阅读说明：本技术 一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法 (Method for purifying neutral or alkaline protease ) 是由 石亚伟 文阳宣 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法,通过化学合成编码eglinC突变体的DNA序列,构建eglinC突变体的重组表达载体,利用大肠杆菌重组表达并纯化eglinC突变体蛋白,然后将蛋白偶联在sepharose4B柱材料,利用eglinC突变体和蛋白酶的特异结合来分离纯化细菌表达的中性或碱性蛋白酶。本发明利用eglinC突变体构建的亲和纯化系统,方法简单,操作步骤少,酶活损失低,纯化倍数高。(The invention discloses a method for purifying neutral or alkaline protease, which comprises the steps of constructing a recombinant expression vector of an eglin C mutant by chemically synthesizing a DNA sequence for coding the eglin C mutant, carrying out recombinant expression and purification on the eglin C mutant protein by using escherichia coli, coupling the protein to sepharose4B column material, and separating and purifying the neutral or alkaline protease expressed by bacteria by using the specific combination of the eglin C mutant and the protease. The affinity purification system constructed by the eglin C mutant has the advantages of simple method, few operation steps, low enzyme activity loss and high purification multiple.)

一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法。

背景技术

蛋白酶是一种蛋白质水解酶，可以催化水解蛋白质中的肽键。蛋白酶根据不同标准，分为不同类型的蛋白酶，按其活性中心和最适pH值，可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶；按其反应的最适pH值，又可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶；当然也可根据其来源进行分类，比如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等。蛋白酶是一种非常重要的工业酶，广泛应用于洗涤行业，食品、医药、制革等行业。具体讲，在洗涤行业中主要用于加酶洗衣粉等的生产；在食品行业中主要用于制备大豆水解多肽、水解酵母以及处理肉制品的下脚料，提高蛋白利用率；在制革行业中可以用来处理原料的脱毛和软化；在医药行业中可以用来提取肝素和硫酸软骨素等。中性蛋白酶和碱性蛋白酶是工业化应用最早和最多的两类蛋白酶，中性蛋白酶和碱性蛋白酶，大多是通过微生物生产，最为常见的是通过芽孢杆菌等生产。

天然的eglinC是来源于水蛭，属于胰凝乳蛋白酶的抑制剂，可以抑制凝乳蛋白酶、组织蛋白酶、弹性蛋白酶等活性。eglinC只有一条含70个氨基酸的多肽链，和土豆I型的胰蛋白酶抑制剂有着较高的同源性，但它不含二硫键，有着非常好的耐酸和耐热特性。

目前，中性蛋白酶或碱性蛋白酶的分离纯化，一般要经过硫酸铵沉淀、离子交换层析或疏水层析，最后再经凝胶过滤才能获得电泳纯的蛋白酶制剂。此方法纯化步骤多、花费时间长、费用高，同时纯化效率也有待改善，因而成为制约高端蛋白酶制剂产品的一个重要因素。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，利用eglinC突变体和蛋白酶的特异结合来分离纯化细菌表达的中性或碱性蛋白酶，具有方法简单，操作步骤少，酶活损失低，纯化倍数高等优点。

为了实现上述目的，进而采取的技术方案如下：

在第一方面，提供了一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)化学合成eglinC蛋白：化学合成编码eglinC突变体的氨基酸序列，如SEQ IDNo：1所示，其中，所述eglinC突变体为一截短的eglinC蛋白，具体为缺失eglinC蛋白N端1-7号位Thr-Glu-Phe-Gly-Ser-Glu-Leu氨基酸的残基序列；

2)基因优化：根据SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，经优化后化学合成编码eglinC突变体的DNA序列，如SEQ ID No：2所示；

3)重组载体构建：构建eglinC突变体与大肠杆菌的重组表达载体；

4)重组表达：将构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，利用IPTG诱导表达，得到eglinC的重组蛋白；

5)分离纯化：制备纯化的eglinC的重组蛋白；

6)突变体亲和柱的制备及在纯化中性或碱性蛋白酶中的应用：将纯化后的eglinC的重组蛋白连在sepharose4B柱材料上，得到eglinC突变体亲和柱，利用eglinC突变体亲和柱纯化中性蛋白酶或碱性蛋白酶。

在第二方面，根据第一方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述步骤2)中的氨基酸序列经密码子优化后，化学合成适合在大肠杆菌中表达的DNA序列。

在第三方面，根据第一方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述步骤3)中的重组表达载体为：将合成的eglinC突变体的DNA序列经NdeI和BamHI酶切，连接到经相同酶切后的pET3a载体上，构建pET3a-eglinC重组表达载体。

在第四方面，根据第一方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述步骤3)中的重组表达载体为：将合成的eglinC突变体的DNA序列连接到带有或含有6个组氨酸标签His₆-Tag的载体上，构建带有6个组氨酸标签的eglinC突变体的重组表达载体。

在第五方面，根据第四方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述带有或含有6个组氨酸标签的载体为pQE30载体，将合成的eglinC突变体的DNA序列经HindIII和BamHI酶切，连接到经相同酶切后的pQE30载体上，构建pQE30-eglinC重组表达载体。

在第六方面，根据第一方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述步骤4)中将构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，用CaCl₂热休克转染法转入大肠杆菌Ecoil.BL21中，涂含100μg/ml Amp的LB平板，挑单菌落于含100μg/ml Amp的LB培养基，过夜培养种子液，然后以1％-5％的接种量接种LB，当菌体生长OD600nm达到0.8-1.0时，加IPTG诱导，诱导剂浓度0.8-1mM，诱导温度37℃，诱导时间5-7小时后得到eglinC的重组蛋白。

在第七方面，根据第三方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，采用pET3a-eglinC重组表达载体制备得到的eglinC的重组蛋白为eglinC突变体蛋白，其氨基酸序列与eglinC突变体的氨基酸序列相同。

在第八方面，根据第四方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，采用6个组氨酸标签的eglinC突变体的重组表达载体制备得到的eglinC的重组蛋白为His₆-Tag-eglinC突变体蛋白。

在第九方面，根据第三方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述sepharose4B柱材料为CNBr-Sepharose4B柱材料。

在第十方面，根据第四方面所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述sepharose4B柱材料为Ni²⁺-sepharose4B柱材料。

有益效果：本发明具有方法简单，操作步骤少，酶活损失低，纯化倍数高等优点，通过重组表达和纯化截短eglinC蛋白，将其偶联在惰性介质Sepharose4B作为蛋白酶的亲和配体，利用eglinC突变体和蛋白酶的特异结合去富集蛋白酶，然后再提高盐离子浓度至1M洗脱蛋白酶，能够一步获得85％电泳纯的蛋白酶。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为实施例1eglinC突变体蛋白的分离纯化图

其中，泳道1：pET3a-Eglinc/BL21全菌；泳道2：pET3a-Eglinc超声破碎上清；泳道3：DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱结合样；泳道4：DEAE-Sepharose Fast Flow层柱穿透样；泳道5：Superdex-75洗脱样；

图2为实施例2中性蛋白酶和碱性蛋白酶纯化的SDS-PAGE电泳评价结果图

其中，泳道1：碱性蛋白酶粗品；泳道2：穿透样；泳道3：50mMTris、100mMNaCl(pH＝7.5)洗脱样；泳道4：20mM硼酸Buffer、1M NaCl(pH＝6.9)洗脱样；泳道5：中性蛋白酶粗品；泳道6：穿透样泳道7：50mMTris、100mMNaCl(pH＝7.5)洗脱样；泳道8：20mM硼酸Buffer、1MNaCl(pH＝6.9)洗脱样。

具体实施方式

应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”也包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本说明书第一方案提供了一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)化学合成eglinC蛋白：化学合成编码eglinC突变体的氨基酸序列，如SEQ IDNo：1所示(具体序列为：Lys Ser Phe Pro Glu Val Val Gly Lys Thr Val Asp Gln AlaArg Glu Tyr Phe Thr Leu His Tyr Pro Gln Tyr Asp Val Tyr Phe Leu Pro Glu GlySer Pro Val Thr Leu Asp Leu Arg Tyr Asn Arg Val Arg Val Phe Tyr Asn Pro GlyThr Asn Val Val Asn His Val Pro His Val Gly)，其中，所述eglinC突变体为一截短的eglinC蛋白，具体为缺失eglinC蛋白N端1-7号位Thr-Glu-Phe-Gly-Ser-Glu-Leu氨基酸的残基序列；

2)基因优化：根据SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，经优化后化学合成编码eglinC突变体的DNA序列，如SEQ ID No：2所示(具体序列为：aaatctttcc cagaagttgt tggtaaaactgttgaccagg ctcgtgaata cttcactctg cattacccgc agtacgacgt ttacttcctg ccggaaggttctcctgttac tctggacctg cgttacaacc gtgttcgt gttttctaca acccaggtac taacgttgttaaccatgttc cgcatgttggg)；

3)重组载体构建：构建eglinC突变体与大肠杆菌的重组表达载体；

4)重组表达：将构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，利用IPTG诱导表达，得到eglinC的重组蛋白；

5)分离纯化：制备纯化的eglinC的重组蛋白；

6)突变体亲和柱的制备及在纯化中性或碱性蛋白酶中的应用：将纯化后的eglinC的重组蛋白连在sepharose4B柱材料上，得到eglinC突变体亲和柱，利用eglinC突变体亲和柱纯化中性蛋白酶或碱性蛋白酶。

本说明书第二方案，根据第一方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述步骤2)中的氨基酸序列经密码子优化后，化学合成适合在大肠杆菌中表达的DNA序列。

本说明书第三方案，根据第一方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述步骤3)中的重组表达载体为：将合成的eglinC突变体的DNA序列经NdeI和BamHI酶切，连接到经相同酶切后的pET3a载体上，构建pET3a-eglinC重组表达载体。

本说明书第四方案，根据第一方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述步骤3)中的重组表达载体为：将合成的eglinC突变体的DNA序列连接到带有或含有6个组氨酸标签His₆-Tag的载体上，构建带有6个组氨酸标签的eglinC突变体的重组表达载体。

本说明书第五方案，根据第五方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述带有或含有6个组氨酸标签的载体为pQE30载体，将合成的eglinC突变体的DNA序列经HindIII和BamHI酶切，连接到经相同酶切后的pQE30载体上，构建pQE30-eglinC重组表达载体。

本说明书第六方案，根据第一方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述步骤4)中将构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，用CaCl₂热休克转染法转入大肠杆菌Ecoil.BL21中，涂含100μg/ml Amp的LB平板，挑单菌落于含100μg/ml Amp的LB培养基，过夜培养种子液，然后以1％-5％的接种量接种LB，当菌体生长OD600nm达到0.8-1.0时，加IPTG诱导，诱导剂浓度0.8-1mM，诱导温度37℃，诱导时间5-7小时后得到eglinC的重组蛋白。

本说明书第七方案，根据第三方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，采用pET3a-eglinC重组表达载体制备得到的eglinC的重组蛋白为eglinC突变体蛋白，其氨基酸序列与eglinC突变体的氨基酸序列相同。

本说明书第八方案，根据第四方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，采用6个组氨酸标签的eglinC突变体的重组表达载体制备得到的eglinC的重组蛋白为His₆-Tag-eglinC突变体蛋白。

本说明书第九方案，根据第三方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述sepharose4B柱材料为CNBr-Sepharose4B柱材料。

本说明书第十方案，根据第四方案所述的一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，所述sepharose4B柱材料为Ni²⁺-sepharose4B柱材料。

下文以具体实施例对本发明上述的技术方案进行更具体地说明。

实施例1：一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)化学合成eglinC蛋白

根据GeneBank中水蛭XD0802.1(Hirudo medicinalis)的蛋白序列，同时将eglinC蛋白N端1-7号位的Thr Glu Phe Gly Ser Glu Leu缺失掉，得到eglinC突变体的氨基酸序列；

2)基因优化

根据eglinC突变体的氨基酸序列，在https：//www.jcat.de/start.jsp网站，优化为利于大肠杆菌表达的eglinC突变体的DNA序列，并在eglinC突变体的DNA序列的两端添加NdeI和BamHI酶切位点。

3)重组载体构建

将合成的eglinC突变体的DNA序列经Nde I和BamHI酶切，连接到经相同酶切后的pET3a载体上，测序正确后得到pET3a-eglin C重组表达载体。

4)重组表达

将构建成功的pET3a-eglin C重组表达载体，用CaCl₂热休克转染法转入大肠杆菌Ecoil.BL21中，涂含100μg/ml Amp的LB平板，挑单菌落于含100μg/ml Amp的LB培养基，过夜培养种子液，然后以1％-5％的接种量接种LB，当菌体生长OD_600nm达到0.8-1.0时，加IPTG诱导，诱导剂浓度0.8-1mM，诱导温度37℃，诱导时间5-7小时后得到eglinC突变体蛋白。

5)分离纯化

将步骤4)中培养所得的含eglinC突变体蛋白的大肠杆菌菌体，每升发酵菌体用20ml pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲液悬浮，按常规操作超声破碎，4℃高速13000rpm离心30min，收集上清液，上样经相同缓冲液平衡的DEAE-sepharoseFF离子柱，收集穿透蛋白样品，将蛋白浓缩后再上样于100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.0缓冲液平衡的Superdex75凝胶柱，收集eglinC突变体蛋白，获得80％电泳纯的eglinC突变体蛋白，如图1所示。

6)Sepharose4B-eglinC突变体亲和柱的制备及在纯化中性或碱性蛋白酶中的应用

先将CNBr-Sepharose-4B柱材料4℃去离子水溶胀24小时，脱气装柱，用1mM 4℃预冷的HCl洗涤5个柱床体积，将纯化后的eglinC突变体蛋白在pH8.0 100mM NaHCO₃，500mMNaCl缓冲液条件下，偶联在CNBr-Sepharose4B柱材料上，100mM Tris-HCl封闭CNBr-Sepharose4载体多余的偶联基团，然后交替用含500mMNaCl的100mM醋酸缓冲液pH4.和100mM的磷酸缓冲液洗涤Sepharose4B-eglinC突变体亲和柱，最后用pH8.0，50mMTris-HCl，500mMNaCl平衡柱子。

然后，将细菌产的碱性蛋白酶或中性蛋白酶液上样与Sepharose4B-eglinC突变体亲和柱，4℃静置，孵育30分钟后，放出未结合的蛋白溶液，用pH8.0，50mMTris-HCl，500mMNaCl缓冲液洗涤1-2柱床体积，然后用pH8.0，50mM Tris-HCl含1-1.5M NaCl缓冲液洗脱蛋白酶，蛋白酶的纯度分析如图2所示。

实施例2：一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)化学合成eglinC蛋白

根据GeneBank中水蛭XD0802.1(Hirudo medicinalis)的蛋白序列，同时将eglinC蛋白N端1-7号位的Thr Glu Phe Gly Ser Glu Leu缺失掉，得到eglinC突变体的氨基酸序列；

2)基因优化

在https：//www.jcat.de/start.jsp网站，优化为利于大肠杆菌表达的eglinC突变体的DNA序列，并在eglinC突变体的DNA序列的两端添加NdeI和BamHI酶切位点。

3)重组载体构建

将合成的eglinC突变体的DNA序列经HindIII和BamHI酶切，连接到经相同酶切后的pQE30载体上，构建pQE30-eglinC重组表达载体，构建pQE30-eglinC重组表达载体。

4)重组表达

将构建成功的pQE30-eglinC重组表达载体，用CaCl₂热休克转染法转入大肠杆菌Ecoil.BL21中，涂含100μg/ml Amp的LB平板，挑单菌落于含100μg/ml Amp的LB培养基，过夜培养种子液，然后以1％-5％的接种量接种LB，当菌体生长OD_600nm达到0.8-1.0时，加IPTG诱导，诱导剂浓度0.8-1mM，诱导温度37℃，诱导时间5-7小时后得到His₆-Tag-eglinC突变体蛋白。

5)分离纯化

将步骤4)中培养所得的含His₆-Tag-eglinC突变体蛋白的大肠杆菌菌体，每升发酵菌体用20ml pH8.0 50mM Tris-HCl 500mM NaCl 5mM咪唑缓冲液悬浮，按常规操作超声破碎，4℃高速13000rpm离心30min，收集上清液，上样经相同缓冲液平衡的Ni²⁺-sepharose4B柱亲和柱，收集最后洗脱蛋白，将洗脱蛋白浓缩后再上样于经相同缓冲液平衡的Superdex75凝胶柱，收集His₆-Tag-eglinC突变体蛋白，获得电泳纯的His₆-Tag-eglinC突变体蛋白。

6)Sepharose4B-eglinC突变体亲和柱的制备及在及在纯化中性或碱性蛋白酶中的应用

首先，取纯化后的His₆-Tag-eglinC突变体蛋白，在pH8.0 50mMTris-HCl,500mMNaCl缓冲液条件下结合在Ni²⁺-sepharose4B柱材料上，构建成Ni²⁺-sepharose4B-His₆-Tag-eglinC突变体亲和柱。

然后，取中性蛋白酶的粗样或碱性蛋白酶的粗样，上样于构建的Ni²⁺-sepharose4B-His₆-Tag-eglinC突变体亲和柱，4℃静置，孵育30分钟后，放出未结合的蛋白溶液，用pH8.0 50mMTris-HCl,500mMNaCl缓冲液洗涤1-2柱床体积，然后用pH8.0 50mMTris-HCl含1-1.5M NaCl缓冲液洗脱蛋白酶。

实施例1与实施例2的对比结果如表1所示，在实施例1中，eglinC突变体蛋白与CNBr-Sepharose4B柱材料之间通过共价键连接，相较于实施例2中His₆-Tag-eglinC突变体蛋白与Ni²⁺-sepharose4B柱材料之间的连接更稳定。因此，实施例1中制得的Sepharose4B-eglinC突变体亲和柱相较于实施例2中制得的Ni²⁺-sepharose4B-His₆-Tag-eglinC突变体亲和柱更稳定，对于蛋白酶的纯化效果也更优。

表1对比结果

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。