由NCBI查找绵羊VDR、Bcl2、BAX、Caspase9、Caspase3、18s的基因序列，再根据各基因的保守区(CDs)利用Priem 5.0软件进行引物设计，委托其他生物工程公司合成引物序列，如表5所示：

表5 目的基因和内参基因的相关信息

其中在上述步骤六中，荧光定量PCR包括以下步骤：

1)将反转录合成的cDNA样品进行稀释，使用荧光定量试剂盒进行qRT-PCR反应，反应体系如表6所示。

表6 Real-time PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		EvaGreen 2×qPCR MasterMix	10
Forward Primer	0.6
		Reverse Primer	0.6
cDNA	2
		RNase Free ddH<sub>2</sub>O	6.8

2)按上述比例配制成20μL反应体系，离心，充分混匀，置于预热的qRT-PCR仪中，反应条件如表7所示：

表7 Real-time PCR反应条件

其中在上述步骤七中，荧光定量的CT值按照2^-ΔΔCT算法计算相对表达量，采用Graphpad Prism5软件中的One-way analysis of variance(ANOVA)对试验数据进行分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

其中，微贮菌剂的益生菌总数≥5×10⁷个/g。

结果与分析

1.微贮豆秸中添加不同浓度VD3对肝脏凋亡基因mRNA水平的影响

由图1、2、3、4和5可知，维生素D3添加水平为600、900、1200IU/kg时，绵羊肝脏BAX和Caspase9的相对表达量与对照组相比极显著升高(P＜0.01)；各试验组Caspase3的相对表达量都与对照组有极显著差异(P＜0.01)；维生素D3添加水平为900和1200IU/kg时，VDR的相对表达量显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)高于对照组。

2.微贮豆秸中添加不同浓度VD3对肾脏凋亡基因mRNA水平的影响

由图6、7、8、9和10可知，维生素D3添加水平为600、900、1200IU/kg时，绵羊肾脏BAX的相对表达量与对照组相比极显著升高(P＜0.01)；各试验组Bcl2的相对表达量与对照组相比都有显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)的降低；维生素D3添加水平为600和900IU/kg时，Caspase9和Caspase3的相对表达量与对照组相比有显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)的升高；维生素D3添加水平为600IU/kg时，VDR的相对表达量与对照组相比有显著(P＜0.05)升高。

3.微贮豆秸中添加不同浓度VD3对脾脏凋亡基因mRNA水平的影响

由图11、12、13、14和15可知，维生素D3添加水平为600、900、1200IU/kg时，绵羊脾脏BAX、Caspase9、Caspase3和VDR的相对表达量与对照组相比有极显著(P＜0.01)升高；维生素D3添加水平为1200IU/kg时，Bcl2的相对表达量与对照组相比有显著(P＜0.05)升高。

4.微贮豆秸中添加不同浓度VD3对胸腺凋亡基因mRNA水平的影响

由图16、17、18、19和20可知，维生素D3添加水平为600、900、1200IU/kg时，绵羊胸腺Caspase9的相对表达量与对照组相比有极显著(P＜0.01)升高；维生素D3添加水平为600IU/kg时BAX、Caspase3的相对表达量与对照组相比有极显著(P＜0.01)升高；维生素D3添加水平为600和900IU/kg时，VDR的相对表达量与对照组相比有极显著(P＜0.01)升高。

5.微贮豆秸中添加不同浓度VD3对肠系膜凋亡基因mRNA水平的影响

由图21、22、23、24和25可知，维生素D3添加水平为600、900、1200IU/kg时，绵羊肠系膜淋巴BAX、Bcl2、Caspase3、Caspase9和VDR的相对表达量与对照组相比都有极显著(P＜0.01)升高。

综上所述，维生素D3添加水平为600、900、1200IU/kg时，绵羊肝脏、肾脏和脾脏BAX、Caspase3、Caspase9的相对表达量与对照组相比极显著升高；维生素D3添加水平为900和1200IU/kg时，VDR的相对表达量显著高于对照组；维生素D3添加水平为1200IU/kg时，绵羊脾脏Bcl2的相对表达量与对照组相比有显著升高。维生素D3添加水平为600和900IU/kg时，绵羊胸腺VDR的相对表达量与对照组相比有极显著升高；绵羊肠系膜淋巴BAX、Bcl2、Caspase3、Caspase9和VDR的相对表达量与对照组相比都有极显著升高；表明，维生素D3添加水平在300IU/kg时有利于提高绵羊免疫力及降低组织细胞凋亡。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。