抗微生物化合物和纳米结构体
阅读说明：本技术 抗微生物化合物和纳米结构体 (Antimicrobial compounds and nanostructures ) 是由 M·蒙蒂罗 J·W·阿姆斯特朗 于 2018-06-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了具有一个或多个季铵盐的化合物和纳米结构体、包含所述化合物和纳米结构体的组合物以及利用所述化合物、纳米结构体和组合物治疗病症的方法。在至少一方面,化合物由式(I)表示,或是其药学上可接受的盐,其中,Q是氟、氯、溴或碘；s、b和n各自独立地是约10到约100的整数；且v、j、p、z、q、x和m各自独立地是1到约20的整数。(In at least aspect , the compounds are represented by formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein Q is fluorine, chlorine, bromine, or iodine, s, b, and n are each independently integers from about 10 to about 100, and v, j, p, z, Q, x, and m are each independently integers from 1 to about 20.)
相关申请的交叉引用
本申请是PCT申请，要求2017年12月12日提交的共同待决的美国第15/838,751号非临时专利申请的优先权，而第15/838,751号申请要求2017年6月16日提交的共同待决的美国临时专利申请序列62/521,040号的权益。上述相关专利申请的全部内容通过引用合并于本文。
技术领域
本发明提供了具有一个或多个季铵盐的化合物和纳米结构体、包含所述化合物和纳米结构体的组合物、和使用所述化合物、纳米结构体和组合物治疗病症的方法。
背景技术
防止飞机上的疾病传播通常集中在对空调/过滤系统的改进。最近的研究表明，一种进一步改善飞机和航天器上的疾病预防的方法可以包括表面污染处理，例如对飞机表面的表面污染处理。然而，虽然已经生产出一些抗微生物化合物用于抗菌应用，但尚无已证明专门用于抗病毒应用的化合物。对于抗病毒化合物，生物技术和制药行业使用蛋白质和小分子(例如分子量小于1,000)靶向微生物。然而，蛋白质和小分子具有有限的全身半衰期，因此通常涉及比预期更高的剂量。
此外，现有抗微生物材料的疏水结合在起效之前需要较长的脱水时间，以致在脱水过程中发生大量微生物传播，从而抗微生物活性对强微生物(例如大肠杆菌(E.coli))无效。
因此，需要能够进一步功能化和具有对强微生物(例如大肠杆菌)的抗微生物活性的抗微生物化合物和纳米结构体、包含所述化合物和纳米结构体的组合物、及使用所述化合物、纳米结构体和组合物的用于抗微生物和/或抗病毒应用的方法。
发明内容
本发明提供了具有一个或多个季铵盐的化合物和纳米结构体、包含所述化合物和纳米结构体的组合物、和使用所述化合物、纳米结构体和组合物的用于治疗病症(如病毒和毒素相关病症)的方法。
至少一种化合物由式(I)表示或是其药学上可接受的盐：
其中：
Q是氟、氯、溴或碘；
s、b和n各自独立地是约10到约100的整数；且
v、j、p、z、q、x和m各自独立地是1到约20的整数。
本发明的至少一种组合物包含由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种额外组分。所述组合物具有三维构象，即，纳米虫(nanoworm)或纳米棒。
至少一种方法包括将本发明的化合物或组合物沉积在物体上，例如飞机的内表面。至少一种方法包括治疗病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐(或包含由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐的组合物)，其中，待治疗的病症包括病毒感染、细菌感染、慢性炎性疾病、急性炎性疾病或癌症。
至少一种方法包括制备式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。至少一种方法包括制备包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的组合物。
附图说明
为了可以更详细地理解本发明的上述特征，可以参考各个方面对上文中简要概述的本发明进行更具体的描述，其中一些方面在附图中示出。然而，应当注意，附图仅示出了本发明的典型方面，并且因此不应认为是对其范围的限制，因为本发明可以涵盖其他等效的方面。
图1是一个方面的聚合物在氘化氯仿中的1H核磁谱。
图2A是一个方面的马来酰亚胺官能季铵化聚DMAEA在氘化水中的1H NMR谱。
图2B是一个方面的马来酰亚胺官能季铵化聚DMAEA在氘化水中的1H NMR谱。
图2C是一个方面的马来酰亚胺官能季铵化聚DMAEA在氘化水中的1H NMR谱。
图3是示出了一个方面的马来酰亚胺官能阳离子聚合物与多巴-和PDS-官能纳米虫缀合的示意图。
图4是说明了在一个方面中本发明的几种聚合物对大肠杆菌培养物的抑制作用的柱状图。
图5A是显示了一个方面的空白和大肠杆菌对照的扫描电子显微镜图像。
图5B是扫描电子显微镜图像，其显示了在一个方面中本发明的几种阳离子聚合物纳米虫对大肠杆菌的抗菌活性。
图5C是扫描电子显微镜图像，其显示了在一个方面中本发明的几种阳离子聚合物纳米虫对大肠杆菌的抗菌活性。
图5D是扫描电子显微镜图像，其显示了在一个方面中本发明的几种阳离子聚合物纳米虫对大肠杆菌的抗菌活性。
为了便于理解，在可能的情况下，使用相同的附图标记表示各图所共有的相同元件。这些图未按比例绘制并且为了清楚起见可能简化。还设想的是，一个方面的元素和特征可以有利地并入其他方面，而无需进一步叙述。
具体实施方式
本发明提供了具有一个或多个季铵盐的化合物和纳米结构体、包含所述化合物和纳米结构体的组合物、和使用所述化合物、纳米结构体和组合物治疗病症的方法。
化合物
在至少一个方面，化合物由式(I)表示或是其药学上可接受的盐：
其中，Q是氟、氯、溴或碘，优选氯；
s、b和n各自独立地是约10到约100的整数；且
v、j、p、z、q、x和m各自独立地是1到约20的整数。
在至少一方面，s是约20至约40、例如约25至约35的整数。b可为约30至约60、例如约40至约50的整数。n可为约30至约60、例如约50至约60的整数。m可为约1至约10、例如约5至约10的整数。x可为约5至约15的整数，例如7、11或15。
不受理论的束缚，约5至约15的x值提供烷基部分进入细胞膜(例如病毒细胞)的疏水部分的细胞膜穿透，而式(I)化合物的阳离子氮部分提供了式(I)化合物(例如季铵部分)与细胞膜表面(例如磷脂双层的磷酸酯部分)的库仑相互作用。此外，季铵盐提供了足够的亲水性，从而附着在季铵盐上的烷基部分不会变成基本上掩埋在三维结构的核心内(例如，当组合物具有纳米虫或纳米棒的三维结构时)。
式(I)化合物的聚苯乙烯嵌段可为式(I)化合物提供高玻璃化转变温度(Tg)组分(100％聚苯乙烯的Tg约为100℃)。高Tg在人体温度下为纳米颗粒提供稳定性。此外，聚(N-异丙基丙烯酰胺)(聚NIPAM)嵌段可以在水性条件、例如含有十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液下提供式(I)的化合物的纳米虫(或纳米棒)三维构象。
可以选择整数n与整数m之比来微调式(I)化合物的库仑结合能力v.s.病毒细胞膜穿透能力。对于式(I)的化合物，更大的整数n值提供更高的库仑结合，而更大的整数m提供更大的细胞膜穿透能力。在至少一个方面，整数n与整数m之比为约1:1至约100:1，例如约5:1至约15:1，例如54:7。
v、j、p、z和q的值可根据例如用于形成式(I)的化合物的起始材料中亚甲基单元的数量而变化。s值可通过控制苯乙烯单体与NIPAM单体的摩尔比和马来酰亚胺起始材料来控制，下文有更详细描述。相似的是，b值可通过控制NIPAM单体与苯乙烯单体的摩尔比和马来酰亚胺起始材料来控制。n和m的值可通过例如甲基卤与用于形成季铵盐部分的其他烷基卤(例如辛基卤)的比例来控制。
在至少一方面，由式(I)表示的化合物由式(II)表示或是其药学上可接受的盐：
其中，Q是氟、氯、溴或碘，优选氯；
s、b和n各自独立地是约10到约100的整数；且
x和m各自独立地是1至约20的整数。
在至少一方面，式(II)的s是约20至约40、例如约25至约35的整数。式(II)的b可以是约30至约60、例如约40至约50的整数。式(II)的n可以是约30至约60、例如约50至约60的整数。式(II)的m可以是约1至约10、例如约5至约10的整数。式(II)的x可以是约5至约15的整数。
在至少一个方面，由式(I)或式(II)表示的化合物由式(III)表示或是其药学上可接受的盐：
其中，x是约5到约15的整数，例如7、11或15。
组合物：
由式(I)、式(II)或式(III)表示的化合物或其药学上可接受的盐可存在于包含一种或多种额外组分的组合物中。额外组分可包括一种或多种药物活性化合物。
在至少一个方面，组合物包含由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，Q是氟、氯、溴或碘，优选氯；
s、b和n各自独立地是约10到约100的整数；且
v、j、p、z、q、x和m各自独立地是1到约20的整数。
在至少一个方面，s是约20至约40、例如约25至约35的整数。b可为约30至约60、例如约40至约50的整数。n可为约30至约60、例如约50至约60的整数。m可为约1至约10、例如约5至约10的整数。x可为约5至约15的整数，例如7、11或15。
在至少一个方面，整数n与整数m之比为约1:1至约100:1，例如约5:1至约15:1，例如54:7。
在至少一个方面，由式(I)表示的化合物由式(II)表示或是其药学上可接受的盐：
其中，Q是氟、氯、溴或碘，优选氯；
s、b和n各自独立地是约10到约100的整数；且
x和m各自独立为1至约20的整数。
在至少一个方面，式(II)的s是约20至约40、例如约25至约35的整数。式(II)的b可为约30至约60、例如约40至约50的整数。式(II)的n可为约30至约60、例如约50至约60的整数。式(II)的m可为约1至约10、例如约5至约10的整数。式(II)的x可为约5至约15的整数。
在至少一个方面，由式(I)或式(II)表示的化合物由式(III)表示或是其药学上可接受的盐：
其中，x是约5到约15的整数，例如7、11或15。
本发明的组合物可进一步包含额外组分，所述额外组分是式(IV)表示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，式(IV)的s和b各自独立地是约10到约100的整数；
式(IV)的v是1到约20的整数；
R1是–O–或–NH–；且
R2是–CH3、生物素、吡啶基二硫、多巴、硫内酯或金刚烷基。生物素的结构可为：
R2作为吡啶基二硫特别有利，因为它可以进一步与药物活性部分缀合。药物活性部分包括聚合物、糖、肽、寡核苷酸、蛋白质或小分子(例如2,000g/mol以下)治疗药物，例如抗癌药。蛋白质包括糖蛋白，例如维连菌素(Vitornectin)。小分子治疗药物包括Relenza结合剂。肽包括双精氨酸或易位(TAT)肽。寡核苷酸包括siRNA。
此外，吡啶基二硫可以进行硫醇-二硫键交换或巯基-双键(thiol-ene)反应，多巴可以与金属表面结合，γ-硫内酯可以进行胺化反应(例如与氨基酸)，生物素可以结合生物分子(例如链霉亲和素)，并且金刚烷基可进行溴化、氟化、羧化或羟基化。
在至少一个方面，式(IV)的s是约25到约35的整数。式(IV)的b可为约40至约50的整数。式(IV)的v可为1至约10的整数，例如2。
在至少一个方面，由式(IV)表示的化合物是由式(V)、式(VI)或式(VII)表示的化合物中的一种或多种，或其药学上可接受的盐：
其中，s是约25到约35的整数，并且b是约40到约50的整数。
在至少一个方面，由式(I)、(II)或(III)表示的化合物与由式(IV)、式(V)、式(VI)或式(VII)表示的化合物之比为约0.01:1至约1:0.01。
在至少一个方面，组合物包含由式(I)、(II)或(III)表示的化合物、由式(V)表示的化合物和由式(IV)表示的额外化合物。由式(I)、(II)或(III)表示的化合物与由式(V)表示的化合物和由式(IV)表示的化合物之比为约0.99:0.005:0.005至约0.01:0.09:0.009，例如约0.9:0.05:0.05至约0.1:0.08:0.01，例如约0.8:0.1:0.1至约0.1:0.1:0.8。
化合物或组合物的三维结构
长而柔软的纳米虫的体内血液循环时间是其球形类似物的约10倍，并且循环时间比任何合成颗粒或具有聚环氧乙烷涂层的囊泡都要长得多。另一方面，短棒的循环时间要短得多，但是更有效地被细胞摄入。
本发明的化合物或组合物可以具有三维结构，即纳米虫或纳米棒。纳米棒的长径比可为约10:1至约1000:1，例如约10:1至约100:1，例如约25:1至约75:1。纳米棒的直径可为约10nm至约20nm，长度为约100nm至约10微米，例如约1微米至约2微米。
本发明的化合物和组合物也可以具有球形、囊泡、环形圈或薄片等三维结构。本发明组合物的三维结构可以在水中长时间稳定(例如，纳米虫可在室温下稳定一年以上)，也可以冷冻干燥并重新水化而没有结构重组。例如，纳米虫溶液可以冷冻干燥以提供干粉。该冷冻干燥的产物可以在Milli-Q水中以约8重量％再水化2h。本发明的组合物的冷冻干燥能力提供了本发明组合物的稳定运输。
纳米虫形成
苯乙烯与官能聚(NIPAM)大链转移剂(大CTA)在水中的RAFT介导聚合制备官能热敏聚合物纳米棒的过程如下：
前体化合物(例如，由式(I)表示但没有聚苯乙烯嵌段的化合物)可以与苯乙烯、十二烷基硫酸钠和偶氮二异丁腈(AIBN)在水(例如Milli-Q水)中混合形成反应混合物。也可以向反应混合物中添加一种或多种额外的前体化合物(例如，以式(IV)表示但不具有聚苯乙烯嵌段的化合物)。
可以将AIBN溶解在苯乙烯中，然后将该溶液添加到包含其他反应组分的烧瓶中，以形成反应混合物。可以通过用氩气吹扫例如约15分钟，将AIBN和苯乙烯的溶液脱氧。反应混合物可在冰浴中用氩气吹扫例如约10分钟，然后在70℃加热约3.5小时，以形成产物混合物。
除非另有说明，否则产物混合物中式(IV)化合物的数均分子量(Mn)是通过核磁共振光谱法测定的。1H NMR可通过冷冻干燥产物混合物以除去所有水分和低沸点化合物，然后将产物混合物溶于CDCl3中来测定。取3滴胶乳并溶解在1mL THF中，过滤并将溶液注入SEC设备中，可获得尺寸排阻色谱图。
作为另选，可以通过重量分析法确定苯乙烯单体的转化率。理论分子量可根据单体转化率计算。分子量(Mn(SEC))和PDISEC可通过THF SEC获得。分子量(Mn(NMR))由1H NMR获得。粒径(Dh)和粒径分布(PDIDLS)可通过反应终止后立即在70℃下通过动态光散射(DLS)测量，结果为三次测量的平均值。PDIDLS<0.1表示窄分布。
使用超声将纳米虫切成纳米棒
通过温度定向形态转化(TDTM)和超声切割纳米虫，可获得纳米棒。在至少一个方面中，将6mL纳米虫的乳胶溶液转移到2个热小瓶中(每个3mL)，每个小瓶中含60SL甲苯。然后密封这些小瓶并振荡。可将这些小瓶中的悬浮液冷却至23℃。可用约30分钟将乳胶溶液从70℃冷却至15℃。可通过透射电子显微镜(TEM)表征纳米结构，从而确认虫状纳米结构体的形成。为形成棒状，可通过添加10mL Milli-Q水将纳米虫稀释，并使用超声探头在冰浴中以35％的振幅(3mm Tapered Micro Tip，Sonics&Materials的VC-750系统)将其切割(脉冲接通3s和断开2s作为一个脉冲周期)3分钟。超声切割后，可再次通过TEM表征纳米结构，以确认纳米棒的形成。
也可以通过以不同的脉冲周期(接通15秒和断开10秒作为一个脉冲循环)施加探测的超声，将纳米虫切割成纳米棒，(B)12个循环(3分钟)，(C)36个循环(9分钟)和(D)48个循环(12分钟)。
在至少一个方面，将本发明的纳米虫或纳米棒组合物加热至高于PNIPAM嵌段的低临界溶液温度(LCST)(约37℃)可以产生一种凝胶，其冷却时可以解离恢复成溶胶；其为可逆的过程。纳米虫可以在水溶液中以最小重量分数约1重量％至约8重量％形成凝胶。纳米棒可以在水溶液中以约1重量％至约8重量％的最小重量分数形成凝胶。不受理论的束缚，但凝胶是有利的，因为它们可以随着温度升高(例如从室温到受试者如人的体温)而解离，从而使得纳米虫的三维结构能够解离并通过血液移动。
可以按以下方式测定在37℃可形成凝胶的纳米棒在水中的重量百分比：通常，可通过在25℃在1.5ml Eppendorf管中以30重量％涡旋，将冷冻干燥的纳米棒(例如20mg)在Milli-Q水中再分散。然后将管盖好并浸入37℃的水浴中2分钟。然后将管在水浴下翻转以观察凝胶的形成。凝胶形成定义为在30秒内没有可观察到的流体流动。通过添加更多的Milli-Q水并涡旋可降低重量百分比。然后可以再次检查凝胶的形成。将纳米棒例如在37℃下在水中形成凝胶的最小重量百分比定义为形成凝胶的重量％。
合成式(I)化合物的优选方法
合成由式(I)表示的化合物的优选方法如方案图1所示。吡啶基二硫封端的二嵌段共聚物与马来酰亚胺封端的季铵聚合物在三(2-羧乙基)膦(TCEP)存在下在水中反应，形成由式(I)表示的化合物。作为与马来酰亚胺封端的季铵聚合物反应形成由式(I)表示的化合物的原料，吡啶基二硫封端的二嵌段共聚物可为由式(IV)或(V)表示的化合物。
方案图1
沉积化合物和组合物的方法
本发明的化合物和组合物可以通过任何合适的沉积方法沉积在物体的表面上。沉积方法可以包括涂漆、浸涂、喷涂、标记、粘贴、刷涂、旋涂、辊涂、刮刀涂中的一种或多种。沉积前，可将本发明的化合物或组合物在溶剂中稀释，例如在水中稀释。沉积后，溶剂可在室温下蒸发，从而在物体上形成化合物/组合物层。
在至少一个方面，所述物体是飞机/航天器/船的内表面、或飞机/航天器/船的空气过滤器表面，例如空调或过滤系统的表面。所述物体可以是飞机内部的地板表面、座椅表面、上架箱表面、天花板表面、门表面和/或门把手表面。
在至少一个方面，将本发明的化合物或组合物喷涂到物体表面约1秒至约10分钟，例如约30秒至约2分钟。在至少一个方面，化合物或组合物以约1mL至约25kL，例如约100L至约1kL的量喷涂到物体表面上。
在物体上设置的本发明的化合物或组合物可预防、减少和/或消除细菌和病毒的存在，从而可预防、减少和/或消除人与此类细菌和病毒的接触。
本发明的包含纳米结构体(例如纳米棒或纳米虫)的组合物有利地沉积在表面上，因为例如抗菌和抗病毒化合物可以涂覆为单层，同时保持两种化合物的功效。如上所述，可将例如具有常规抗微生物化合物的组合物施加到表面上以在表面上形成第一层。具有例如常规抗病毒化合物的组合物可以施加到第一层上，以形成第二层。但是，第二层(抗病毒层)会掩盖抗微生物的第一层(阻碍其抗微生物能力)。
与涂覆两层以上相比，将具有纳米结构体的组合物涂覆为单层还可减少将化合物涂覆至表面的成本和时间。
作为药物使用的方法
本发明进一步提供了通过向受试者施用治疗有效量的一种或多种上述化合物或组合物来治疗患有或易患病症的受试者的此种病症的方法。一方面，所述治疗是预防性治疗。另一方面，所述治疗是姑息治疗。另一方面，治疗是恢复性治疗。
治疗病症的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐(或具有由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐的组合物)。
1.病症
根据本发明可治疗的病症包括但不限于由毒素(例如抗原)和炎性疾病(如败血性休克)引起的病症。根据本发明可治疗的病症包括但不限于病毒感染、细菌感染、慢性炎性疾病、急性炎性疾病和癌症。优选的是，所治疗的病症包括细菌感染、病毒感染或癌症免疫疗法。癌症免疫疗法可以包括***，例如那些由人***瘤病毒感染子宫颈而引起的疾病。
病毒感染可以包括由埃博拉病毒、流感病毒、SARS病毒、诺如(胃)或寨卡病毒引起的感染。病毒感染可以包括病毒性呼吸道(例如鼻、喉咙、上呼吸道或肺)感染，例如肺炎、喉气管支气管炎、细支气管炎。病毒感染可包括病毒性胃肠道感染，例如由诺如病毒或轮状病毒引起的胃肠炎等。病毒感染可包括肝炎等病毒性肝感染。病毒感染可包括病毒性神经系统感染，例如由狂犬病或西尼罗河病毒引起的脑炎等。病毒感染包括由人***瘤病毒(HPV)引起的疣和/或感染。病毒感染可以包括引起癌症的感染，例如由爱泼斯坦-巴尔病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒8或人***瘤病毒引起的感染。病毒感染的症状包括发烧、肌肉酸痛、咳嗽、打喷嚏、流鼻涕、头痛、发冷、腹泻、呕吐、皮疹或虚弱。
细菌感染可能包括肺炎、脑膜炎、食物中毒以及细菌性皮肤感染，例如由葡萄球菌或链球菌引起的细菌感染、蜂窝织炎、毛囊炎、脓疱病和疮。细菌感染(例如食物中毒)可能包括由大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、肉毒梭菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和弧菌引起的感染。细菌感染可包括细菌性脑膜炎、中耳炎、***和呼吸道感染，如咽喉痛、支气管炎、鼻窦炎和肺炎。细菌感染的症状可包括恶心、呕吐、腹泻、发烧、发冷和腹痛。
在某些方面，本文描述的方法用于治疗患有因失调的细胞因子、酶和/或炎性介质的产生、稳定性、分泌、转译后加工而引起的疾病的患者。可能失调的细胞因子的实例包括白介素1、2、6、8、10、12、17、22和23以及肿瘤坏死因子α和干扰素α、β和γ。可能失调的炎症介质的实例包括一氧化氮、***素和白三烯。酶的实例包括环加氧酶、一氧化氮合酶和基质金属蛋白酶。
与本技术有关的炎性病症的实例包括但不限于败血症、败血性休克、内毒素性休克、外毒素诱导的毒性休克、革兰氏阴性败血症，毒性休克综合征。炎性病症可包括免疫抑制患者所经历的病症，并可还包括“超级病原体”，包括对现有疗法具有抗性的细菌和病毒株。
2.受试者
根据本发明治疗的合适的受试者包括哺乳动物受试者。本发明的哺乳动物包括但不限于人、犬、猫、牛、山羊、马、绵羊、猪、啮齿动物、兔科动物、灵长类动物等，并且包括子宫内的哺乳动物。受试者可以为任何性别并处在任何发育阶段。
3.施用和剂量
本发明的化合物或组合物可以以治疗有效量施用于受试者。
本发明的化合物或组合物可以通过任何适合的途径以适合于该途径的药物组合物的形式并以对预期治疗有效的剂量来施用。有效剂量通常为约0.001mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，优选约0.01mg/kg/天至约30mg/kg/天，单剂或分为多剂。根据年龄、物种和所治疗的病症，低于此范围下限的剂量水平可能是合适的。在其他情况下，可使用更大剂量而无副作用。较大剂量也可以分为多次小计量，用于一整天施用。
药物组合物
为了治疗上述提及的病症，本文所述的化合物可按以下方式施用：
口服施用
本发明的化合物或组合物可以口服施用，包括通过吞服施用，以便该化合物进入胃肠道，或直接从口腔吸收到血流中(例如颊或舌下施用)。
适合口服施用的组合物包括固体制剂，例如片剂、锭剂和胶囊剂，其可以含有液体、凝胶或粉末。用于口服施用的组合物可以配制成速释或控释的形式，包括延迟或持续释放的形式，任选地具有肠溶性涂层。
液体制剂可以包括溶液\糖浆和悬浮液，其可用于软胶囊或硬胶囊中。此类制剂可以包含药学上可接受的载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、纤维素或油。该制剂还可以包括一种或多种乳化剂和/或助悬剂。
在片剂剂型中，式(I)化合物的存在量可为剂型的约0.05重量％至约95重量％，例如约2重量％至约50重量％。此外，片剂可能含有崩解剂，其占剂型的约0.5重量％至约35重量％，例如约2重量％至约25重量％。崩解剂的实例包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或钙、交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素或淀粉。
用于片剂的合适润滑剂的存在量可为约0.1％至约5重量％。润滑剂可包括硬脂酸钙、硬脂酸锌或硬脂酸镁、或硬脂富马酸钠。
适用于片剂的合适粘合剂包括明胶、聚乙二醇、糖、树胶、淀粉、羟丙基纤维素等。用于片剂的合适稀释剂包括甘露醇、木糖醇、乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇或淀粉。
用于片剂的合适的表面活性剂和助流剂的存在量可以是约0.1重量％至约3重量％。表面活性剂和助流剂可包括聚山梨酯80、十二烷基硫酸钠、滑石粉或二氧化硅。
肠胃外施用
本发明的化合物和组合物可以直接施用到血液、肌肉或内部器官中。肠胃外施用的合适方法可包括静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、腹膜内、鞘内或颅内。用于肠胃外施用的合适装置包括注射器(包括针头和无针注射器)和输注方法。
用于肠胃外施用的组合物可以配制为速释或控释的形式，包括延迟或持续释放的形式。
大多数肠胃外制剂是含有赋形剂的水溶液，包括盐、缓冲剂和碳水化合物。
肠胃外制剂也可以制备为脱水形式(例如通过冻干)或作为无菌非水溶液。这些制剂可以包括水。也可以使用溶解度增强剂制备肠胃外溶液。
局部施用
本发明的化合物和组合物可以局部施用给皮肤或透皮施用。该局部施用制剂可以包括洗剂、溶液、霜剂、凝胶、水凝胶、软膏、泡沫、植入物和贴剂等。局部施用制剂的药物可接受的载体可包括水、酒精、矿物油、甘油和聚乙二醇等。局部施用可通过电穿孔、离子渗透疗法或光渗透疗法进行。
局部施用组合物可配制为速释或控释的形式，包括延迟或持续释放的形式。
组合与组合疗法
本发明的化合物和组合物可以单独使用，或与其他药物活性化合物组合使用，以治疗病症，例如上文所述的病症。本发明的化合物/组合物和其他药物活性化合物可同时施用(在同一剂型中，或者在分开的剂型中)或依次施用。因此，一方面，本发明包括通过向受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的化合物和一种或多种额外的药物活性化合物来治疗病症的方法。
在另一方面，提供了一种药物组合物，其包含一种或多种本发明的化合物、一种或多种额外的药物活性化合物以及药学上可接受的载体。
在另一方面，一种或多种额外的药物活性化合物是一种或多种抗炎药、抗动脉粥样硬化药、免疫抑制药、免疫调节药、细胞生长抑制药、抗增殖剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子阻断剂、或细胞粘附分子的抑制剂。
本发明的化合物和组合物还可以与考虑对所治疗病症的治疗价值而选择的其他治疗剂组合使用。通常，本文所述的化合物和组合物以及在采用组合疗法的方面中的其他药剂不必在同一药物组合物中施用，并且由于不同的物理和化学特性可选地通过不同的途径进行施用。最初的施用通常根据既定的方案进行，然后根据所观察到的效果依次改变剂型、施用方式和施用次数。在某些情况下，将本文所述的式(I)的化合物与另一种治疗剂组合施用是合适的。仅作为示例，如果患者在接受式(I)的化合物时经历的副作用之一是皮疹，那么将抗组胺药与初始治疗剂组合施用是合适的。或者，仅作为示例，式(I)的化合物的治疗效果通过也具有治疗益处的另一种治疗剂(也包括治疗方案)的施用而增强。不管被治疗的是什么疾病、紊乱或病症，患者所经历的总益处或者是两种治疗剂的简单加和，或者患者经历协同益处。
当药物用于治疗组合时，治疗有效剂量会有所不同。实验确定用于组合治疗方案的药物和其他药剂的治疗有效剂量的方法是已经记录的方法学。组合治疗还包括在不同时间开始和终止的周期治疗，以帮助患者进行临床管理。在任何情况下，都可以以任何顺序或者甚至同时施用多种治疗剂(其中一种是式(I)化合物)。如果同时施用，则多种治疗剂可选地以单一的统一形式或以多种形式提供(仅作为示例，作为单个药丸或作为两个分开的药丸)。
在一些方面，一种治疗剂以多剂量给予，或者两者均以多剂量给予。如果不是同时施用，则多剂量之间的时间间隔任选地从大于0周到小于12周变化。
另外，组合方法、组合物和制剂不限于使用仅两种药剂，还可设想使用多种治疗组合。可以理解，用于治疗、预防或改善所寻求缓解的病症的剂量方案可以根据多种因素进行可选地修改。这些因素包括：受试者罹患的疾病以及年龄、体重、性别、饮食和身体状况。因此，在某些方面，实际使用的剂量方案可以在很大的范围内变化，因此可以偏离本文所述的剂量方案。
组成本文公开的组合疗法的药剂任选地是组合剂型或旨在基本上同时施用的单独剂型。组成组合疗法的药剂也可以可选地依次施用，其中任何一种药物都通过需要两步施用的方案施用。两步施用方案可选地要求对活性剂进行顺序施用，或对单独的活性剂进行间隔施用。多个施用步骤之间的时间间隔从几分钟到几小时不等，具体取决于每种药剂的特性，例如药剂的功效、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学特性。靶标分子浓度的昼夜节律变化可选地用于确定最佳剂量间隔。
由式(I)代表的化合物和具有由式(I)表示的化合物的组合物可与以下类别的药物组合使用(例如施用)：NSAID、免疫抑制药、免疫调节药、细胞生长抑制药、抗增殖剂、血管生成抑制剂、生物制剂、类固醇、维生素D3类似物、类维生素A、其他激酶抑制剂、细胞因子阻断剂、皮质类固醇和细胞粘附分子的抑制剂。在受试者患有或有风险患有动脉粥样硬化或与动脉粥样硬化有关的疾病中时，本文所述的由式(I)表示的化合物或具有由式(I)表示的化合物的组合物可任选地与一种或多种用于治疗动脉粥样硬化或与动脉粥样硬化相关的病症的药物或方法以任何组合一起使用。用于治疗动脉粥样硬化或与动脉粥样硬化相关的病症的治疗剂/治疗物的实例包括但不限于以下任何一种：托西曲布、阿司匹林、烟酸、HMGCoA还原酶抑制剂(例如，阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀)、考来维仑、消胆胺、考来替泊、吉非贝齐、普罗布考和氯贝特。
在受试者患有或有风险患有炎性病症的情况中，本文所述的由式(I)表示的化合物或具有由式(I)表示的化合物的组合物可任选地与一种或多种用于治疗炎性病症的药剂或方法以任何组合一起使用。用于治疗自身免疫和/或炎性病症的治疗剂/治疗物的实例包括但不限于以下任何一种：皮质类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)(例如布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、阿司匹林、非诺洛芬(Nalfon)、氟比洛芬(Ansaid)、酮洛芬、奥沙普嗪(Daypro)、双氯芬酸钠(Voltaren)、双氯芬酸钾(Cataflam)、依托度酸(Lodine)、吲哚美辛(Indocin)、酮咯酸(Toradol)、舒林酸(Clinoril)、托美汀(Tolectin)、甲氯芬那酸酯(Meclomen)、甲芬那酸(Ponstel)、萘丁美酮(Relafen)、吡罗昔康(Feldene)、cox-2抑制剂(例如塞来昔布(Celebrex)))、免疫抑制剂(例如甲氨蝶呤(Rheumatrex)、来氟米特(Arava)、硫唑嘌呤(Imuran)、环孢素(Neoral，Sandimmune)、他克莫司和环磷酰胺(Cytoxan)、CD20阻断剂(利妥昔单抗)、肿瘤坏死因子(TNF)阻断剂(例如依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)和阿达木单抗(Humira))、阿巴西普(CTLA4-Ig)和白介素1受体拮抗剂(例如Anakinra(Kineret)、白介素6抑制剂(例如Actemra)、白介素17抑制剂(例如AlN457)、Janus激酶抑制剂(例如Tasocitinib)、syk抑制剂(例如R788)、氯喹及其衍生物。
为了用于癌症和肿瘤性疾病，本文所述的由式(I)表示的化合物或具有由式(I)表示的化合物的组合物可任选地与以下一种或多种药物一起使用：其中抗癌剂是EGFR激酶抑制剂、MEK抑制剂、VEGFR抑制剂、抗VEGFR2抗体、KDR抗体、AKT抑制剂、PDK-1抑制剂、PI3K抑制剂、c-kit/Kdr酪氨酸激酶抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR2抑制剂、PDGFR-β抑制剂、KIT抑制剂、Flt3酪氨酸激酶抑制剂、PDGF受体家族抑制剂、Flt3酪氨酸激酶抑制剂、RET酪氨酸激酶受体家族抑制剂、VEGF-3受体拮抗剂、Raf蛋白激酶家族抑制剂、血管生成抑制剂、Erb2抑制剂、mTOR抑制剂、IGF-1R抗体、NFkB抑制剂、蛋白体抑制剂、化学治疗剂或葡萄糖减少剂。
方案
项目1.一种由式(I)表示的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
Q是氟、氯、溴或碘；
s、b和n各自独立地是约10到约100的整数；且
v、j、p、z、q、x和m各自独立地是1到约20的整数。
项目2.如项目1所述的化合物，其中，s是约20至约40的整数。
项目3.如项目1或2所述的化合物，其中，s是约25到约35的整数。
项目4.如项目1至3中任一项所述的化合物，其中，b是约30至约60的整数。
项目5.如项目1至4中任一项所述的化合物，其中，b是约40到约50的整数。
项目6.如项目1至5中任一项所述的化合物，其中，n是约30至约60的整数。
项目7.如项目1至6中任一项所述的化合物，其中，n是约50到约60的整数。
项目8.如项目1至7中任一项所述的化合物，其中，m是约1至约10的整数。
项目9.如项目1至8中任一项所述的化合物，其中，m是约5到约10的整数。
项目10.如项目1至9中任一项所述的化合物，其中，Q是氯。
项目11.如项目1至10中任一项所述的化合物，其中，x是约5到约15的整数。
项目12.如项目1至11中任一项所述的化合物，其中，x是整数7、11或15。
项目13.如项目1至12中任一项所述的化合物，其中，整数n与整数m之比为约1:1至约100:1。
项目14.如项目1至13中任一项所述的化合物，其中，整数n与整数m的比为约5:1至约15:1。
项目15.如项目1至14中任一项所述的化合物，其中，所述化合物由式(II)表示，或是其药学上可接受的盐：
其中：
Q是氟、氯、溴或碘；
s、b和n各自独立地是约10到约100的整数；且
x和m各自独立地是1至约20的整数。
项目16.如项目15所述的化合物，其中，式(II)的s是约20至约40的整数。
项目17.如项目15或16所述的化合物，其中，式(II)的s是约25到约35的整数。
项目18.如项目15至17中任一项所述的化合物，其中，式(II)的b是约30至约60的整数。
项目19.如项目15至18中任一项所述的化合物，其中，式(II)的b是约40到约50的整数。
项目20.如项目15至19中任一项所述的化合物，其中，式(II)的n是约30至约60的整数。
项目21.如项目15至20中任一项所述的化合物，其中，式(II)的n是约50到约60的整数。
项目22.如项目15至21中任一项所述的化合物，其中，式(II)的m是约1至约10的整数。
项目23.如项目15至22中任一项所述的化合物，其中，式(II)的m是约5到约10的整数。
项目24.如项目15至23中任一项所述的化合物，其中，Q是氯。
项目25.如项目15至24中任一项所述的化合物，其中，式(II)的x是约5到约15的整数。
项目26.如项目15至25中任一项所述的化合物，其中，所述化合物由式(III)表示，或是其药学上可接受的盐：
其中，x是约5到约15的整数。
项目27.如项目15至26中任一项所述的化合物，其中，x是整数7、11或15。
项目28.一种组合物，其包含：
项目15至27中任一项所述的化合物；和
由式(IV)表示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
式(IV)的s和b各自独立地是约10到约100的整数；
式(IV)的v是约1到约20的整数；
R1是–O–或–NH–；且
R2是–CH3、生物素、吡啶基二硫、多巴、硫内酯或金刚烷基。
项目29.如项目28所述的组合物，其中，式(IV)的s是约25到约35的整数。
项目30.如项目28或29所述的组合物，其中，式(IV)的b是约40到约50的整数。
项目31.如项目28至30中任一项所述的组合物，其中，式(IV)的v是2。
项目32.如项目28至31中任一项所述的组合物，其中，R2为
项目33.如项目28至32中任一项所述的组合物，其中，由式(IV)表示的化合物是以下一种或多种：
其中，式(IV)的s是约25到约35的整数，且式(IV)的b是约40到约50的整数。
项目34.如项目28至33中任一项所述的组合物，其中，该组合物具有三维结构，所述三维结构是纳米虫或纳米棒。
项目35.如项目28至34中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是长径比为约10:1至约1000:1的纳米棒。
项目36.如项目28至35中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是直径为约10nm至约20nm且长度为约1微米至约2微米的纳米棒。
项目37.如项目28至36中任一项所述的组合物，其中，由式(I)表示的化合物与由式(IV)表示的化合物之比为约0.01:1至约1:0.01。
实施例
实验：
测量
核磁共振(NMR)。所有NMR谱均使用外部锁(CDCl3或DMSO-d6)并参考残留的非氘化溶剂(CHCl3或DMSO)在Bruker DRX 400或500MHz光谱仪上记录。
尺寸排阻色谱法(SEC)和三重检测-尺寸排阻色谱法(TD-SEC)。使用配备有示差折光率检测器的Polymer Laboratories GPC50 Plus测定聚合物的分子量分布分析。使用配备有双角度激光散射检测器、粘度计和示差折光率检测器的Polymer Laboratories GPC50Plus确定聚合物的绝对分子量。以1.0mL/min的流速使用高效液相色谱(HPLC)级N,N-二甲基乙酰胺(DMAc，包含0.03重量％的LiCl)作为洗脱液。使用两个串联并保持在50℃的恒定温度下的PLGel Mixed B(7.8×300mm)SEC柱进行分离。三重检测系统使用5mg/mL 110K聚苯乙烯(PSTY)标准品进行校准。已知浓度的样品在DMAc+0.03重量％LiCl中新鲜制备，并在注射前通过0.45μm的PTFE注射器式过滤器。使用Polymer Laboratories Multi Cirrus软件基于定量回收技术确定绝对分子量和dn/dc值。
透射电子显微镜(TEM)。使用JEOL-1010透射电子显微镜在环境温度下使用100kV的加速电压和光斑尺寸5来分析聚合物晶格的纳米结构外观。典型的TEM网格制备方法如下：将纳米结构体样品在34℃下用Milli-Q水稀释至约0.05重量％。然后将Formvar预热(34℃)的铜TEM网格浸入稀释溶液中，用滤纸吸干多余的溶液，然后在34℃下干燥。
基质辅助的激光解附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。使用在反射模式下运行的Bruker autoflex III智能束记录质谱图。离子在337nm的氮气激光下以20kV的电位加速。在四氢呋喃(THF)中的聚合物溶液浓度为1mg/mL，对于三氟乙酸钠(NaTFA)在THF中为1mg/mL，对于DCTB(T-2-(3-(4-叔丁基-苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基)丙二腈)10mg/ml。为制备待测样品，将20μL聚合物溶液、20μL DCTB溶液和2μL NaTFA溶液在Eppendorf管中混合，涡旋并离心。将1μL溶液放在样品板点上，在环境条件下干燥，然后进行测量。
UV-Vis分光光度计。UV-Vis吸收光谱记录在25℃的UV-Vis Cary 4000分光光度计上。
共聚焦显微镜。将荧光探针标记的纳米棒以20mg/mL的浓度分散在Milli-Q水中，以获得共聚焦显微镜图像。将5SL的每个样品滴在载玻片上。使用带有油浸物镜(1.40OilDIC M27/63x)的共聚焦LSM Zeiss 710激光扫描显微镜(倒置)获得共聚焦显微镜图像。俄勒冈绿488和SAv-DyLight 550分别使用了488nm和561nm的两个激发波长。
动态光散射(DLS)。使用Malvern Zetasizer Nano系列3000HS，运行DTS软件，在633nm下以4mW He-Ne激光操作，进行动态光散射测量。在173o角进行分析。聚苯乙烯的样品折射率(RI)设置为1.59。水的分散剂粘度和RI分别设置为0.4071mP(70℃)和1.33Ns/m2。报告了数均流体动力学粒径和粒径分布(PSD)。PSD用于描述粒径分布的宽度。其是通过DLS测得的强度自相关函数的累积分析得出的，并且与假设的高斯分布的标准偏差(即，PSDDLS＝σ2/ZD2，其中σ是标准偏差，ZD是Z平均大小)相关。
为了确定所有PNIPAM MacroCTA的低临界溶液温度(LCST)，将聚合物MacroCTA以5mg/mL或53.8mg/mL的浓度溶于冰浴中的Milli-Q水中，并加入浓度分别为0.21mg/mL或2.23mg/mL的SDS。然后使用0.45μm纤维素注射器过滤器将溶液直接过滤到DLS比色杯中。将聚合物溶液冷却至5℃，并将比色杯置于DLS光谱仪中。通过以SOP(标准操作程序)软件控制的升温速率将温度从5℃缓慢升高到70℃进行测定。
材料：
官能聚合物纳米结构材料的合成
除非另有说明，否则所有化学品均按收到时原样使用。所用溶剂为HPLC或AR级；包括二氯甲烷(DCM；Aldrich AR级)、二甲基甲酰胺(DMF；Aldrich，AR级)和四氢呋喃(THF；Labscan，HPLC级)、DMSO(Aldrich，99.9％)。活性碱性氧化铝(Aldrich：Brockmann I，标准品，约150目，58A)、Milli-Q水(Biolab，18.2M＝m)、十二烷基硫酸钠(SDS；Aldrich，99％)、三乙胺(TEA；Fluka，99％)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC，Aldrich，99％)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，Aldrich，98％)、乙醇胺(Aldrich，>99％)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，Mreck，99％)、硫酸铜(II)(Aldrich，99％)、L抗坏血酸(Aldrich，99％)，1-丁硫醇(Aldrich，99％)、炔丙醇(Aldrich，99％)、叠氮化钠(Aldrich，99.5％)、甲基丙烯酰氯(Fluka，97％)、3-氯-1-丙醇(Aldrich，98％)、聚乙二醇单甲氧基醚-2000(mPEG，Aldrich)、对甲苯磺酰氯(Aldrich，>99％)，β-环糊精(Sigma，>97％)、烯丙胺(Aldrich，98％)、AldrithiolTM-2(DPDS，Aldrich，98％)，2-巯基乙醇(Merck，>98％)、多巴胺盐酸盐(Sigma)、DL-高半胱氨酸硫内酯盐酸盐(Tla，Aldrich，>99％)、生物素(Sigmal-Aldrich，>99％)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，Fluka，>98％)、还原型L-谷胱甘肽(Sigma-Aldrich，>98％)、链霉菌的链霉亲和素(SAv，Sigma)、缀合的链霉亲和素DyLight 550(Pierce)、Oregon GreenR 488马来酰亚胺(Molecular ProbesR)、二硫化碳(Aldrich，>99.9％)、2-溴-2-甲基丙酸(Aldrich，98％)和2-溴丙酸甲酯(MBP；Aldrich，98％)按收到时原样使用。将苯乙烯(STY：Aldrich，>99％)通过碱性氧化铝柱以除去抑制剂。N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM：Aldrich，97％)从(正己烷/甲苯，9/1，v/v)中重结晶，并将偶氮二异丁腈(AIBN，Riedel-de Haen)在使用前从甲醇中重结晶两次。
根据先前的程序(C.N.Urbani,M.J.Monteiro,Macromolecules,2009,42,3884-3886)合成了RAFT剂2-(丁基硫代羰基硫代基硫代)丙酸甲酯(MCEBTTC)。
羧酸官能RAFT剂(酸-RAFT)的合成
在500mL圆底烧瓶中，将磷酸三钾(16.6g，0.0782mol)溶于130mL丙酮中。将该混合物搅拌5h制成淡黄色悬浮液。向该混合物中加入1-丁硫醇(8.0mL,0.0742mol)并搅拌1h。然后将二硫化碳(9.1mL，0.151mol)滴加到该搅拌的混合物中，并在0.5℃(在冰浴中)搅拌2h。2-溴-2-甲基丙酸(11.7g,0.07mol)搅拌下加入混合物中，使混合物在室温(23℃)下反应过夜。通过过滤分离固体，并通过旋转蒸发减少溶剂的体积。残余物用冷的10％HCl溶液(4x50mL)稀释，并在室温下搅拌过夜。然后将该溶液用正己烷萃取两次，用无水MgSO4干燥，过滤，并通过旋转蒸发除去溶剂。残留的黄色固体通过柱色谱法纯化(在二氧化硅上，石油溶剂油/乙酸乙酯：3/2，Rf＝0.51)。然后通过旋转蒸发除去溶剂，将化合物溶解在正己烷中，并保存在冰箱中以结晶。将产物过滤，在高真空下干燥24h，收率61％。1H NMR(CDCl3,298K,300MHz)：ppm 3.27(t,2H；J＝7.38Hz；CH3CH2CH2CH2S-),1.70(s,6H；(CH3)2-),1.64(m,2H,J＝8.94Hz；CH3CH2CH2CH2S-),1.41(m,2H；J＝7.29Hz；CH3CH2CH2CH2S-),0.90(t,3H,J＝7.26Hz；CH3CH2CH2CH2S-)；13C NMR(CDCl3,298K,75MHz)：228.3,128.9,55.6,36.7,29.8,25.2,22.1,13.6。
吡啶基二硫官能RAFT剂(PDS-RAFT)的合成
如方案图2所示，RAFT-酸(2.52g，0.01mol)、羟乙基吡啶基二硫(2.0g，0.011mol)、DCC(4.12g，0.02mol)和DMAP(0.112g,9.18x 10-4mol)溶于用冰浴冷却至0℃的50mL DCM中。将反应混合物温热至室温并搅拌24h。通过旋转蒸发除去DCM。将残余物再分散在***中，过滤。将滤液浓缩至粘性残余物，并通过硅胶柱色谱法(1/4石油溶剂油/乙酸乙酯)纯化，收率：59.4％。
多巴胺官能RAFT剂(多巴-RAFT)的合成
如方案图3所示，将RAFT酸(3.0g，0.012mol)、NHS(1.5g，0.013mol)和DCC(2.67g，0.013mol)溶解在用冰浴冷却至0℃的50mL DCM中。将反应混合物温热至室温并搅拌2小时。通过TLC监测反应以将其完全转化为RAFT-活性酯。然后将混合物过滤至带搅拌器的另一个圆底烧瓶中。将多巴胺盐酸盐(2.0g,0.011mol)和TEA(1.7mL，0.012mol)溶解在10mL DMF中，并逐滴加入上述RAFT-活性酯中。将反应混合物再搅拌24h。反应混合物的颜色变为棕色。将50mL DCM添加到反应混合物中。然后将混合物先后用0.1N HCl溶液洗涤，并然后用Milli-Q水洗涤。DCM相的颜色变为黄色。DCM相经MgSO4干燥、过滤并浓缩。滤液浓缩至粘稠残留物，并通过硅胶柱色谱法(1/1石油溶剂油/乙酸乙酯)纯化，收率：44.3％。
生物素官能RAFT剂(生物素-RAFT)的合成
羟基官能RAFT(RAFT-OH)的合成
如方案图4所示，将RAFT酸(1.75g,6.9x 10-3mol)、NHS(0.95g,8.3x 10-3mol)和DCC(1.72g,8.3x 10-3mol)溶解在用冰浴冷却至0℃的30mL DCM中。将反应混合物温热至室温并搅拌2h。通过TLC监测反应，使其完全转化为RAFT活性酯。然后将混合物过滤至带搅拌器的另一圆底烧瓶中。将乙醇胺(0.4g,6.5x 10-3mol)溶于10mL DMF中，并滴加至上述RAFT-活性酯中。将反应混合物再搅拌24h。将混合物过滤，浓缩至粘性残余物，并通过硅胶柱色谱法(1/2石油溶剂油/乙酸乙酯)纯化，收率：55.0％。
生物素官能RAFT(生物素-RAFT)的合成
如方案图5所示，RAFT-OH(1.10g,3.73x 10-3mol)、生物素(0.91g,3.73x 10- 3mol)、EDC.HCl(1.42g,7.45x 10-3mol)和DMAP(45.5mg,3.73x 10-3mol)溶解在用冰浴冷却至0℃的20mL DMF中。将反应混合物加热至室温并搅拌48h。然后用100mL DCM稀释反应混合物，并用去离子水洗涤五次。然后将DCM相用MgSO4干燥，过滤，浓缩至粘稠的残留物，并通过硅胶柱色谱法(1/8甲醇/DCM)纯化，收率：69.6％。
官能聚(NIPAM)大-CTA的合成
通过在DMSO中于60℃下可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT聚合)合成所有的官能聚(NIPAM)大-CTA。对于所有不同的官能RAFT剂，NIPAM/RAFT剂/AIBN的进料比保持为44/1/0.1。DMSO与NIPAM的比例保持为2/1(v/w)。通常，(10g,8.85x 10-2mol)、甲基-RAFT(0.58g,2.0x 10-3mol)和AIBN(3.3mg,2.0x 10-4mol)溶解于20mL DMSO中。将混合物用氩气吹扫30分钟，然后在60℃加热16h。通过在冰浴中冷却至0℃并暴露于空气中来终止反应。然后将溶液用500mL DCM稀释并用Milli-Q水(5x 100mL)洗涤。然后将DCM相用无水MgSO4干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。通过在大量过量的***(500mL)中沉淀而回收聚合物，通过过滤分离，然后在室温下真空干燥24小时，得到黄色粉末产品(收率45％)。由1H NMR谱确定的转化率为96％。
表1总结了官能聚(NIPAM)大CTA的数据。
表1
苯乙烯与官能聚(NIPAM)大CTA在水中的RAFT介导的乳液聚合
聚合反应如下：聚(NIPAM)大CTA的累积总质量为(0.35g)。反应混合物中存在的其他组分为苯乙烯(0.35g)；SDS(14.5mg)，AIBN(1.2mg)，Milli-Q水(6.25g)。将多巴聚(NIPAM)大CTA 3(0.105g，1.33x 10-5mol)、生物素聚(NIPAM)大CTA 4(0.07g，1.66x 10- 5mol)和SDS(7.25mg,5x 10-5mol)溶于Schlenk管中的冷水(3.125g)中。用氩气吹扫15分钟使混合物脱氧。将AIBN(0.6mg，3.7x 10-6mol)溶解在苯乙烯中(0.175g，1.7x 10-3)，然后将溶液注入Schlenk烧瓶中。然后将混合物在冰浴中用氩气吹扫另外10分钟，然后加热到70℃，保持3.5h。聚合物乳液经SEC、1H NMR和DLS表征。数据如表2所示。
表2
此外，60％多巴官能/40％生物素官能组合物的透射电子显微镜图像示出：该组合物的三维结构是纳米虫。1H NMR表明在每个二嵌段聚合物平均有45个NIPAM重复单元和29至30个PSTY重复单元。
纳米虫对表面的涂覆
依次用10％HCl水溶液、丙酮和甲醇洗涤玻璃盖片(和硅晶片)。然后在氮气流下干燥盖片。向四个50ml塑料小瓶(a、b、c和d)中，在每个小瓶中添加10mg的60％多巴官能和40％生物素官能的纳米虫，并分散在4ml三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)溶液(10mM，pH＝8.5)中，再水化20分钟。加入玻璃盖片和硅晶片。然后分别向a、b、c和d小瓶中添加不同量(1、60、120、240μL)的多巴胺溶液(33mg/ml)。将混合物振荡4小时。取出硅晶片，用水洗涤，干燥以得到SEM图像。用水洗涤玻璃盖片，然后将其浸入0.5ml的SAv-DyLight 550蛋白溶液中1分钟。然后再次用水洗涤盖片，并保持在水中进行荧光显微镜检查。
加入不同量的游离多巴胺((a)0mg/ml,(b)0.5mg/ml,(a)1.0mg/ml和(e)2.0mg/ml)并随后以SAv-550溶液处理的玻璃盖片上60％多巴官能和40％生物素官能的纳米虫的荧光图像(a-d)表明：生物素的掺入在纳米虫表面接近定量。
涂覆60％多巴官能和40％生物素官能的纳米虫的硅晶片(e-h)的SEM显示，涂布4小时和1.0mg/ml的游离多巴胺对玻璃盖片和硅晶片均给出最佳涂层。
马来酰亚胺官能阳离子聚合物的合成
呋喃保护的马来酰亚胺引发剂的合成
Soc.,2007,129(49),pp 15156–15163)。
呋喃保护的马来酰亚胺聚二甲基氨基EA(聚-DMAEA)的合成
将DMAEA 15ml(0.1mol)、引发剂0.197g(6.6x10-4mol)、CuCl2 8.8mg(6.6x10- 5mol)、三[2-(二甲基氨基)乙基]胺(Me6TREN)61mg(2.6x10-4mol)加入7.5ml异丙醇中，并用氩气吹扫30分钟。在氩气下加入Cu(0)(<425μm)12.6mg。室温下聚合6.5小时，转化率为41％。然后用丙酮稀释聚合混合物，通过中性Al2O3除去铜，将溶液浓缩并在石油精中沉淀三次，并在高真空下干燥，得到3.5g聚合物。由NMR测得Mn＝9740。图1为聚合物在氘化氯仿(CDCl3)中的1H核磁谱。对于图1所示聚合物，n为整数61。
季铵化呋喃保护的马来酰亚胺PDMAEA的合成
如方案图6所示，将聚DMAEA以甲基碘和具有不同链长的1-碘-烷烃进行季铵化(如表3所示)。将聚DMAEA与长链碘代烷在60℃下反应8小时。将溶液冷却至室温，加入相应量的碘甲烷。将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物在丙酮中沉淀，得到浅黄色粉末，然后将其在高真空下干燥。
方案图6
表3
季铵化呋喃保护的马来酰亚胺聚DMAEA的脱保护
如方案图7所示，随后将季铵化的聚DMAEA溶于DMSO(0.2g，4ml)中，然后在120℃加热3小时。然后将残留物在丙酮中沉淀，得到浅棕色聚合物材料。用NMR表征聚合物证实马来酰亚胺链末端。长碳链的百分比非常接近目标量(约10％)。
方案图7
图2A、2B和2C显示了马来酰亚胺官能季铵化-DMAEA在D2O中的1H NMR谱(n＝61)。(图2A)10mol％的1-碘辛烷，(图2B)10mol％的1-碘十二烷和(图2C)10mol％的1-碘十六烷。
马来酰亚胺官能阳离子聚合物与多巴官能和PDS官能的纳米虫的缀合
图3是示出了马来酰亚胺官能阳离子聚合物与多巴官能和PDS官能的纳米虫缀合的方案图。马来酰亚胺官能阳离子聚合物A、B或C(分别为12.7mg)加入到Eppendorf管中，并加入1ml水。将聚合物溶解后，将聚合物A、B或C的溶液添加到另一个包含纳米虫多巴-(60％)和PDS-(40％)(20mg纳米虫)的Eppendorf管中。然后加入10μl TCEP溶液(32.5mg/ml)，将Eppendorf管用铝箔包裹(避光)，并将管振荡过夜。最终产物的化学结构如下所示，其中纳米虫A的n＝7，纳米虫B的n＝11，纳米虫C的n＝15。
抗菌测试
马来酰亚胺官能阳离子聚合物A、B和C在溶液中的抗菌测试
实验设置
·对于马来酰亚胺官能阳离子聚合物A、B和C，在水中制备5mg/ml的溶液。
·在24孔板中，一式两份添加500μl聚合物水溶液，并将500μl水添加到含有LB空白和大肠杆菌的孔中。
·将500μl大肠杆菌溶液1x105细胞/ml加入到装有聚合物水溶液的孔中。将500μlLB添加到空白孔中。
·在盖上盖子之前，将板顶部用石蜡膜覆盖，然后使用更多的石蜡膜密封边缘以停止溶剂蒸发。
·然后将板置于37℃恒温箱中，以120rpm的速度振荡14小时。
根据E.coli培养物的光学密度测量聚合物的抗菌活性。图4是显示了聚合物对大肠杆菌培养物的抑制作用的柱状图。所有这三种聚合物均显示出对细菌生长的强烈抑制作用(>90％)。
官能阳离子纳米虫A、B和C在溶液中的抗菌测试
实验设置
·对于纳米虫A、B和C，在水中制备5mg/ml的溶液。
·在24孔板中，一式两份添加500μl纳米虫水溶液，并向将包含LB空白和大肠杆菌的孔中添加500μl水。
·将500μl大肠杆菌溶液1x105细胞/ml加入到装有聚合物水溶液的孔中。将500μlLB添加到空白孔中。
·在盖上盖子之前，将板顶部用石蜡膜覆盖，然后使用更多的石蜡膜密封边缘以停止蒸发。
·然后将板置于37℃恒温箱中，以120rpm的速度振荡14小时。
·由于溶液的颜色，无法通过常规的OD测量方法测量大肠杆菌。
·通过在LB琼脂平板上铺涂纳米虫/大肠杆菌溶液来监测大肠杆菌的生长。在LB中稀释，然后将20μl铺板并放置在培养箱O/N中。
图5A至5D是显示了阳离子聚合物纳米虫A、B和C对大肠杆菌的抗菌活性扫描电子显微镜图像。(图5A)LB空白和大肠杆菌对照，(图5B)纳米虫B，(图5C)纳米虫C和(图5D)纳米虫D，如图所示均具有不同的稀释度(102、104和106)。所有纳米虫都能杀死几乎100％的细菌。只看到一个大肠杆菌菌落(在图5D中圈出)。相反，在+ve对照板上看到很多大肠杆菌菌落(图5A)。这表明阳离子聚合物纳米虫可以有效杀死几乎所有的大肠杆菌。
总的来说，已经显示：通过使用SAv-生物素结合实验和SEM，已经证明纳米虫可有效地涂覆玻璃盖片和硅晶片上。马来酰亚胺官能阳离子聚合物表现出对大肠杆菌生长的极大抑制作用(>90％)。这些马来酰亚胺官能纳米虫在PDS官能和多巴官能纳米虫上的进一步缀合保留了抗菌性能。
总体而言，本发明的化合物和组合物可以提供一种抗微生物纳米结构体，该纳米结构体能够靶向结合微生物并使微生物细胞变性。本发明的组合物的官能性的比例控制提供了靶向细菌到病毒的多种微生物并使其变性的能力。
定义
术语“药学上可接受的”是指适合用于药物制剂，通常被认为可安全地这样使用，并经国家或州政府监管机构正式批准用于此用途，或列于《美国药典》或其他普遍认可的可用于动物(尤其是人类)的药典。
术语“药学上可接受的盐”是指可以增强所需药理活性的盐。药学上可接受的盐的实例包括与无机或有机酸形成的酸加成盐、金属盐和胺盐。与无机酸形成的酸加成盐的实例包括与盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸形成的盐。与有机酸形成的酸加成盐的实例如乙酸、丙酸、己酸、庚酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、邻-(4-羟基-苯甲酰基)-苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟乙磺酸、苯磺酸、对氯苯磺酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基-双环[2.2.2]辛-2-烯-羧酸、葡萄糖庚酸、4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-萘甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸和粘康酸。金属盐的实例包括钠、钾、钙、镁、铝、铁和锌离子的盐。胺盐的实例包括与氨和足以与羧酸形成盐的有机含氮碱的盐。
术语“治疗有效量”是指当为了治疗病症而向受试者施用时足以有效治疗该病症的化合物的量。“治疗有效量”可根据化合物、病症及其严重程度、年龄和要治疗受试者的体重而变化。
术语“病毒”是指亚显微感染病原体，其包括一个无生命的复杂分子，该分子通常包含围绕遗传物质RNA或DNA核的蛋白被膜，但没有半透膜，能够在活细胞中生长和繁殖，并且会导致人、动物或植物的疾病。
本发明的化合物还包括该化合物的互变异构、几何或立体异构形式。本发明也涵盖该化合物的酯、肟、鎓、水合物、溶剂化物和N-氧化物形式。本发明考虑了所有此类化合物，包括顺式和反式几何异构体(Z-和E-几何异构体)、R-和S-对映异构体、非对映异构体、d-异构体、l-异构体、阻转异构体、差向异构体、构象异构体、旋转异构体、异构体的混合物和外消旋体。
已经出于说明的目的给出了本发明的各个方面的描述，但并不意图是穷举性的或限于所公开的方面。对于本领域普通技术人员而言，许多修改和变型将是显而易见的，而不会脱离所述方面的范围和精神。选择本文使用的术语是为了最好地解释这些方面的原理，实际应用或对市场技术的技术改进，或使本领域的其他普通技术人员能够理解本文公开的方面。
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