阅读说明：本技术 一种构建结构开关型核酸适配体的通用方法及应用其的通用型传感器和其构建方法 (general method for constructing structure switch type aptamer, general sensor using same and construction method thereof ) 是由 娄新徽 黄旸 于 2018-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种构建结构开关型核酸适配体的通用方法,以及应用其检测多种类型靶标的通用型传感器。通过将核酸适配体的两端分别连接富含鸟嘌呤核苷酸(G)的序列来构建具有结构开关性能的探针(Apt-G4)。当没有能够与核酸适配体特异性结合的靶标存在时,Apt-G4形成G-四聚体结构(G4)；当有靶标存在时,靶标与核酸适配体结合,G4被破坏。Apt-G4设计对不同类型靶标的核酸适配体具有普适性。利用G4可以显著增强氯化血红素催化H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>与无色的2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)反应生成绿色ABTS<Sup>+·</Sup>的性质,分别实现对汞离子、凝血酶和磺胺地索辛的信号减型的比色检测。(The invention relates to general methods for constructing structure switch type aptamers and a general sensor for detecting multiple types of targets by applying the methods, wherein the two ends of the aptamers are respectively connected with sequences rich in guanine nucleotide (G) to construct a probe (Apt-G4) with structure switch performance, when no target capable of being specifically combined with the aptamers exists, Apt-G4 forms a G-tetramer structure (G4), when the target exists, the target is combined with the aptamers, G4 is damaged, Apt-G4 is designed to have universality for the aptamers of different types of targets, and G4 can remarkably enhance chlorhematin catalysis H catalysis 2 O 2 Reacting with colorless 2' -hydrazine-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic Acid (ABTS) to generate green ABTS +· The colorimetric detection of signal reduction of mercury ions, thrombin and sulfadimethoxine is realized respectively.)

一种构建结构开关型核酸适配体的通用方法及应用其的通用 型传感器和其构建方法

技术领域

本发明涉及一种构建结构开关型核酸适配体的通用方法，以及应用其检测多种类型靶标(金属离子、蛋白质、有机小分子)的通用型传感器和其构建方法。属于生物技术领域。

背景技术

核酸适配体是通过体外筛选技术，即指数富集配体系统进化技术 (SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)(Nature,1990,346(6287),818-822；Science,1990, 249(4968),505-510)，从体外合成的寡核苷酸文库中，通过多轮的亲和富集和聚合酶链式反应等步骤获得的，对筛选靶标具有高的特异性和亲和力的生物识别分子。核酸适配体可以识别多种类型的靶标，包括金属离子、蛋白质、有机小分子等等。核酸适配体在多个领域得到了广泛的应用，特别是生物传感器领域。

结构开关型核酸适配体(SSA)是一类与靶标结合时能够发生显著构象变化的核酸适配体。由于其靶标诱导的构象变化可以方便地转化成为可以检测的电化学、光学等信号，在生物传感领域引起了极大的兴趣。近些年来基于SSA的传感器层出不穷，具有结构简单、操作简单、灵敏度高和特异性好的显著优点。但是目前筛选SSA的方法非常少，效率低(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107, 14053-14058.)，需要15-20个筛选循环，而且获得的核酸适配体选择性差、亲和力低。目前报道的SSA数量非常有限，绝大多数核酸适配体不具有或者仅具有微小的构象变化，因而靶标与核酸适配体结合时不能够诱导产生显著的检测信号的变化。而且不同靶标的SSA往往具有不同的结构开关方式，比如SSA与靶标结合可以形成双链、Y型、 G-四聚体等等不同的结构，缺乏统一性，也限制了通用性SSA传感器的设计。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种构建结构开关型核酸适配体的通用方法，以及应用其检测多种类型靶标(金属离子、蛋白质、有机小分子)的通用型传感器。

本发明提供的一种构建结构开关型核酸适配体的通用方法，其中包括如下步骤：设计具有结构开关性能的核酸适配体：将核酸适配体的两端分别连接富含鸟嘌呤核苷酸G的序列来构建具有结构开关性能的探针Apt-G4。

进一步，上述构建结构开关型核酸适配体的通用方法中，所述具有结构开关性能的探针Apt-G4为A-SULF-A；A-TBA29-A；和A-T11-A。

另外，本发明还提供一种通用型传感器的构建方法，包括：步骤 (1)设计具有结构开关性能的核酸适配体：将核酸适配体的两端分别连接富含鸟嘌呤核苷酸G的序列来构建具有结构开关性能的探针 Apt-G4；步骤(2)95℃加热Apt-G4，缓冷至室温；步骤(3)加入不同浓度的待测物质与Apt-G4孵育形成混合液；步骤(4)加入氯化血红素(hemin)与上述混合液孵育；步骤(5)同时加入过氧化氢与2'- 联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，测定选定时间的418nm处的紫外吸收，以紫外吸收值为纵坐标，待测物质的浓度为横坐标绘制工作曲线。

另外，上述通用型传感器的构建方法中，步骤(2)中，95℃恒温加热6分钟，然后缓冷至25℃。

此外，上述通用型传感器的构建方法中，还包括步骤(6)选择性试验：将待测物质分别替换为等浓度的其它物质，重复步骤(1)- (5)实验。

进一步，上述通用型传感器的构建方法中，所述具有结构开关性能的探针Apt-G4配置成浓度为0.375μM的溶液。

本发明还提供一种构建结构开关型核酸适配体的通用型传感器，该传感器包括具有结构开关性能的核酸适配体，该核酸适配体的两端分别连接富含鸟嘌呤核苷酸G的序列来构建具有结构开关性能的探针 Apt-G4。所述具有结构开关性能的探针Apt-G4为A-SULF-A；A-TBA29-A；和A-T11-A。所述具有结构开关性能的探针Apt-G4配置成浓度为 0.375μM的溶液。

本发明的具体实验步骤：

(1)设计具有结构开关性能的核酸适配体：将核酸适配体的两端分别连接富含鸟嘌呤核苷酸(G)的序列来构建具有结构开关性能的探针(Apt-G4)；

(2)95℃加热Apt-G4，缓冷至室温；

(3)加入不同浓度的待测物质与Apt-G4孵育；

(4)加入氯化血红素(hemin)与上述混合液孵育；

(5)同时加入过氧化氢(H₂O₂)与2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，测定选定时间的418nm处的紫外吸收，以紫外吸收值为纵坐标，待测物质的浓度为横坐标绘制工作曲线；

(6)选择性试验：将待测物质分别替换为等浓度的其它物质，重复1-5步实验。

本发明方法及其传感器具有如下优势：

1)使用本发明的SSA设计方法可以将任意核酸适配体设计为具有显著结构开关性能的核酸适配体，也就是SSA；

2)本发明的SSA设计方法具有很好的普适性，不但可以将非SSA 转变为SSA，而且也可以将具有不同结构开关性能的SSA转化为具有统一构象变化的SSA，即具有G-四聚体结构开关性能的SSA；

3)本发明所设计的SSA能用于构建具有通用性的传感器，可以用于对多种不同类型的目标物的检测。

附图说明

图1是利用本发明方法构建的SSA进行靶标比色检测的原理图。

图2是按照本发明的方法检测磺胺地索辛的紫外可见吸收光谱图 (A)和工作曲线(B)。

图3是按照本发明的方法构建的磺胺地索辛比色传感器的选择性测试结果图。

图4是按照本发明的方法检测凝血酶的紫外可见吸收光谱图(A) 和工作曲线(B)。

图5是按照本发明的方法构建的凝血酶比色传感器的选择性测试结果图。

图6是按照本发明的方法检测汞离子的紫外可见吸收光谱图(A) 和工作曲线(B)。

图7是按照本发明的方法构建的汞离子比色传感器的选择性测试结果图。

图8是按照本发明的方法构建的三个SSA(A:A-SULF-A； B:A-TBA29-A；和C:A-T11-A)加入血红素和靶标(A:磺胺地索辛；B: 凝血酶；C:汞离子)前后的圆二色谱图。

具体实施方式

表1：本发明中所用的DNA的序列信息。

探针名称	序列(5’——3’)
		A-SULF-A	<u>AGGGACGGGA</u>CTAGAGAGGGCAACGAGTGTTTATAGA<u>AGGGACGGGA</u>
A-TBA29-A	<u>AGGGACGGGA</u>AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT<u>AGGGACGGGA</u>
		A-T11-A	<u>AGGGACGGGA</u>TTTTTTTTTTT<u>AGGGACGGGA</u>

图1是利用本发明方法构建的SSA进行靶标比色检测的原理图。任意核酸适配体的两端分别连接富含鸟嘌呤核苷酸(G)的序列来构建具有结构开关性能的探针(Apt-G4)；当没有靶标存在时，Apt-G4形成G-四聚体结构，该结构可以增强血红素催化ABTS氧化形成有色产物 ABTS^+·的形成；当有靶标存在时，Apt-G4中的核酸适配体片段与靶标结合，G-四聚体结构被破坏，因而不能够增强血红素催化ABTS氧化形成有色产物ABTS^+·的形成。

图2是按照本发明的方法检测磺胺地索辛的紫外可见吸收光谱图 (A)和工作曲线(B)。在图2中，左侧A图为紫外可见吸收光谱图，右侧B图的纵坐标是测试样品在第八分钟时在418纳米(nm)处的吸光度值。所使用的SSA为A-SULF-A(表1)。

图3是按照本发明的方法构建的磺胺地索辛比色传感器的选择性测试结果图。磺胺地索辛、氨苄西林、卡那霉素A、卡那霉素B、四环素的终浓度均为1毫摩尔每升(mM)。纵坐标的数值根据各样品和空白样品在第八分钟时在418nm处的吸光度值进行计算获得。以空白实验的吸光度与含磺胺地索辛的样品的吸光度的差值为百分之百。

图4是按照本发明的方法检测凝血酶的紫外可见吸收光谱图(A) 和工作曲线(B)。在图4中，左侧A图为紫外可见吸收光谱图，右侧B 图的纵坐标是测试样品在第八分钟时在418nm处的吸光度值。所使用的SSA为A-TBA29-A(表1)。

图5是按照本发明的方法构建的凝血酶比色传感器的选择性测试结果图。凝血酶、牛血清白蛋白的终浓度均为20微摩尔每升(μM)。纵坐标的数值根据各样品和空白样品在第八分钟时在418nm处的吸光度值进行计算获得。以空白实验的吸光度与含凝血酶的样品的吸光度的差值为百分之百。

图6是按照本发明的方法检测汞离子的紫外可见吸收光谱图(A) 和工作曲线(B)。在图6中，左侧A图为紫外可见吸收光谱图，右侧B 图的纵坐标是测试样品在第八分钟时在418nm处的吸光度值。所使用的SSA为A-T11-A(表1)。

图7是按照本发明的方法构建的汞离子比色传感器的选择性测试结果图。Hg²⁺、Pb^{2 +}、Fe²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺的浓度均为2μM。纵坐标的数值根据各样品和空白样品在第八分钟时在 418nm处的吸光度值进行计算获得。以空白实验的吸光度与含Hg²⁺的样品的吸光度的差值为百分之百。

图8是按照本发明的方法构建的三个SSA(A:A-T11-A；B: A-SULF-A；和C:A-TBA29-A)加入血红素和靶标(A:汞离子；B:磺胺地索辛；C:凝血酶)前后的圆二色谱图。在图8中，从左向右依次为， A-T11-A+血红素+汞离子；A-SULF-A+血红素+磺胺地索辛；A-TBA29-A+ 血红素+凝血酶。

本发明的具体实验步骤如下：

(1)设计具有结构开关性能的核酸适配体：将核酸适配体的两端分别连接富含鸟嘌呤核苷酸(G)的序列来构建具有结构开关性能的探针(Apt-G4)；

(2)95℃加热Apt-G4，缓冷至室温；

(3)加入不同浓度的待测物质与Apt-G4孵育；

(4)加入氯化血红素(hemin)与上述混合液孵育；

(5)同时加入过氧化氢(H₂O₂)与2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸(ABTS)，测定选定时间的418nm处的紫外吸收，以紫外吸收值为纵坐标，待测物质的浓度为横坐标绘制工作曲线；

(6)选择性试验：将待测物质分别替换为等浓度的其它物质，重复1-5步实验。

实施例1.按照本发明的方法检测磺胺地索辛的工作曲线和传感器的选择性测试。

将A-SULF-A配置成浓度为0.375微摩尔每升(μM)的溶液(20 mM Tris-HCl，50mMNaCl，5mM KCl，5mM MgCl₂，pH 8.0)，95℃恒温加热6分钟，然后缓冷至室温(约25℃左右)。取50微升(μL) 的A-SULF-A溶液，加入60μL不同浓度的磺胺地索辛溶液(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl₂，pH 8.0)(0μM、 0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM)，孵育30分钟。随后加入血红素(10μL，3μM)，室温避光孵育30分钟。最后同时加入ABTS(20 μL，3.75mM)和H₂O₂(10μL，15mM)。反应进行第八分钟时，用紫外分光光度计测定418nm处的吸光度值。绘制工作曲线。

取50μL上述热处理后的A-SULF-A溶液，分别加入磺胺地索辛、卡那霉素A、卡那霉素B、氨苄西林、四环素(60μL，2.5mM)，孵育30分钟。随后加入血红素(10μL，3μM)，37℃避光孵育30 分钟。最后同时加入ABTS(20μL，3.75mM)和H₂O₂(10μL，15 mM)。反应进行第八分钟时，用紫外分光光度计测定418nm处的吸光度值。以空白实验的吸光度与含磺胺地索辛的样品的吸光度的差值为百分之百，计算各靶标的相对信号变化。

所获得的工作曲线如图2所示，检出限为0.2μM，检测范围为 0.2μM到1000μM。磺胺地索辛传感器具有很好的选择性(图3)，对卡那霉素A、卡那霉素B、氨苄西林、四环素的选择性分别是25.8、 8.1、10.8和26.3倍。

实施例2.按照本发明的方法检测凝血酶的工作曲线和传感器的选择性测试。

将A-TBA29-A配置成浓度为0.375μM的溶液[25mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，20mM KNO₃，200mM NaNO₃，0.025％(w/v％)Triton X-100，1％(v/v％(质量体积百分比))二甲亚砜(DMSO)，150mM NH₄Cl， pH 5.3]，95℃恒温加热6分钟，然后缓冷至室温。取50微升(μL) 的A-TBA29-A溶液，加入60μL不同浓度的凝血酶溶液(25mM HEPES， 20mM KNO3，200mMNaNO3，0.025％(w/v％)Triton X-100，1％(v/v％) DMSO，150mM NH⁴⁺，pH 5.3)(0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、10μM、50μM)，孵育30分钟。随后加入血红素(10μL， 3μM)，室温避光孵育30分钟。最后同时加入ABTS(20μL，3.75 mM)和H₂O₂(10μL，15mM)。反应进行第八分钟时，用紫外分光光度计测定418nm处的吸光度值。绘制工作曲线。

取50μL上述热处理后的A-TBA29-A溶液，分别加入凝血酶、牛血清白蛋白(60μL，50μM)，孵育30分钟。随后加入血红素(10μL， 3μM)，37℃避光孵育30分钟。最后同时加入ABTS(20μL，3.75 mM)和H₂O₂(10μL，15mM)。反应进行第八分钟时，用紫外分光光度计测定418nm处的吸光度值。以空白实验的吸光度与含凝血酶的样品的吸光度的差值为百分之百，计算各靶标的相对信号变化。

所获得的工作曲线如图4所示，检出限为0.1μM，检测范围为0.1μM到50μM。凝血酶传感器具有很好的选择性(图5)，对牛血清白蛋白的选择性是19.2倍。

实施例3.按照本发明的方法检测汞离子的工作曲线和传感器的选择性测试。

将A-T11-A配置成浓度为0.375μM的溶液(25mM HEPES，20mM KNO3，200mM NaNO3，0.025％(w/v％)Triton X-100，1％(v/v％)DMSO， 150mM NH₄Cl，pH 5.3)，95℃恒温加热6分钟，然后缓冷至室温。取50μL的A-T11-A溶液，加入60μL不同浓度的硝酸汞溶液(25 mMHEPES，20mM KNO3，200mM NaNO3，0.025％(w/v％)Triton X-100， 1％(v/v％)DMSO，150mMNH⁴⁺，pH 5.3)(0nM、50nM、250nM、

500nM、1000nM、2000nM、5000nM、10000nM)，孵育30分钟。随后加入血红素(10μL，3μM)，室温避光孵育30分钟。最后同时加入ABTS(20μL，3.75mM)和H₂O₂(10μL，15mM)。反应进行第八分钟时，用紫外分光光度计测定418nm处的吸光度值。绘制工作曲线。

取50μL上述热处理后的A-T11-A溶液，分别加入Hg²⁺、Pb²⁺、 Fe²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺(60μL，5μM)，孵育 30分钟。随后加入血红素(10μL，3μM)，37℃避光孵育30分钟。最后同时加入ABTS(20μL，3.75mM)和H₂O₂(10μL，15mM)。反应进行第八分钟时，用紫外分光光度计测定418nm处的吸光度值。以空白实验的吸光度与含凝血酶的样品的吸光度的差值为百分之百，计算各靶标的相对信号变化。

所获得的工作曲线如图6所示，检出限为50nM，检测范围为50 nM到5μM。汞离子传感器具有很好的选择性(图7)，对金属离子的选择性是18.5-37.0倍。

实施例4.按照本发明的方法构建的SSA与靶标结合时的构象变化。

为了进一步证实本发明构建的SSA((A-SULF-A，AT11A，A-TBA29-A, 表1)具有结构开关性能，利用二元色谱(CD)对靶标加入前后的SSA 的构象进行了测定。实验发现TritonX-100会影响CD谱的测试,因此在研究凝血酶和汞离子的SSA时，所使用的结合缓冲液中去掉了该成分(25mM HEPES，20mM KNO₃，200mM NaNO₃，1％(v/v％)DMSO， 150mM NH₄Cl，pH＝5.3)。实验流程如下：95℃热处理2μM SSA，时间为6分钟,缓冷至室温；在SSA(100μL，2μM)中加入血红素(1μL 0.4mM)孵育90分钟；加入100μL与SSA对应的靶标分子(100μM磺胺地索辛，100μM Hg²⁺，50μM凝血酶)孵育60分钟；将空白SSA、和血红素孵育后的SSA，加入靶标分子的SSA分别进行CD谱测试。

由图8可知，三种SSA均具有平行G四聚体结构，在240nm处为负峰，在260nm处出现正峰。SSA与血红素结合后该平行G四聚体结构会增强，而当加入靶标分子后，G四聚体结构被破坏，CD特征峰消失，这些实验数据证明本发明方法所设计的SSA具有显著而且相同的靶标结合诱导的结构开关性能。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。