阅读说明：本技术 一种生产耐高温中性蛋白酶的方法 (method for producing high-temperature resistant neutral protease ) 是由 钱娟娟 刘文龙 王克芬 王帅 王兴吉 王金余 张�杰 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物工程技术领域,特别涉及一种生产耐高温中性蛋白酶的方法。该方法所采用的生产菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SJ-215,保藏编号为CGMCC NO.18645。同时本发明并优化了相应的发酵机制,该发酵机制,发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低,发酵酶活力平均在65000U/mL以上；由本发明生产的中性蛋白酶酶活力高、热稳定性好、性能稳定,具有广泛的应用前景。(The invention belongs to the technical field of bioengineering, and particularly relates to a method for producing high temperature resistant neutral protease, wherein the production strain adopted by the method is Bacillus subtilis SJ-215 with the preservation number of CGMCC NO.18645, meanwhile, the method optimizes a corresponding fermentation mechanism, and the fermentation mechanism has the advantages of higher fermentation activity, higher extraction yield, lower manufacturing cost and higher fermentation enzyme activity of over 65000U/mL on average, and the neutral protease produced by the method has high activity, good thermal stability and stable performance, and has broad application prospect.)

一种生产耐高温中性蛋白酶的方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种生产耐高温中性蛋白酶的方法。

背景技术：

蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可以将大分子的蛋白质水解成为氨基酸和小肽等产物。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。外肽酶是从蛋白质分子的游离氨基酸或羧基的末端逐个将肽键水解，进而游离出氨基酸，前者称为氨基肽酶，后者称为羧基肽酶。按其活性中心可以将其分为巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。按其反应的最适pH值，可以将其分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

其中，中性蛋白酶作用条件温和，可以将其应用于制药、食品、皮革、纺织和化工行业，但是由于其热稳定性差，限制了它的工业化生产和广泛应用。高温中性蛋白酶具有良好的热稳定性，弥补了一般中性蛋白酶的不足，生产和使用条件简单，因而具有更加广阔的应用前景。

由于酸性蛋白酶和碱性蛋白酶所要求的反应条件限制了它的广泛应用，所以自20世纪 70年代至今，研究和生产高温中性蛋白酶成为了酶学领域研究的热点之一。目前国外高温中性蛋白酶研究主要是集中在分子生物学与基因工程菌的构建，国内主要是集中在菌种的选育、酶的固定化技术、酶的分子生物学特性等方面的研究。

发明内容

：

为了解决上述技术问题，本发明提供一株能够生产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，同时改进了发酵工艺，提高产中性蛋白酶的酶活，对酶制剂工业具有非常广阔的开发潜力和应用前景。

本发明首先提供一株生产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株由本实验室保存的一株枯草芽孢杆菌经物理和化学复合诱变后获得，具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) SJ-215，该菌株已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCCNO.18645。

本发明还提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SJ-215的发酵产酶方法，具体如下：

(1)发酵培养

a.发酵罐培养基：玉米淀粉8％、蛋白胨0.41％、NaNO₃ 0.6％、KH₂PO₄ 0.2％、KCl0.05％、 MgSO₄·7H₂O 0.07％、CaCO₃1％，pH 6.3；

b.发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min；

c.发酵罐发酵工艺条件：2-4％接种量，罐压0.05-0.08MPa，培养温度30-32℃，搅拌转速 200-220r/min，pH控制6.2-6.4；通风量：1-1.5vvm；

(2)补料培养

培养基质量体积百分比组成如下：

a.补料培养基：玉米淀粉30％，玉米浆3％，氯化钙0.5％，pH 6.3。

b.补料培养基灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。

c.补料方法：发酵培养期间，当pH升至7.0时，开始补料，控制pH在6.2-6.4；

(3)放罐

发酵培养68-73h，酶活增长缓慢，菌体部分开始自溶，即可放罐；

发酵结束时，发酵液中中性蛋白酶的酶活可以达到65000U/mL以上。

(4)中性蛋白酶的提取

发酵结束后，将发酵液经絮凝，压滤，澄清，超滤，加入稳定剂后获得成品。

本发明获得的中性蛋白酶，酶学性质如下：

(1)最适反应温度为75℃，在80℃时也具有较高的酶活；

(2)75℃条件下保温1h其酶活基本不变，在80℃条件下保温1h酶活仍能保持90％以上的活性，当温度升至90℃时，酶活随着保温时间的延长下降为原来的65％左右；

(3)pH为7.0附近时酶活最高；

(4)在pH5.0-8.0的条件下处理2h后，相对酶活力仍然保持在80％以上。

有益效果：

1、本发明提供了一种适于工业化生产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，并优化了相应的发酵机制。该发酵机制，发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低，发酵酶活力平均在 65000U/mL以上；

2、由本发明生产的中性蛋白酶酶活力高、热稳定性好、性能稳定，具有广泛的应用前景。

附图说明：

图1最适作用温度曲线；

图2温度稳定性曲线；

图3最适作用pH曲线；

图4pH稳定性曲线。

具体实施方式

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为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1菌株的诱变选育

1、微波诱变：取5mL生长至对数生长期的菌悬液于试管中，将试管置于含冰块的烧杯中，使用频率为2450MHz，输出功率为700W的美的微波炉，按不同的时间逐个对试管进行照射，稀释梯度为10^-1～10^-6。取处理不同时间的菌液，并分别稀释，取3个梯度(10^-4～10^-6区间)的菌液0.1mL，涂布于筛选平板培养基上，30℃培养16h，计算菌落数，绘制致死率曲线。挑取透明圈较大的单菌落接种到种瓶中，再通过液体培养基测定每个菌株的中性蛋白酶酶活。选择中性蛋白酶产量较高，并且能够稳定遗传3代以上的菌株，作甘油管保藏，并且作为进一步硫酸二乙酯诱变的出发菌株。

2、硫酸二乙酯(DES)诱变：取5mL生长至对数生长期的菌悬液加入到体积为25mL的三角瓶中，再分别加入0.1mL、0.2mL、0.3mL的DES(体积浓度50％)，震荡不同时间，加入0.5mL的硫代硫酸钠(85％)终止反应。取DES不同诱变剂量的菌悬液，并分别稀释，取3个梯度(10^-4～10^-6)的诱变悬液0.1mL，涂布于平板培养基上，倒置在培养箱培养，30℃培养16h。计算菌落数，并绘制致死率曲线。挑取筛选平板上透明圈较大的单菌落接种到种瓶中，再通过液体培养基测定每个菌株的中性蛋白酶的酶活，选取酶活高的菌株进行保存。重复上述步骤进行诱变以及筛选，筛选出一株热稳定性提高的高产中性蛋白酶SJ-215，其酶活较高且能稳定遗传，摇瓶发酵酶活比出发菌株提高了2.6倍。

3、中性蛋白酶高产菌株SJ-215的稳定性传代实验

将中性蛋白酶高产菌株SJ-215于分离平板上划线分离，挑取透明圈较大且生长情况较好的单菌于种瓶培养基中，待生长至对数生长期时，按2％接种量接种到发酵摇瓶中，于30℃， 240r/min条件下培养72h，测定酶活。将该菌株连续传代10次的摇瓶结果如表1所示：

表1.菌株SJ-215稳定性检测结果

将该突变菌株连续培养10代，实验结果由表1可以看出，该突变菌株的遗传稳定性良好。实施例2中性蛋白酶酶活测定方法

1、酶活力的定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH条件下，l min水解酪蛋白产生lμg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。

2、标准曲线的绘制：

配制一系列不同浓度的L-酪氨酸标准溶液(0、10、20、30、40、50μg/mL)，分别取1.00mL(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂使用溶液1mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，分别测定其吸光值，以不含酪氨酸的“0”号管为空白，以吸光值A为纵坐标，酪氨酸浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此曲线应通过零点)。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。

3、酶活力测定方法：分光光度法

①预先将酪蛋白溶液放入40℃±0.2℃恒温水浴锅中,预热5min；

②取四支试管分别加入稀释好的酶液1mL，于40℃±0.2℃恒温水浴锅中预热2min,向其中三支试管(样品管)中分别加入预热的酪蛋白溶液1mL,同时，向另外一支盛有1mL酶液的预热试管(空白管)中加入2mL0.4mol/l的三氯乙酸，摇匀，计时反应10min；

③反应结束，分别向三支样品试管中加入2mL0.4mol/l的三氯乙酸，摇匀，同时，向空白管中加入预热的酪蛋白溶液1mL，摇匀；

④取出四支试管，静置10min，过滤(慢速定性滤纸)；

⑤取1mL滤液加入事先加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液的试管中，再加入1mL福林试剂，于40℃±0.2℃恒温水浴锅中显色20min；

⑥于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。

4、中性蛋白酶酶活力计算公式：

式中：

U----样品的酶活力，U/g(U/mL)；

A----样品平行试验的平均吸光值；

K----吸光常数；

4----反应的总体积；

10---反应时间10min,以1min计；

n----稀释倍数。

所得结果表示至整数，平行试验结果的允许差不得超过3％。

实施例3菌株SJ-215液体发酵生产中性蛋白酶及其提取

1.菌种的培养

培养基质量体积百分比组成如下：

a.平板分离培养基：葡萄糖2％，脱脂奶粉1％，氯化钠2％，酵母粉1％，琼脂1.5-2.0％。 b.种瓶培养基：葡萄糖2％，蛋白胨5％，氯化钠1％，牛肉膏5％，pH 7.0。

c.发酵摇瓶培养基：玉米淀粉8％，玉米粉4％，棉籽蛋白5％，氯化钙0.05％，硫酸镁0.1％，玉米浆4.5％，液化后调pH6.3。

d.培养条件

分离平板：30℃培养16h；种瓶：30℃培养5-6h，摇床转速240r/min；发酵摇瓶：30℃培养72h，摇床转速240r/min。

2.种子罐扩大培养

培养基质量体积百分比组成如下：

a.种子罐培养基：葡萄糖3％，蛋白胨2.5％，(NH₄)₂SO₄ 5％，K₂HPO₄ 1％，MgSO₄·7H₂O 0.5％， pH 7.0。

b.种子罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min。

c.种子罐培养工艺条件：接种量2％，罐压0.05-0.08MPa，培养温度30℃，通风量1vvm，搅拌转速180r/min，pH控制7.0。

d.种子罐移种条件：菌体染色深、粗壮，无杂菌。

3.液态发酵生产中性蛋白酶

培养基质量体积百分比组成如下：

a.发酵罐培养基：玉米淀粉8％、蛋白胨0.41％、NaNO₃ 0.6％、KH₂PO₄ 0.2％、KCl0.05％、 MgSO₄·7H₂O 0.07％、CaCO₃1％，pH 6.3。

b.发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12Mpa条件下，灭菌35min。

c.发酵罐发酵工艺条件：接种量2％，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度30℃，搅拌转速200r/min，pH控制在6.2-6.4范围内，通风量1-1.5vvm。

4.补料

培养基质量体积百分比组成如下：

a.补料培养基：玉米淀粉30％，玉米浆3％，氯化钙0.5％，pH 6.3。

b.补料培养基灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。

c.补料方法：当pH升至7.0时，开始补料，控制pH在6.2-6.4范围内。

5.放罐

培养至68-73h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐。

6.中性蛋白酶酶的提取

发酵结束后，将发酵液经絮凝，压滤，澄清，超滤，加入稳定剂后获得成品。具体操作如下：

a.絮凝：据发酵液体积加入2％磷酸氢二钠、1％无水氯化钙及150PPM聚丙烯酰胺进行絮凝。

b.压滤：按发酵液体积加入3％珍珠岩助滤剂，进行压滤，过滤压力控制在0.55-0.75MPa。

c.澄清：按压滤液体积加入5％硅藻土，经板框精滤机精滤，获得澄清压滤液。

d.超滤：用10000分子量超滤膜对澄清压滤液进行超滤浓缩。

e.添加稳定剂：在浓缩液中加入1.3％海藻糖与10％甘油作为酶稳定保护剂。

应用上述枯草芽孢杆菌诱变菌株CGMCC NO.18645及培养基进行发酵，表2是进行6批发酵的发酵周期和发酵酶活力，平均发酵酶活力为：66263U/mL。

表2. 3L小罐发酵实验结果

批次	发酵周期(h)	发酵酶活力(U/mL)
			1	72	65780
2	70	67000
			3	72	65669
4	73	66880
			5	72	67050
6	73	65201

由表2可以看出，诱变菌株SJ-215发酵水平较稳定，发酵酶活均达到了65000U/mL以上。

实施例4最适反应温度

取实施例3制备的中性蛋白酶成品，以正常条件pH7.5，分别在50、55、60、65、70、75、80、85、90℃条件下测定中性蛋白酶活力，以75℃时的酶活力为100％，分别计算相对酶活。结果如图1所示，最适反应温度为75℃，在80℃时也具有较高的酶活。由实验结果可知，该突变菌株所产中性蛋白酶的最适反应温度明显高于其他来源的中性蛋白酶，而高温中性蛋白酶可以广泛用于皮革、化工、纺织等行业，具有很大的市场应用价值，在工业生产中具有广泛的应用价值。

实施例5热稳定性

取实施例3制备的中性蛋白酶成品，将酶液分别置50、55、60、65、70、75、80、85、90、95℃条件下保温处理60min，保温结束后75℃，pH7.5条件下测定酶活，以50℃时的酶活力为100％计算相对酶活，其实验结果如图2所示。由图可见，75℃条件下保温1h其酶活基本不变，在80℃条件下保温1h酶活仍能保持90％以上的活性，当温度升至90℃时，酶活随着保温时间的延长下降为原来的65％左右。

实施例6最适pH

取实施例3制备的中性蛋白酶成品，在温度为75℃条件下，分别测定其在pH值为5.0、 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5条件下的中性蛋白酶活力，以pH7.0时的酶活力为100％分别计算相对酶活。测定结果如图3所示，中性蛋白酶的酶活在pH为7.0附近时酶活最高。

实施例7耐酸碱性

取实施例3制备的中性蛋白酶成品分别用0.1M的NaOH或0.1M的HCl将其酶液的pH调整为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，分别置于室温条件下静置2h后，75℃条件下测定酶活力，并以未用酸或碱处理之前酶活力为100％计算相对酶活。测定结果如图4所示，在pH5.0-8.0的条件下处理2h后，相对酶活力仍然保持在80％以上。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。