阅读说明：本技术 蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法及其应用 (Production method and application of lumbruse polypeptide antibacterial nutrient solution ) 是由 张宏 谢晓艾 于 2019-09-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法,属于有机农业技术领域,具体涉及一种蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法及其应用。包括步骤一：对蚯蚓、动物脏器进行预处理；步骤二：对步骤一中预处理后的蚯蚓进行分级提取,提取得到三种蚯蚓蛋白酶酶原；步骤三：将步骤二制得的三种酶原分别进行激活,制备得到三种酶。步骤四：将步骤一中预处理后的蚯蚓和动物脏器混合,匀浆,加入纯水,分别加入步骤三中制得的三种蛋白酶,酶解后,过滤,得三种酶促水解液,将三种酶促水解液混合,搅拌均匀后,过滤,得蚓酶多肽抑菌营养液成品。用于植物时,可使得植物长势更好,降低常见病发病率,同时改良土壤,有效提高植物抗病虫和抗逆能力。(The invention provides a production method of lumbruse polypeptide antibacterial nutrient solution, belongs to the technical field of organic agriculture, and particularly relates to a production method and application of lumbruse polypeptide antibacterial nutrient solution. The method comprises the following steps: pretreating earthworms and animal organs; step two: carrying out fractional extraction on the earthworms pretreated in the step one to obtain three earthworm protease zymogens; step three: and (4) respectively activating the three zymogens prepared in the step two to prepare three enzymes. Step four: mixing the earthworms pretreated in the step one with animal organs, homogenizing, adding pure water, respectively adding the three proteases prepared in the step three, performing enzymolysis, filtering to obtain three enzymatic hydrolysates, mixing the three enzymatic hydrolysates, uniformly stirring, and filtering to obtain the finished product of the earthworm enzyme polypeptide antibacterial nutrient solution. When the fertilizer is applied to plants, the plants can grow better, the incidence rate of common diseases is reduced, simultaneously soil is improved, and the disease resistance, insect resistance and stress resistance of the plants are effectively improved.)

蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法及其应用

技术领域

本发明属于多种生物酶联合制备、生物活性成分的分离提取技术和有机农业技术领域，具体涉及一种蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法及其应用。

背景技术

近年来，过量施用化肥农药造成土壤有机质和腐殖质的缺乏，土壤结构遭到破坏，不仅导致土壤肥效降低、土壤酸碱化板结和次生盐渍化，还直接造成了农业生产成本的提高，直接影响农产品的口感和品质。过量使用农用化学品对土壤微生物菌群生态造成破坏的同时导致了生态环境的大范围面源污染。而随着人民生活水平和健康意识的提高，对有机农产品的需求量迅猛提升的同时对生态文明建设提出了更高需求。

蚯蚓是土壤生物群的主要组成成员之一，对土壤形成、维持土壤结构和发挥肥力产生重要影响，被称为“土壤生态系统工程师”。蚯蚓蛋白质含量高达70％，富含镁、锌、锰、铁、钼、硼等多种元素和千余种生物酶，1837年被达尔文称之为地球上最有价值的生物。

中国专利文献CN108299021A一种蚯蚓活性酶多肽液的生产方法公开的技术，将蚯蚓在蚯蚓酶解液作用下快速酶解，从而获得蚯蚓活性酶植物多肽液。其中蚯蚓酶解液按照以下步骤进行：将鲜蚯蚓去除杂质、洗净，沥干；将沥干蚯蚓捣碎，将捣碎的蚯蚓与水按质量比1:0.2～ 0.25比例混合，倒入恒温箱中，设定温度为40～45℃，pH值为6～9条件下，水解24h，每隔 2h搅拌一次；将液体于离心机中，以10000～13000r/min离心，取上清液即为蚯蚓酶解液。但该专利提供的方法未对蚯蚓中的各种酶进行分类，已知蚯蚓中有至少1000种酶存在，不是所有酶都会对植物生长起到促进作用，甚至有些酶会对植物生长起到抑制作用。

可见，现有技术中对于蚯蚓的应用还比较简单，且方法也比较粗糙，甚至有些传统方法会直接撒入白糖使蚯蚓溶解，这样做无法充分提取蚯蚓中所含的有效成分，也无法使有效成分更好地发挥作用。因此，如何研发更加先进的提取方法和营养液配制方式，配制能够更加充分利用蚯蚓体内有效成分的营养液，使其在植物生长等各个方面发挥作用，并且探索其更多的应用领域的生产方法，就成为本领域中迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，如何充分利用蚯蚓中有效成分，使其发挥出更好的作用，用于植物时，使植物长势更好，降低常见病害发病率，同时改良土壤，有效提高植物抗病虫和抗逆能力。本发明提供的技术方案如下：

一种蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：对蚯蚓、动物脏器进行预处理；

步骤二：对步骤一中预处理后的蚯蚓进行分级提取，提取得到三种蚯蚓蛋白酶酶原，分别为碱性蛋白酶酶原A、中性蛋白酶酶原B和酸性蛋白酶酶原C；

步骤三：将步骤二制得的三种酶原分别进行激活，制备得到蚯蚓碱性蛋白酶、蚯蚓中性蛋白酶和蚯蚓酸性蛋白酶；

步骤四：将步骤一中预处理后的蚯蚓和动物脏器混合后，匀浆并加入纯水，加入步骤三中制得的蚯蚓碱性蛋白酶，酶解后过滤，滤液作为得酶促水解液①备用；

将步骤一中预处理后的蚯蚓和动物脏器混合后，匀浆并加入纯水，加入步骤三中制得的蚯蚓中性蛋白酶，酶解后过滤，滤液作为酶促水解液②备用；

将步骤一中预处理后的蚯蚓和动物脏器混合后，匀浆并加入纯水，加入步骤三中制得的蚯蚓酸性蛋白酶，酶解后过滤，滤液作为酶促水解液③备用；

步骤五：取步骤四中制得的三种酶促水解液①②③混合，过滤除去沉淀，得蚓酶多肽抑菌营养液成品。

进一步地，所述步骤一中预处理的步骤包括：

将养殖成熟的蚯蚓从养殖床中分离，清除蚓粪、饲料、泥土，用钾钠复合盐溶液喷雾在蚯蚓体表，翻拌，待蚯蚓排除泥沙后清洗、沥干备用或冷冻保存；

将屠宰后所得的动物脏器，经修割去除脂肪、***，冷冻保存。

进一步地，所述步骤二中提取蚯蚓蛋白酶酶原的步骤包括：

S1：将预处理后的蚯蚓用闪式提取器匀浆，提取，过滤得提取液和沉淀；

S2：将步骤S1中所得提取液加入硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到72-78％进行盐析，过滤得到滤液和沉淀；

S3：将步骤S2中所得沉淀进行回溶、盐析、分离，得到沉淀和清液；

S4：将步骤S3中所得沉淀进行回溶、结晶、分离并将晶体干燥，得到碱性蛋白酶酶原A；

将步骤S3中所得清液纳滤除盐后加入乙醇进行沉淀，分离，得到沉淀和清液；

S5：将步骤S4中所得沉淀回溶、结晶、分离并将晶体干燥，得到中性蛋白酶酶原B；

将步骤S4中所得清液絮凝后分离，得到沉淀和清液；

S6：将步骤S5中所得沉淀回溶、结晶、分离并将晶体干燥，得到酸性蛋白酶酶原C。

进一步地，将步骤S1中所得沉淀并入蚓酶多肽原料，与步骤一中预处理后的蚯蚓一同作为备料；

向步骤S2中所得滤液加入硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到82-88％进行盐析后过滤，将沉淀用于制备蚓激酶原料；

将步骤S5中所得清液用于制备弹性蛋白酶的原料。

进一步地，所述步骤三具体包括：

制备蚯蚓碱性蛋白酶：将步骤一获得的碱性蛋白酶酶原A与纯水按照质量比1.0:1.0-3.0 的比例混合，搅拌溶解，用1.0-2.0mol/L的NaOH调pH值7.5-8.5，搅拌下加入硫酸铵至(NH₄) ₂SO₄饱和度为75％-85％，加入激活剂，在25-35℃环境结晶8-12h，过滤得蛋白酶A结晶，干燥；

制备蚯蚓中性蛋白酶：将步骤一获得的中性蛋白酶酶原B与纯水按照质量比1.0:1.5-4.5 的比例混合，搅拌溶解，用1.0-2.0mol/L的NaOH调pH值5.5-7.5，搅拌下加入硫酸铵至(NH₄) ₂SO₄饱和度为55％-75％，加入激活剂，在25-35℃环境结晶8-12h，过滤得蛋白酶B结晶，干燥；

制备蚯蚓酸性蛋白酶：将步骤一获得的酸性蛋白酶酶原C放入夹层反应釜，按照酸性蛋白酶酶原C与纯水按照质量比1.0:0.5-2.0的比例混合，搅拌溶解，用2.0-4.0mol/L的HCl调 pH值1.0-3.0，加热至40-50℃，加入激活剂，保温3-7h，过滤得滤液，滤液经减压浓缩至原体积的1/3-1/4，进行低温喷雾干燥，喷雾干燥器进风口温度控制在120-150℃，出口温度控制在30-50℃，得蛋白酶C干粉。

进一步地，所述步骤四具体包括：

制备蚯蚓碱性蛋白酶酶促水解液：将步骤一中预处理后的蚯蚓与缓化后的动物脏器按照质量比1.0:0.5-2.0的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓和动物脏器的匀浆与纯水按照质量比 1:0.5-1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓碱性蛋白酶，蚯蚓碱性蛋白酶与底物的质量比为1:500-1000，用1.0-3.0mol/L的NaOH调pH至8.0-10.0，升温至38-45℃，间隔搅拌，酶解10-20h，过滤，得酶促水解液①；

制备蚯蚓中性蛋白酶酶促水解液：将步骤一中预处理后的蚯蚓与缓化后的动物脏器按照质量比1.0:0.5-2.0的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓和动物脏器的匀浆与纯水按照质量比 1:0.5-1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓中性蛋白酶，蚯蚓中性蛋白酶与底物的质量比为1:300-800，升温至38-50℃，间隔搅拌，酶解8-14h，过滤，得酶促水解液②备用；

制备蚯蚓酸性蛋白酶酶促水解液：将步骤一中预处理后的蚯蚓与缓化后的动物脏器按照质量比1.0:0.5-2.0的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓和动物脏器匀浆与纯水按照质量比 1:0.5-1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓酸性蛋白酶，蚯蚓酸性蛋白酶与底物的质量比为1:800-1500，用2.0-4.0mol/L的HCl调pH至1.0-3.0，升温至37-45℃，间隔搅拌，酶解 4-8h，过滤，得酶促水解液③备用。

进一步地，所述步骤五中，取步骤四中制得的三种酶促水解液①②③，分别配置成20-40mg/mL的稀释液后，将三种酶促水解液按1-3:1-3:1-3的比例混合，搅拌均匀，过滤澄清，得蚓酶多肽抑菌营养液成品。最优选的配制比例为1:1:1。

进一步地，本发明还提供前述蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法制备得到的三种酶促水解产物在生物微肥中的应用，其特征在于，步骤四中所述三种酶促水解产物，与常量元素和微量元素经生物反应，制成常量元素微量元素金属螯合物。

进一步地，本发明还提供前述蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法制备得到的三种酶促水解产物在食品或饲料添加剂的应用，其特征在于，步骤四中所述三种酶促水解产物，经真空冷冻干燥或低温喷雾干燥得到的冻干粉或喷雾干燥粉。

进一步地，本发明还提供前述蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法制备的蚓酶多肽抑菌营养液在化妆品中的应用，其特征在于，将所述蚓酶多肽抑菌营养液成品按照质量比1:50-200用纯水稀释。

优选地，所述蚯蚓品种是赤子爱胜蚓、大平二号蚓、印度蓝蚓、安卓爱胜蚓、欧洲夜蚓、非洲夜蚓中的一种或任意比例的两种以上混合使用。

优选地，所述动物脏器是猪脾脏、牛脾脏、牛肝脏、牛胸腺、猪胸腺、羊胎盘、猪胎盘、牛胎盘、牛肺、鸡肠子动物脏器中的一种或任意比例的两种以上混合使用。

和现有技术相比，本发明产生的有益效果如下：

(1)本发明从活体蚯蚓分离三种蚯蚓蛋白酶的酶原；将三种酶原分别进行激活、纯化与结晶干燥；分别用三种蛋白酶对活体蚯蚓、动物脏器的混合底物进行可控性酶促水解反应，得到不同的功能多肽、氨基酸、蚯蚓所含的活性酶及活性物质。

(2)本发明在无任何化学添加的情况下，以活体蚯蚓和动物脏器为原料，分别加入从活体蚯蚓提取的的三种蛋白酶，实现条件可控的酶促水解反应，最大限度保留了蚯蚓体内的活性物质。由于意外发现动物脏器具有抗菌、提高植物抗性的作用，本发明决定将蚯蚓与动物脏器共同作为备料，经蚯蚓中提取出来的酶原激活得到的蛋白酶，抗菌效果更好，有利于提高植物抗性，提高植物生长水平。

(3)本发明提供的蚓酶多肽抑菌营养液稀释后喷施于植物叶片表面，具有提高抗逆性、早熟、叶片及果实增大、增加果实密实度、改善口味、抗病虫害的作用，同时具有改善土壤微生物生态环境的作用。

(4)本发明三种酶促水解反应产物所含的功能多肽、氨基酸和活性物质具有高渗透性，可以直接穿透植物细胞壁而被植物快速吸收，用于合成植物自身的营养物质，吸收效率高、促生长效果显著。

(5)本发明在生产过程中并没有去除蚯蚓自体微生物，保留在酶促反应产物溶液中，能有效恢复土壤微生物活性，改善土壤微生态环境。

(6)本发明的抑菌营养液能提高植物对土壤中营养素的吸收能力，能提高氮磷钾、有机质的利用率30％以上。

(7)本发明的抑菌营养液通过叶面喷施，实现精准施肥，可替代30％-50％化肥的用量，实现化肥的“减施增效”。

(8)本发明的抑菌营养液可有效抑制霉菌、真菌等植物有害菌生长，对红蜘蛛、白粉虱、烟粉虱、蚜虫等有杀灭和驱赶作用，提高植物抗病虫能力。

(9)本发明通过三种蚯蚓蛋白酶，对活体蚯蚓、动物脏器底物进行可控条件的酶促水解反应，得到的功能肽、氨基酸通过生物合成，可以制备常量、微量元素多肽氨基酸螯合物，产物可用于动物饲料和微肥。

(10)本发明可广泛应用于果蔬绵茶、花卉、烟草、园林和大田作物，根据实验表明，其在木本植物中的效果要明显优于草本植物。

附图说明

图1所示为本发明提供的蒜苗种植试验示范趋势图。

图2所示为蚓酶多肽抑菌营养液对黄瓜产量的影响图。

图3所示为蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄产量的影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、特征和优势更加易懂，下面结合具体实施实例进一步详细说明本发明所采用的技术方案及达到的技术效果。

注释：本发明提供的技术方案中，涉及到分离的步骤时，如无特殊说明，可根据实际需要选用过滤、离心等常用分离方式，后文不再赘述。

本发明中激活剂可根据实际需要进行选择，建议可使用结晶牛胰岛蛋白酶。

本发明中“缓化”指冷冻后经缓慢解冻。

本发明中实施例所加入的硫酸铵均为固体硫酸铵，实际使用时也可用高浓度硫酸铵溶液。

本发明中预处理后的蚯蚓进行分级提取，最终提取得到三种蚯蚓蛋白酶酶原。

本发明中进行回溶操作时，所用溶剂的量可以根据实际需要进行选择，实施例仅给出了部分较佳的实施方式。

本发明提供的实施例虽然限定了步骤一至步骤五，但实际操作时，可以在分离得到酶原A 后直接进行激活得到蚯蚓碱性蛋白酶，并进行后续水解步骤。无需完全分离完全酶原A/B/C 后再统一进行激活操作，实施例仅是为理解方便而限定的步骤，实际操作时可以按上述描述，得到酶原B后也直接进行后续操作，无需等待酶原C分离完全。

实施例1：

步骤一：对蚯蚓、动物脏器进行预处理。具体步骤为：

将养殖成熟的蚯蚓从养殖床中分离，清除蚓粪、饲料、泥土，用0.45％的氯化钠和0.15％的磷酸二氢钾复合盐溶液(钾钠复合盐溶液)迅速喷雾在蚯蚓体表，翻拌均匀，待蚯蚓排除泥沙后清洗、沥干备用或冷冻保存；选取经检疫正常屠宰的动物脏器，经修割去除脂肪、***，冷冻保存备用。

步骤二：对预处理后的蚯蚓进行分级提取，提取得到三种蚯蚓蛋白酶酶原。具体步骤为：

将一部分预处理后的蚯蚓，提取制备三种蚯蚓蛋白酶酶原，分别为酶原A、酶原B和酶原C，具体提取工艺如下：

S1：将预处理后的蚯蚓用闪式提取器匀浆，用纯水提取，过滤得提取液和沉淀；

S2：将步骤S1中所得沉淀并入蚓酶多肽原料，与步骤一中预处理后的蚯蚓可一同作为备料；

将步骤S1中所得提取液加入固体硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到75％进行盐析后过滤；

S3：将步骤S2中所得滤液加入固体硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到85％进行盐析后过滤，将沉淀用于制备蚓激酶原料(这是另一个应用，与本发明后续工艺无关)。

将步骤S2中所得沉淀按照质量比1:3的比例，加入纯水进行回溶、加入固体硫酸铵至饱和度为90％进行盐析，按照4000rpm/min，30min离心分离，得到沉淀和上清液；

S4：将步骤S3中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行回溶，加入固体硫酸铵至饱和度 90％，结晶、分离并将晶体干燥，得到碱性蛋白酶酶原A；

将步骤S3中所得清液纳滤除盐后加入95％乙醇，使乙醇质量浓度达55％，沉淀15h，过滤得沉淀和清液，清液可对乙醇进行部分回收；

S5：将步骤S4中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行回溶，加固体硫酸铵至饱和度为 65％，加入NaCl至饱和度为20％，结晶、分离并将晶体干燥，得到中性蛋白酶酶原B；

将步骤S4中所得清液加入总质量0.5‰的聚二甲基二丙烯基氯化铵絮凝剂，絮凝后以 4000rpm/min，30min离心分离，得到沉淀和上清液；

S6：将步骤S5中所得清液用于制备弹性蛋白酶的原料(这是再另一个应用，与本发明后续工艺无关)。

将步骤S5中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行回溶、加固体硫酸铵至饱和度为70％，加入NaCl至饱和度为20％，结晶、分离并将晶体干燥，得到酸性蛋白酶酶原C。

步骤三：将步骤二制得的三种酶原分别进行激活，制备得到蚯蚓碱性蛋白酶、蚯蚓中性蛋白酶和蚯蚓酸性蛋白酶。具体步骤为：

蚯蚓碱性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原A与纯水按照质量比1.0:2.0的比例混合，搅拌溶解，用1.0mol/L的NaOH调pH值8.0，搅拌下加入固体硫酸铵至(NH₄)₂SO₄饱和度为80％，加入溶液总质量0.1‰(质量分数)的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，在30℃环境结晶10h (依结晶情况而定)，过滤得蛋白酶A结晶，经真空干燥后备用。

蚯蚓中性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原B与纯水按照质量比1.0:3.0的比例混合，搅拌溶解，用1mol/L的NaOH调pH值6，搅拌下加入固体硫酸铵至(NH₄)₂SO₄饱和度为65％，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，在30℃环境结晶10h，过滤得蛋白酶B结晶，经真空干燥后备用。

蚯蚓酸性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原C置夹层反应釜，按照酶原C与纯水按照质量比1.0:1.0的比例混合，搅拌溶解，用3.0mol/L的HCl调pH值2.0，加热至50℃，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，保温4h，过滤得滤液，滤液经减压浓缩至原体积的1/4，进行低温喷雾干燥，喷雾干燥器进风口温度控制在130℃，出口温度控制在40℃，得蛋白酶C干粉备用。

步骤四：将其它预处理后的蚯蚓与动物脏器混合，加入前面制备得到的三种蛋白酶，制备酶促水解液。具体步骤如下：

蚯蚓碱性蛋白酶酶促水解液制备：将备料的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.5:0.5的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓、动物脏器匀浆与纯水按照质量比 1:1.0的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓碱性蛋白酶，蚯蚓碱性蛋白酶与底物的质量比为1:800，用2.0mol/L的NaOH调pH值9.0，升温至45℃，间隔搅拌，酶解15h，过滤，得酶促水解液①备用。

蚯蚓中性蛋白酶酶促水解液制备：将备料的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.5:0.5的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓和动物脏器匀浆与纯水按照质量比 1:1的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓中性蛋白酶，蚯蚓中性蛋白酶与底物的质量比为 1:500，升温至50℃，间隔搅拌，酶解11h，过滤，得酶促水解液②备用。

蚯蚓酸性蛋白酶酶促水解液制备：将备料的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.5:0.5的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓、动物脏器匀浆与纯水按照质量比 1:0.7的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓酸性蛋白酶，蚯蚓酸性蛋白酶与底物的质量比为1:1200，用2.0mol/L的HCl调pH值3.0，升温至42℃，间隔搅拌，酶解6h，过滤，得酶促水解液③备用。

步骤五：蚓酶多肽抑菌营养液的配制

将前述步骤制备的酶促水解液①②③分别稀配成30mg/mL的稀释液，按照质量比1:1:1 的比例混合，搅拌均匀后，过滤澄清，灌装成100mL/瓶、500mL/瓶、1000mL/瓶三种规格的 PGE瓶装包装，铝塑膜高频封口，检验后得到蚓酶多肽抑菌营养液成品。

实施例2：

步骤一：对蚯蚓、动物脏器进行预处理。具体步骤为：

将养殖成熟的蚯蚓从养殖床中分离，清除蚓粪、饲料、泥土，用0.45％的氯化钠和0.15％的磷酸二氢钾复合盐溶液(钾钠复合盐溶液)迅速喷雾在蚯蚓体表，翻拌均匀，待蚯蚓排除泥沙后清洗、沥干备用或冷冻保存；选取经检疫正常屠宰的动物脏器，经修割去除脂肪、***，冷冻保存备用。

步骤二：对预处理后的蚯蚓进行分级提取，提取得到三种蚯蚓蛋白酶酶原。具体步骤为：

将一部分预处理后的蚯蚓，提取制备三种蚯蚓蛋白酶酶原，分别为酶原A、酶原B和酶原C，具体提取工艺如下：

S1：将步骤1中预处理后的蚯蚓用闪式提取器匀浆，用纯水提取，过滤得提取液和沉淀；

S2：将步骤S1中所得沉淀并入蚓酶多肽原料，与步骤一中预处理后的蚯蚓一同作为备料；

将步骤S1中所得提取液加入硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到72％进行盐析后，过滤；

S3：将步骤S2中所得滤液硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到82％盐析后过滤，将沉淀用于制备蚓激酶原料；

将步骤S2中所得沉淀按照质量比1:3的比例，加入纯水进行回溶、加入硫酸铵至饱和度为89％进行盐析，4000rpm/min，30min离心分离，得到沉淀和上清液；

S4：将步骤S3中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行回溶，加入硫酸铵至饱和度89％，结晶、分离并将晶体干燥，得到碱性蛋白酶酶原A；

将步骤S3中所得清液纳滤除盐后加入95％乙醇，使乙醇质量浓度达50％，沉淀10h，过滤得沉淀和清液，清液可对乙醇进行部分回收；

S5：将步骤S4中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行回溶，加硫酸铵至饱和度为64％，加入NaCl至饱和度为19％，结晶、分离并将晶体干燥，得到中性蛋白酶酶原B；

将步骤S4中所得清液加入总质量0.5‰的聚二甲基二丙烯基氯化铵絮凝剂，絮凝后 4000rpm/min，30min离心分离，得到沉淀和上清液；

S6：将步骤S5中所得清液用于制备弹性蛋白酶的原料。

将步骤S5中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行回溶，加硫酸铵至饱和度为69％，加入NaCl至饱和度为19％，结晶、分离并将晶体干燥，得到酸性蛋白酶酶原C。

步骤三：将步骤二制得的三种酶原分别进行激活，制备得到蚯蚓碱性蛋白酶、蚯蚓中性蛋白酶和蚯蚓酸性蛋白酶。具体步骤为：

蚯蚓碱性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原A与纯水按照质量比1.0:1.0的比例混合，搅拌溶解，用2mol/L的NaOH调pH值7.5，搅拌下加入固体硫酸铵至(NH₄)₂SO₄饱和度为75％，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，在26℃环境结晶11h，过滤得蛋白酶A 结晶，经真空干燥后备用。

蚯蚓中性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原B与纯水按照质量比1.0:1.5的比例混合，搅拌溶解，用2mol/L的NaOH调pH值5.5，搅拌下加入硫酸铵至(NH4)₂SO₄饱和度为55％，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，在25℃环境结晶12h，过滤得蛋白酶B结晶，经真空干燥后备用。

蚯蚓酸性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原C置夹层反应釜，按照酶原C与纯水按照质量比1.0:0.5的比例混合，搅拌溶解，用2.0mol/L的HCl调pH值3.0，加热至40℃，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，保温3h，过滤得滤液，滤液经减压浓缩至原体积的1/3,进行低温喷雾干燥，喷雾干燥器进风口温度控制在120℃，出口温度控制在40℃，得蛋白酶C干粉备用。

步骤四：将其它预处理后的蚯蚓与动物脏器混合，加入前面制备得到的三种蛋白酶，制备酶促水解液。具体步骤如下：

蚯蚓碱性蛋白酶酶促水解液制备：将备料的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.5:1的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓、动物脏器匀浆与纯水按照质量比1:0.8的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓碱性蛋白酶，蚯蚓碱性蛋白酶与底物的质量比为1:500，用2.0mol/L的NaOH调pH值10.0，升温至38℃，间隔搅拌，酶解10h，过滤，得酶促水解液①备用。

蚯蚓中性蛋白酶酶促水解液制备：将备料的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.5:1的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓、动物脏器匀浆与纯水按照质量比 1:0.8的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓中性蛋白酶，蚯蚓中性蛋白酶与底物的质量比为1:300，升温至40℃，间隔搅拌，酶解8h，过滤，得酶促水解液②备用。

蚯蚓酸性蛋白酶酶促水解液制备：将备料的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.5:1的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓、动物脏器匀浆与纯水按照质量比 1:0.8的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓酸性蛋白酶，蚯蚓酸性蛋白酶与底物的质量比为1:800，用3.0mol/L的HCl调pH值2.0，升温至37℃，间隔搅拌，酶解4h，过滤，得酶促水解液③备用。

步骤五：蚓酶多肽抑菌营养液的配制

将前面制备的酶促水解液①②③分别稀配成20mg/mL的稀释液，按照质量比1:1:3的比例混合，搅拌均匀后，过滤澄清，灌装成100mL/瓶、500mL/瓶、1000mL/瓶三种规格的PGE瓶装包装，铝塑膜高频封口，检验后得到蚓酶多肽抑菌营养液成品。

实施例3：

步骤一：对蚯蚓、动物脏器进行预处理。具体步骤为：

将养殖成熟的蚯蚓从养殖床中分离，清除蚓粪、饲料、泥土，用0.45％的氯化钠和0.15％的磷酸二氢钾复合盐溶液(钾钠复合盐溶液)迅速喷雾在蚯蚓体表，翻拌均匀，待蚯蚓排除泥沙后清洗、沥干备用或冷冻保存；选取经检疫正常屠宰的动物脏器，经修割去除脂肪、***，冷冻保存备用。

步骤二：对预处理后的蚯蚓进行分级提取，提取得到三种蚯蚓蛋白酶酶原。具体步骤为：

将一部分预处理的蚯蚓，提取制备三种蚯蚓蛋白酶酶原，分别为酶原A、酶原B和酶原C，具体提取工艺如下：

S1：将步骤1中预处理后的蚯蚓用闪式提取器匀浆，用纯水提取，过滤；

S2：将步骤S1中所得沉淀并入蚓酶多肽原料，与步骤一中预处理后的蚯蚓一同作为备料；

将步骤S1中所得提取液加入固体硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到78％进行盐析后过滤；

S3：将步骤S2中所得滤液加入固体硫酸铵，使其饱和度达到88％后盐析并过滤，将沉淀用于制备蚓激酶原料；

将步骤S2中所得沉淀按照质量比1:3的比例，加入纯水进行回溶、加入固体硫酸铵至饱和度为91％进行盐析，4000rpm/min，30min离心分离，得到沉淀和上清液；

S4：将步骤S3中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行进行回溶，加入固体硫酸铵至饱和度91％，结晶、分离并将晶体干燥，得到碱性蛋白酶酶原A；

将步骤S3中所得清液纳滤除盐后加入95％乙醇，使乙醇质量浓度达60％，沉淀18h，过滤得沉淀和清液，清液可对乙醇进行部分回收；

S5：将步骤S4中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行回溶，加固体硫酸铵至饱和度为66％，加入固体NaCl至饱和度为21％，结晶、分离并将晶体干燥，得到中性蛋白酶酶原B；

将步骤S4中所得清液加入总质量0.5‰的聚二甲基二丙烯基氯化铵絮凝剂，絮凝后 4000rpm/min，30min离心分离，得到沉淀和上清液；

S6：将步骤S5中所得清液用于制备弹性蛋白酶的原料。

将步骤S5中所得沉淀按照质量比1:2加入纯水进行回溶，加固体硫酸铵至饱和度为71％，加入固体NaCl至饱和度为21％，结晶、分离并将晶体干燥，得到酸性蛋白酶酶原C。

步骤三：将步骤二制得的三种酶原分别进行激活，制备得到蚯蚓碱性蛋白酶、蚯蚓中性蛋白酶和蚯蚓酸性蛋白酶。具体步骤为：

蚯蚓碱性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原A与纯水按照质量比1.0:3.0的比例混合，搅拌溶解，用2.0mol/L的NaOH调pH值8.5，搅拌下加入固体硫酸铵至(NH₄)₂SO₄饱和度为85％，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，在33℃环境结晶8h，过滤得蛋白酶A结晶，经真空干燥后备用。

蚯蚓中性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原B与纯水按照质量比1.0:4.5的比例混合，搅拌溶解，用2.0mol/L的NaOH调pH值7.5，搅拌下加入硫酸铵至(NH4)₂SO₄饱和度为75％，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，在35℃环境结晶8h，过滤得蛋白酶B结晶，经真空干燥后备用。

蚯蚓酸性蛋白酶激活与制备：将获得的酶原C置夹层反应釜，按照酶原C与纯水按照质量比1.0:2.0的比例混合，搅拌溶解，用4.0mol/L的HCl调pH值1.0，加热至45℃，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，保温7h，过滤得滤液，滤液经减压浓缩至原体积的1/4，进行低温喷雾干燥，喷雾干燥器进风口温度控制在150℃，出口温度控制在50℃，得蛋白酶C干粉备用。

步骤四：将其它预处理后的蚯蚓与动物脏器混合，加入前面制备得到的三种蛋白酶，制备酶促水解液。具体步骤如下：

蚯蚓碱性蛋白酶酶促水解液制备：将备料(指预处理)的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.25:0.25的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓、动物脏器匀浆与纯水按照质量比1:1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓碱性蛋白酶，蚯蚓碱性蛋白酶与底物的质量比为1:1000，用3.0mol/L的NaOH调pH值8.0，升温至40℃，间隔搅拌，酶解 20h，过滤，得酶促水解液①备用。

蚯蚓中性蛋白酶酶促水解液制备：将备料的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.25:0.25的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓、动物脏器匀浆与纯水按照质量比1:1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓中性蛋白酶，蚯蚓中性蛋白酶与底物的质量比为1:800，升温至38℃，间隔搅拌，酶解14h，过滤，得酶促水解液②备用；

蚯蚓酸性蛋白酶酶促水解液制备：将备料的活体赤子爱胜蚓与缓化后的猪脾脏、猪胸腺按照质量比1.0:0.5:0.5的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓、动物脏器匀浆与纯水按照质量比 1:1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓酸性蛋白酶，蚯蚓酸性蛋白酶与底物的质量比为1:1500，用4.0mol/L的HCl调pH值1.0，升温至40℃，间隔搅拌，酶解8h，过滤，得酶促水解液③备用；

步骤五：蚓酶多肽抑菌营养液的配制

将前面制备的酶促水解液①②③分别稀配成40mg/mL的稀释液，按照质量比1:3:1的比例混合，搅拌均匀后，过滤澄清，灌装成100mL/瓶、500mL/瓶、1000mL/瓶三种规格的PGE瓶装包装，铝塑膜高频封口，检验后得到蚓酶多肽抑菌营养液成品。

对比例1

制备工艺与实施例1相同，与实施例1不同之处在于：不使用动物脏器，将实施例1中用到的动物脏器替换成等量的赤子爱胜蚓。

对比例2

制备方法与实施例1相同，与实施例1不同之处在于：仅使用酶促水解液①稀配成30mg/mL 的稀释液后，配置蚓酶多肽抑菌营养液成品。

对比例3

制备方法与实施例1相同，与实施例1不同之处在于：仅使用酶促水解液②稀配成30mg/mL 的稀释液后，配置蚓酶多肽抑菌营养液成品。

对比例4

制备方法与实施例1相同，与实施例1不同之处在于：仅使用酶促水解液③稀配成30mg/mL 的稀释液后，配置蚓酶多肽抑菌营养液成品。

对比例5

制备方法与实施例1部分相同，不同之处在于：将步骤S1中所得提取液直接作为酶解液加入预处理后的蚯蚓和动物脏器中进行酶解，并继续实施例1中的后续步骤。

对比例6

制备方法与实施例1部分相同，不同之处在于：

步骤二到步骤三中，酶的制备方法替换为：向部分步骤一中预处理后的蚯蚓中加入质量比为20％的白糖，进行自溶，溶解后过滤，取滤液作为蚯蚓酶解液加入预处理后的蚯蚓和动物脏器中进行酶解，并继续实施例1中的后续步骤。(对比例6为本领域中常规传统方案)

测试例1：蚓酶多肽抑菌营养液对草本植物和木本植物的不同效果

研究发现，本发明提供的蚓酶多肽抑菌营养液在不同植物中可具有不同的促进效果，尤其是对于木本植物，喷施后效果要明显优于草本植物。本发明进行了实验如下：

(1)草本植物——蒜苗

T1水培蒜苗，出苗后按常规方法栽培。

T2水培蒜苗，出苗3cm后喷施实施例1制备的蚓酶多肽抑菌营养液，按照1:150倍配制稀释液，选择下午6:00后喷施叶面、叶背、茎秆，间隔7天喷施1次，喷施4次后记录植物生长情况。

T3：使用对比例6制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

表1.蒜苗喷施蚓酶多肽抑菌营养液成分对比

表1证明，喷洒对比例6方法制备的营养液后，对蒜苗生长没有起到促进作用，甚至起到一定抑制作用。

(2)木本植物——樱桃

T1：呼和浩特市本地樱桃，常规施肥、浇水。

T2：呼和浩特市本地樱桃，常规施肥、浇水。使用实施例1制备的蚓酶多肽抑菌营养液。开花坐果后5天喷施蚓酶多肽抑菌营养液，按照1:150倍配制稀释液，选择下午6:00后喷施叶背、茎秆，间隔15天进行第二次喷施喷施，喷施2次后记录植物生长情况。

T3：使用实施例2制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

T4：使用实施例3制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

T5：使用对比例1制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

T6：使用对比例2制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

T7：使用对比例3制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

T8：使用对比例4制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

T9：使用对比例5制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

T10：使用对比例6制备的蚓酶多肽抑菌营养液。其余同T2。

表2.呼和浩特市本地樱桃生长情况

通过上述测试例1可以看出，本发明对于木本植物和草本植物均有较好的效果，可以提前成熟期，且有明显增产效果。另外，测试例1的两种植物对比也可以发现，本实施例提供的营养液对于木本植物(蒜苗)的增产效果要明显优于草本植物(樱桃)。实际生产中发现，对于木本植物，尤其是在樱桃种植的坐果期左右，仅喷施一次蚓酶多肽抑菌营养液，也达到比参照组早熟一周，果粒更大、果肉更甜、更紧致，颜色更鲜亮的效果。

通过测试例1中的对比数据可以看出，使用动物脏器的对比例1对樱桃生长可以起到一定促进作用，但是其促进效果要比同时使用动物脏器和蚯蚓的实施例1差。

通过与对比例2-6的比较，也进一步说明了本发明所提供技术方案对比其它方案有更好的效果。尤其是对比例5的方案可以看出，不分离三种酶原并激活得到三种酶，而是将本发明步骤S1中所得提取液直接作为酶解液，虽然对植物生长能够起到一定的效果，但是其效果要远远差于本发明的技术方案。这是因为，本发明提供的方案对三种酶原做了分离，并进一步激活，酶解底物，由于方案更加精细，可以对蚯蚓和动物脏器中的有效成分起到更好的提取作用，因此用于植物上时，能够具有更好的效果。

从对比例6的方案可以看出，与传统直接使用白糖溶解的方案来比较，本发明提供的技术方案增产效果非常明显，对比例6的方案甚至有一定的减产作用。这是因为，对比例6所使用的酶实质上相当于本发明中加入硫酸铵至85％饱和度后分离的用于制备蚓激酶的原料，这属于是纤维溶解酶，实际试验发现其对于植物生长可能会起到一定抑制作用。本发明中是将加入硫酸铵至85％饱和度后分离所得沉淀进一步处理，分离三种酶原，并激活得到三种酶。可见本发明和对比例6所用的传统方案并不相同，分离所得到的酶也不同。蚯蚓内已知有各种不同类型的酶，本发明分离出了三种类型的酶原，并分别激活后使用，实验证明，对多种植物生长可以起到很好的促进作用。

测试例2：蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄生长的影响

(1)材料与方法

供试作物：樱桃番茄；供试品种：千禧。

供试肥料：蚓酶多肽抑菌营养液，选用人工饲养、无污染的蚯蚓为原料，采用原始首创的自酶法生产技术，含有抗菌肽、溶菌酶、多种氨基酸、多种维生素、微量元素及多种土壤微生物和芽孢，对果蔬、农作物具有增花、早熟、增产、抑菌、抗病虫、提高品质、延长储存期、改善土壤微生物生态等作用。

试验时间：2019年3月27日2019年7月12日。

试验地点：南京市蔬菜科技园现代化大棚内。

试验设如下两个处理：

T1：CK(空白)。基肥：普通商品有机肥施用量为500kg/亩，45％复合肥(15-15-15)施用量30kg/亩。

T2：实施例1制备的蚓酶多肽抑菌营养液。基肥：普通商品有机肥施用量为500kg/亩， 45％复合肥(15-15-15)施用量30kg/亩。蚓酶多肽抑菌营养液在幼苗定植十天后开始喷施。喷施方法：稀释200倍液喷施，每15天一次，整个生育期喷施4次。喷施应选择下午4:00以后或阴天，以免阳光辐射造成喷施液的快速蒸发。具体喷施时间如表3：

表3蚓酶多肽抑菌营养液具体喷施时间

田间管理采用常规管理模式。苗期测定植株株高、茎粗、SPAD值等生长指标，可溶性糖、蛋白、Vc和有机酸等品质指标及作物产量。

(2)结果与分析

1)蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄植株生长的影响

从表4可以看出，T2的株高和茎粗与对照T1相比有一定的提高，但是增幅不显著；而在 SPAD值上，T2低于T1。说明蚓酶多肽抑菌营养液对于促进樱桃番茄植株的生长效果不显著。

表4蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄生长的影响

在樱桃番茄长势上，对照T1和喷施蚓酶多肽抑菌营养液的T2差异不明显。

2)蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄品质的影响

表5表明，与T1相比，T2处理下的可溶性蛋白含量有明显提高；而可溶性糖含量、Vc含量和有机酸含量有所降低。说明蚓酶多肽抑菌营养液能提高樱桃番茄的可溶性蛋白含量，同时降低有机酸含量；在提高可溶性糖含量和Vc含量上无明显效果。

表5蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄品质的影响

3)蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄青枯病发病率的影响

从表6可以看出，喷施蚓酶多肽抑菌营养液处理的小区，樱桃番茄的发病率为0％，而对照T1的发病率高达38.2％。

表6蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄抗病性的影响

4)蚓酶多肽抑菌营养液对樱桃番茄产量的影响

图3表明，T2与T1相比增产量为488.34kg/亩，增幅高达24.9％。说明喷施蚓酶多肽抑菌营养液对于增加樱桃番茄的产量效果显著。

(3)结论

通过本次试验得出以下结论：喷施蚓酶多肽抑菌营养液不仅能有效提高樱桃番茄的抗病能力，而且能显著提高其产量，提高其经济效益。同时喷施蚓酶多肽抑菌营养液能提高樱桃番茄的可溶性蛋白含量，降低有机酸含量，改善樱桃番茄的品质。

测试例3：蚓酶多肽抑菌营养液在蒜苗种植中的影响

(1)试验材料与方案

试验地点：内蒙古呼和浩特市。试验对象：蒜苗。供试材料：大蒜品种为白马牙，本发明蚓酶多肽抑菌营养液，市售腐殖酸叶面肥，市售植物源多肽液。

试验方案：

1)本试验共设4个试验组，分别为1#：蚓酶多肽组、2#：腐殖酸叶面肥组、3#：植物源多肽液组和4#：对照组。选取同一温室4个水泥池苗床内贴瓷砖，水泥池深度10cm，均为1×5m，面积5m²，分别标记为1#、2#、3#和4#；采用无土整蒜头水培，播种前水浸泡40小时剔除蒜头底盘和蒜薹；每个水泥苗床种植80Kg，苗床摆放蒜头后上面用木板拍压，使蒜头充分接触床面；打透水；覆盖石英砂3-4厘米。

其中，1#：蚓酶多肽组，所用材料为前述实施例1中制备所得蚓酶多肽抑菌营养液。

2)温湿度管理，白天应保持20-22℃，夜间应保持13-16℃。整个生长期，前期温度应高于后期2-3℃。苗高10cm时，开始浇水，每隔2-3天用喷淋浇水一次。

3)蚓酶多肽抑菌营养液喷施，蒜苗出苗至3cm且4个苗床出苗整齐，开始喷施蚓酶多肽抑菌营养液、腐殖酸叶面肥、植物源多肽液稀释液，原液1:150质量比稀释，喷施组每个苗床原液用量20mL。

4)收割，蒜苗高30-40cm并开始进行收割。割后将床面搂平进行正常管理，每隔18天收割一茬，共收割3茬。

5)试验检测：在整个试验过程中，检测各试验组同期蒜苗的茎秆粗细、植株高度、叶片宽度和重量。

(2)结果与分析

经过对比试验可以看出，1#蚓酶多肽试验组总增重量高于2#、3#市售叶面肥试验组，收获的蒜苗在茎秆直径、植株高度、叶片宽度和收获量方面均具有明显优势。详见表7及附图1：

表7蒜苗种植试验示范数据表

①茎秆直径：茎秆比不喷施蚓酶多肽的蒜苗粗，可以增强蒜苗的抗倒伏能力；

②植株高度：植株高度比未喷施蚓酶多肽的蒜苗高10-17％，蒜苗生长快、成熟期早；

③叶片宽度：叶片比未喷施蚓酶多肽的蒜苗宽1-3mm且增厚，颜色墨绿，增强植物光合作用和对养分的吸收能力；

④增重量：参见附图1，增重量比2#市售腐殖酸叶面肥增加27.5％，比3#市售植物源多肽液增加17.9％，比4#对照组增加22.3％，具有显著的经济效益和环境生态效益。

测试例4：蚓酶多肽抑菌营养液对水果黄瓜生长和产量的影响

(1)材料与方法

供试作物及品种：水果黄瓜为南水2号。

供试肥料为前文实施例1制备所得蚓酶多肽抑菌营养液，选用人工饲养、无污染的蚯蚓为原料，采用原始首创的自酶法生产技术，含有抗菌肽、溶菌酶、多种氨基酸、多种维生素、微量元素及多种土壤微生物和芽孢，对果蔬、农作物具有增花、早熟、增产、抑菌、抗病虫、提高品质、延长储存期、改善土壤微生物生态等作用。

试验时间：黄瓜为2019年3月21日至2019年5月28日，试验地点设在南京市蔬菜科技园现代化大棚内。

试验设计与方法：

试验设如下两个处理：

T1：CK。基肥：普通商品有机肥施用量为500kg/亩，45％复合肥(15-15-15)施用量30kg/ 亩。

T2：蚓酶多肽抑菌营养液。基肥：普通商品有机肥施用量为500kg/亩，45％复合肥(15-15-15)施用量30kg/亩。蚓酶多肽抑菌营养液定植十天后开始喷施。喷施方法：稀释200倍液喷施，每15天一次，整个生育期喷施5次。喷施应选择下午4:00以后或阴天，以免阳光辐射造成喷施液的快速蒸发。具体喷施时间如表8：

表8蚓酶多肽抑菌营养液具体喷施时间

田间管理采用常规管理模式。测定植株株高、茎粗、SPAD值等生长指标，可溶性糖、蛋白、硝酸盐、Vc和有机酸等品质指标和作物产量。

(2)结果与分析

1)蚓酶多肽抑菌营养液对水果黄瓜生长的影响：

从表9可以看出，与对照相比，蚓酶多肽抑菌营养液能提高水果黄瓜的株高和茎粗。与对照相比株高增加了19.2cm，增长幅度为22.6％；茎粗增加了0.4mm，增长幅度为4％，说明蚓酶多肽抑菌营养液能有效促进水果黄瓜的生长。喷施蚓酶多肽抑菌营养液的水果黄瓜长势更好。

表9蚓酶多肽抑菌营养液对水果黄瓜生长的影响

2)蚓酶多肽抑菌营养液对黄瓜品质的影响

表10表明，与T1相比，T2处理下的可溶性糖含量和Vc含量以及有机酸含量均有提高，而蛋白含量、硝酸盐含量有所降低，说明蚓酶多肽抑菌营养液能提高水果黄瓜的可溶性糖含量和Vc含量，降低其硝酸盐含量；但在提高蛋白和降低有机酸含量上效果不显著。

表10蚓酶多肽抑菌营养液对黄瓜品质的影响

3)蚓酶多肽抑菌营养液对黄瓜产量的影响

参见图2可知，T2＞T1，T2与T1相比增产量为867.62kg/亩，增幅达到21.3％。说明喷施蚓酶多肽抑菌营养液能显著增加水果黄瓜的产量。

(3)结论

通过本次试验得出以下结论：喷施蚓酶多肽抑菌营养液不仅能促进水果黄瓜的生长，而且能提高水果黄瓜产量。喷施蚓酶多肽抑菌营养液能提高水果黄瓜的可溶性糖含量和Vc含量，降低其硝酸盐含量，改善水果黄瓜的品质；同时蚓酶多肽抑菌营养液能有效提高水果黄瓜的经济效益。

测试例5：蚓酶多肽抑菌营养液对枸杞白粉病防治的效果

枸杞白粉病，病原菌为半知菌亚门的粉孢属，枸杞白粉病主要危害叶片，严重时可危害花和幼果。染病植株发病时叶面和叶背有明显的粉状霉层，受害嫩叶常皱缩、卷曲和变形，病株光合作用受阻，叶片提前脱落，导致枸杞长势下降。

T1：实施例1制备的蚓酶多肽抑菌营养液按照1:150倍配制稀释液，选择下午6:00后喷施叶面、叶背、茎秆，喷施1次后防治效果显著见表11。

T2：使用对比例1制备的蚓酶多肽抑菌营养液，其余同实施例1。

T3：使用对比例5制备的蚓酶多肽抑菌营养液，其余同实施例1。

T4：使用对比例6制备的蚓酶多肽抑菌营养液，其余同实施例1。

表11枸杞白粉病喷施蚓酶多肽前后对照

测试例6：蚓酶多肽抑菌营养液对番茄青枯病防治的效果

青枯病由细菌青枯假单胞菌Pseudomanas solanacearum Smith侵染引起。危害番茄、茄子、辣椒、马铃薯、生姜等多种作物。病原菌主要随病残体在田间或块茎上越冬。该菌主要通过雨水、灌溉水及农具传播。病菌从根部或茎基部伤口侵入，在植株体内的维管束组织中扩展，造成导管堵塞及细胞中毒。受害植株苗期危害症状不明显，植株开花以后，病株开始表现出危害症状。叶片色泽变淡，呈萎蔫状。叶片萎蔫先从上部叶片开始，随后是下部叶片，最后是中部叶片。发病初始叶片中午萎蔫，傍晚、早上恢复正常，反复多次，萎蔫加剧，最后枯死，但植株仍为青色。

实施例1制备的蚓酶多肽抑菌营养液按照1:200倍配制稀释液，选择下午6:00后喷施叶面、叶背、茎秆，定植后间隔15天喷施1次，喷施4次后试验组植株未出现发病症状。

表12喷施蚓酶多肽预防樱桃番茄青枯病对照

测试例7：蚓酶多肽抑菌营养液在防治虫害中的效果

测试了实施例1制备的蚓酶多肽抑菌营养液在防治蚜虫、红蜘蛛、烟粉虱、白粉虱等多种虫害中的效果。表13展示了容易发生虫害的植物以及常见症状。将实施例1中制备的蚓酶多肽抑菌营养液按照1:150配制稀释液，选择下午6:00后喷施于表13所示植物的叶面、叶背、茎秆，喷施后防治效果见下表14。

表13发生虫害植物

表14喷施蚓酶多肽抑菌营养液效果

本发明的具体实施方式已对本发明的内容作出了详尽的说明，但不局限本实施例，本领域技术人员根据本发明的启示所做的任何显而易见的改动，都属于本发明权利保护的范围。