一种组合物在制备治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用
阅读说明：本技术 一种组合物在制备治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用 (Application of composition in preparation of medicine for treating amyotrophic lateral sclerosis ) 是由 杨士豹 华垚 张正平 陈荣 龚兆龙 于 2016-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种组合物在制备治疗肌萎缩性侧索硬化症及相关障碍的药物中的应用,所述的组合物含有3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片,所述药物是肌萎缩性侧索硬化症发病时间和生存时间的药物,是改善肌萎缩性侧索硬化症记忆功能缺陷的药物。(The invention relates to an application of a composition in preparing a medicament for treating amyotrophic lateral sclerosis and related disorders, wherein the composition contains 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazoline-5-ketone or pharmaceutically acceptable salt thereof and borneol, and the medicament is a medicament for improving the onset time and survival time of the amyotrophic lateral sclerosis and is a medicament for improving the memory function defect of the amyotrophic lateral sclerosis.)
本申请是申请日为2016年06月08日，申请号为201680029994.7，发明名称为“一种组合物在制备治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用”的分案申请。
本申请要求于2015年6月10日提交中国专利局、申请号为201510314584.4、发明名称为“一种组合物在制备治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片的组合物在治疗肌萎缩性侧索硬化症及相关障碍的应用。
背景技术
运动神经元病是一种病因未明、主要累及大脑皮质、脑干和脊髓运动神经元的神经系统变性疾病，包括肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、进行性肌萎缩、进行性延髓麻痹和原发性侧索硬化。其中，ALS是运动神经元病中最常见的类型。ALS发病年龄为50～60岁之间，发病率为2/100 000，其特征为选择性的上、下运动神经元死亡，导致进行性肌肉萎缩、无力和僵硬。ALS从发病到死亡的生存中位数为39个月，大多数患者一般会在3～5年因呼吸衰竭而死亡。约有5～10％家族性ALS，通常是常染色体显性遗传；90～95％的ALS病例属于散发性ALS(Nat Rev Neurosci 2001；2:806–819；Annu RevNeurosci 2004；27:723–749)。
约有20％的家族性ALS是Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变所致。因为散发性和家族性ALS临床表现类似，阐明家族性ALS潜在机制有利于研究两种形式的ALS。因此，携带人类突变SOD1的转基因小鼠开启了家族性ALS病理研究的领域(Neuron 2006；52:39–59)。最近研究表明，散发性ALS和家族性ALS患者的脊髓组织中都存在异常的SOD1蛋白，暗示SOD1在两种形式的ALS疾病中可能均发挥作用(Annu Rev Neurosci 2004；27:723-749)。另外，最新发现家族性ALS常染色体存在RNA代谢蛋白TDP-43基因突变，同时绝大多数散发性ALS患者也存在TDP-43蛋白病理性改变，这暗示在理解散发性和家族性ALS中TDP-43可能具有极大的意义(Proc Natl Acad Sci U S A 2007；104:12524–12529)。ALS发病机制复杂，目前的生物学假说包括氧化损伤、细胞内聚集物累积、线粒体功能失常、轴突运输缺失、生长因子缺乏、胶质细胞病理和谷氨酸兴奋毒性等(Ann Neurol.2009Jan；65Suppl 1:S3-9)。
3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(依达拉奉，edaravone)作为一种新型强效的自由基清除剂，可以清除羟自由基(·OH)、一氧化氮自由基(NO·)、过氧亚硝基离子(ONOO-)(Chem Pharm Bull 2004，52(2):186-91；Redox Rep.2002，7(4):219-22；JPharmacolExpTher.2007，322(1):274-81)，抑制细胞过氧化损伤，作为一种有效的神经元保护剂(自由基清除剂)具有分布广、半衰期断、安全、毒性低等优点，为临床缺血性脑卒中有效的一线治疗药物(中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2010版)。依达拉奉对神经退行性疾病动物模型中有较好神经保护作用，如侧脑室注射β淀粉样蛋白(Aβ)和侧脑室注射链脲霉素(STZ)动物模型(Biomed Res Int.2014；2014:370368；Neurotoxicology.2013，38:136-45)。另外，依达拉奉能够减缓突变SOD1 G93A小鼠ALS症状进程和神经元退化(ExpNeurol.2008，213(2):448-55)。专利WO2005/075434公开了3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在治疗肌萎缩侧索硬化方面的应用。但是，一项临床III期研究表明，与安慰剂组相比，依达拉奉组的肌萎缩侧索硬化功能评定量表修订版(ALSFRS-R)评分降低较小，无显著差异；临床试验研究结果没有达到主要终点(NCT00330681；Amyotroph Lateral SclerFrontotemporal Degener.2014 Dec；15(7-8):610-7)。另一个临床III期实验(NCT01492686)正进行中，但尚未招募。
冰片分为合成冰片和天然冰片。合成冰片含有异龙脑，而天然冰片不含异龙脑。天然冰片又称为2-莰醇。研究表明，冰片能改善肠道吸收(AAPS PharmSciTech.2011 Dec；12(4):1044-9)，血脑屏障(J Asian Nat Prod Res.2014，16(6):648-57；JEthnopharmacol.2015，162:270-7)和角膜通透性(Pharmazie.2006，61(9):783-8)，神经保护作用(Neuroscience.2011，176:408-19；Eur J Pharmacol.2014，740:522-31)，抗炎(Inflammation.2014，37(4):1148-57)、抗氧化和保护DNA损伤(J Agric Food Chem.2014，62(28):6632-9)，增强GABA受体功能(BiochemPharmacol.2005，69(7):1101-11)，还能改善大鼠凝血功能，抗血栓活性(Am J Chin Med.2008；36(4):719-27)。
3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和天然冰片质量比4:1组合物已在中国开展临床III试验研究，用于治疗缺血性脑卒中。临床前动物实验表明，两者质量比4:1～1:1组合物能协同性减少脑梗死面积(专利CN 101848711 B)，两者4:1～2:1组合物能协同性减少脓毒症动物死亡率(专利201310474253.8)。
依据现有技术，无法预期3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和冰片的组合物是否对肌萎缩性侧索硬化症及相关障碍具有有治疗作用，也无法判断现有质量比为4:1的3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和冰片的组合物是否能够产生协同作用。
发明内容
本发明目的是提供一种组合物在制备治疗萎缩性侧索硬化症及相关障碍的药物中的应用，所述的组合物含有3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片。
本发明的另一目的在于提供一种治疗萎缩性侧索硬化症及相关障碍的方法，其中向有此需要的患者施用包含3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片的药物组合物。
本发明的又一目的在于提供一种药物组合物，所述组合物用于治疗萎缩性侧索硬化症及相关障碍；其中所述组合物包含3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片。
本发明的再一目的在于提供3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐在制备与天然冰片联合治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物中的应用。
更进一步地，所述药物组合物中3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的配合使用能协同性增加治疗萎缩性侧索硬化症的药效。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物能够改善ALS发病时间和生存时间。
在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物能够改善ALS运动功能。
在本发明的又一个实施方案中，所述药物组合物能够改善ALS记忆功能缺陷。
本发明所述的组合物中，3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的重量比为10:1～1:10，优选为4:1～1:1，进一步优选为4:1～2:1，更优选为4:1。
本发明所述的组合物中，3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的摩尔比为9:1～1:9，优选为4:1～1:1，进一步优选为3.5:1～2:1，更优选为3.5:1。
本发明所述的冰片优选为天然冰片，所述天然冰片又称为2-莰醇。
本发明所述的药物组合物，可以进一步包括药学上可以接受的赋形剂。
赋形剂一般是与药物治疗的活性药物成分(“API”)一起配制的药理学非活性物质。当生产剂型时，常使用赋形剂来对含有效活性成分的制剂进行增量(因而经常被称为“增量剂”、“填充剂”或“稀释剂”)，以允许便利又准确地分配原料药。其还可以服务于不同的治疗增强目的，诸如促进药物吸收或溶解，或其他药效动力学考虑。
更具体来说，本发明的组合物可以通过单独或与药学上可接受的载剂或稀释剂组合而配制成药物组合物，并且可以配制成呈固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射液、吸入剂、凝胶剂、微球体和气雾剂。因而，化合物的施用可以用多种方式实现，包括经口、颊、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、透皮、气管内、关节内等施用。活性剂在施用后可以是系统性的，或可以通过使用区域性施用、壁内施用或使用能将活性剂量保留在植入部位的植入物加以定位。在具体的实施方案中，制剂是口服制剂。
本发明中使用的组合疗法可以允许各单一疗法的剂量低于标准操作中目前所使用的，同时实现显著效力，包括超过常规给予任一种单一疗法时的效力。本领域技术人员应容易了解，剂量水平可以随特定化合物、症状严重程度和受试者对副作用的敏感性而变化。一些特定化合物比其他的更有效。指定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种手段容易地确定。优选手段是测量指定化合物的生理学效力。使用组合疗法可以允许各单一疗法的剂量低于标准操作中目前所使用的，同时实现显著效力，包括比常规给予任一种单一疗法时所实现的更大的效力。
附图说明
图1实施例1各组对SOD1-G93A小鼠运动功能的影响。
图2实施例2各组对SOD1-G93A小鼠进入暗室潜伏期的影响；
图3实施例2各组对SOD1-G93A小鼠避暗次数的影响；
图4实施例3各组对对SOD1-G93A小鼠体重的影响；
图5实施例3各组对对SOD1-G93A小鼠运动功能评分的影响；
图6实施例3各组对SOD1-G93A小鼠转棒实验落棒时间。
具体实施方式
下述实施例仅举例说明本发明，不应被认为是对本发明的限制。实施例中提及的依达拉奉是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，冰片是天然冰片即2-莰醇，组合物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与天然冰片的组合物。
实施例1：依达拉奉与冰片组合物对转基因肌萎缩侧索硬化小鼠的治疗作用研究
1材料与方法
1.1试验动物
携带人源的铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)(G93A突变体)的转基因小鼠(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)及野生型B6SJL F1小鼠购自南京大学。小鼠的保种和繁殖方法：用一个野生型雌鼠和一个转基因的雄鼠交配，其子代用幼鼠鼠尾抽提的DNA通过聚合酶链式反应(PCR)鉴定。
1.2药品与试剂
依达拉奉与冰片组合物，质量比4:1(所述冰片为2-莰醇)；
依达拉奉(化学名：3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)；
冰片(化学名：2-莰醇)。
1.3试验方法
1.3.1 B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1Gur小鼠的繁殖筛选：
B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1Gur雄性小鼠5只，日龄60d时开始与B6SJLF1雌性健康小鼠按1雄3雌交配。子代小鼠剪尾提取DNA(按试剂盒要求)，加SOD1引物5′-CATCAGCCCTAATCCATCTGA-3′和5′-CGCGACTAACAATCAAAGTGA-3′经PCR30个循环扩增，确定200～300bp间的SOD1基因条带。淘汰无SOD1突变基因的小鼠。
1.3.2行为学测定：
按文献报道方法，将小鼠放在转棒仪上(60Hz/min，Φ90mm)，记录小鼠放上转棒至落下的时间。每时间点每只小鼠测定3次，取小鼠呆在转棒上时间最长的1次反映小鼠的运动功能，如时间大于180s则中止测定，按180s计算。SOD1基因突变小鼠从日龄60d开始用转棒仪测定运动功能。以后每10天观察测定1次直至死亡。
1.3.3治疗过程
1.3.3.1实验剂量设置及分组：
根据文献报道依达拉奉(SOD1-G93A小鼠15mg/kg，SOD1-H46R大鼠3-6mg/kg)及其在脑缺血动物模型上的有效剂量(SD大鼠6mg/kg)折算，依达拉奉剂量设置为12mg/kg，则依达拉奉与冰片组合物设置为15mg/kg(设置为依达拉奉剂量为12mg/kg，冰片为3mg/kg)，冰片设置为3mg/kg。
SOD1基因突变小鼠日龄70d时按运动功能情况，随机将小鼠分为4组。分别是:SOD1基因突变对照组；依达拉奉与冰片组合物15mg/kg治疗组；依达拉奉12mg/kg治疗组；冰片3mg/kg治疗组；另设无SOD1突变基因的B6SJL健康小鼠对照组。每组14只，雌雄各半。
1.3.3.2实验给药：
各组动物从分组之日起腹腔注射给药，每日一次，直至死亡。健康对照及SOD1基因突变对照组动物给予相同体积的生理盐水。
1.3.4发病时间和生存时间：
当小鼠在转棒上的时间较前次测定时间降低30％以上时确定为肌力降低。据此运动功能的变化和观察小鼠前肢有无震颤确定小鼠的发病时间。当小鼠仰卧在光滑的平面上30s不能翻正反射过来或单、双眼出现严重的感染时确定为小鼠死亡将其处死。小鼠从出生至死亡的时间为小鼠的生存时间。
1.4统计处理：采用SPSS统计软件进行方差分析(多组比较)。
2试验结果
2.1对SOD1-G93A小鼠生存时间的影响
SOD1-G93A对照组小鼠在日龄113d左右时开始发病，平均生存时间为(138.4±4.6)d。组合物组、依达拉奉组在小鼠70d时开始给药，对小鼠发病时间没有影响，但能明显延长小鼠的生存时间，组合物组平均生存时间为(151.1±7.0)d，依达拉奉为(144.6±3.7)d；冰片对生存时间的影响与模型组相比无统计学差异，为(141.3±3.6)d。组合物的生存时间显著长于依达拉奉及冰片单药，说明组合物药效显著优于两个单药，见表1。B6SJL健康小鼠无临床症状，生存时间在1年以上。
根据金正均公式q＝E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)评价组合物中依达拉奉与冰片是否有协同作用。式中E(a+b)为合用药物的有效率，Ea、Eb分别为A药、B药单独用药的有效率。若q值在0.85～1.15范围内，为两药合用单纯相加，q值>1.15为增强，q值<0.85则表示两药合用有拮抗作用。按照上述公式计算，q＝1.37，说明组合物组分间具有协同效应，复方优于单方。
表1组合物、依达拉奉及冰片对SOD1-G93A小鼠发病时间及生存时间的影响
注：*，p<0.05，与SOD1-G93A对照组比较；#，p<0.05，与依达拉奉与冰片组合物组比较
2.2对SOD1-G93A小鼠运动功能的影响
由图1可见，组合物、依达拉奉均能显著减缓SOD1-G93A小鼠肌力的下降，改善动物运动功能，在110、120、130日龄时转棒时间的影响与模型对照组相比具有统计学差异(p<0.05)；冰片也具有一定延缓疾病进程的趋势，但仅在130日龄时对转棒时间的影响与模型组相比差异显著(p<0.05)。且在110、120、130日龄时组合物的作用显著优于依达拉奉及冰片(p<0.05)。
实施例2：依达拉奉与冰片组合物对转基因肌萎缩侧索硬化小鼠学习记忆的影响
1材料与方法
1.1试验动物
携带人源的铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)(G93A突变体)的转基因小鼠(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)及野生型B6SJL F1小鼠购自南京大学。小鼠的保种和繁殖方法：用一个野生型雌鼠和一个转基因的雄鼠交配，其子代用幼鼠鼠尾抽提的DNA通过聚合酶链式反应(PCR)鉴定。
1.2药品与试剂
依达拉奉与冰片组合物(所述冰片为2-莰醇)；
依达拉奉(化学名：3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)；
冰片(化学名：2-莰醇)。
1.3试验方法
1.3.1 B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1Gur小鼠的繁殖筛选：
B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1Gur雄性小鼠5只，日龄60d时开始与B6SJLF1雌性健康小鼠按1雄3雌交配。子代小鼠剪尾提取DNA(按试剂盒要求)，加SOD1引物5′-CATCAGCCCTAATCCATCTGA-3′和5′-CGCGACTAACAATCAAAGTGA-3′经PCR30个循环扩增，确定200～300bp间的SOD1基因条带。淘汰无SOD1突变基因的小鼠。
1.3.2实验过程
1.3.2.1实验剂量设置及分组：
根据文献报道依达拉奉(SOD1-G93A小鼠15mg/kg，SOD1-H46R大鼠3-6mg/kg)及其在脑缺血动物模型上的有效剂量(SD大鼠6mg/kg)折算，依达拉奉剂量设置为12mg/kg，则依达拉奉与冰片组合物设置为15mg/kg(设置为依达拉奉剂量为12mg/kg，冰片为3mg/kg)，冰片设置为3mg/kg。
SOD1基因突变小鼠日龄70d时按运动功能情况，随机将小鼠分为4组。分别是:SOD1基因突变对照组；依达拉奉与冰片组合物15mg/kg治疗组；依达拉奉12mg/kg治疗组；冰片3mg/kg治疗组；另设无SOD1突变基因的B6SJL健康小鼠对照组。每组14只，雌雄各半。
1.3.2.2实验给药：
各组动物从分组之日起腹腔注射给药，每日一次，直至行为学检测完成。健康对照及SOD1基因突变对照组动物给予相同体积的生理盐水。
1.3.2.3行为学检测
动物于约90日龄时进行被动回避实验以测定学习记忆能力。实验装置分为明、暗两室，明室以5w LED灯管照明，两室之间有一小门。实验分为三天进行。第一天给于动物适应性训练，将小鼠面部背向洞口放入明室，使其在明室、暗室间自由活动，两室均不给于电流刺激，持续时间5min。第二天进行学习实验，检测时将小鼠面部背向洞口放入明室，同时启动计时器，动物穿过洞口进入暗室而遭电击(0.19mA)，记时即为潜伏期，同时记录5min内小鼠进入暗室的避暗(错误)次数。第三天进行记忆实验，记录每只小鼠从放入明室至进入暗室的时间，若5min仍未进入暗室则潜伏期记录为300s，同时记录5min内小鼠进入暗室的避暗(错误)次数。
1.4统计处理：采用SPSS统计软件进行方差分析(多组比较)。
2试验结果
2.1对被动回避实验进入暗室潜伏期的影响
对被动回避实验中进入暗室潜伏期的影响见图2(柱状图数据表示为均值±标准误。***P<0.001，与生理对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较)。在学习实验中，经单因素方差分析，各组间无统计学差异。在记忆实验中，SOD1-G93A模型组与生理对照组相比进入暗室潜伏期显著缩短(p<0.05)。组合物及依达拉奉组与模型组相比进入暗室潜伏期显著延长(p<0.05)，冰片作用不明显。实验结果表明，SOD1-G93A动物在疾病进展过程中学习记忆能力显著下降，依达拉奉与冰片组合物及依达拉奉能够明显改善记忆功能缺陷，且组合物药效优于单药。
根据金正均公式q＝E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)评价组合物中依达拉奉与冰片是否有协同作用。式中Ea+b为合用药物的有效率，Ea、Eb分别为A药、B药单独用药的有效率。若q值在0.85～1.15范围内，为两药合用单纯相加，q值>1.15为增强，q值<0.85则表示两药合用有拮抗作用。按照上述公式计算，q＝1.29，说明组合物组分间具有协同效应，复方优于单方。
2.2对被动回避实验避暗(错误)次数的影响
对被动回避实验中的错误次数的影响见图3(柱状图数据表示为均值±标准误。***P<0.001，与生理对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较)。在学习实验中，经单因素方差分析，各组间无统计学差异。在记忆实验中，模型组与生理对照组相比避暗(错误)次数显著增加(p<0.05)。组合物及依达拉奉组与模型组相比避暗(错误)次数显著减少(p<0.05)，冰片作用不明显。实验结果表明，SOD1-G93A动物在疾病进展过程中学习记忆能力显著下降，依达拉奉与冰片组合物及依达拉奉能够明显改善记忆功能缺陷，且组合物药效优于单药。
按照上述金正均公式计算，q＝1.25，说明组合物组分间具有协同效应，复方优于单方。
实施例3依达拉奉与冰片组合物对肌萎缩侧索硬化转基因小鼠的治疗作用研究
1材料与方法
1.1试验动物
肌萎缩侧索硬化转基因小鼠(B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/JNju，以下简称SOD1-G93A小鼠)及野生型对照小鼠购于南京大学-南京生物医药研究院。
1.2药品与试剂
依达拉奉与天然冰片组合物(依达拉奉与天然冰片的质量比为4:1)
依达拉奉
利鲁唑
试验方案
1.3.1实验分组
实验动物共分为6组，分别为野生对照(Wt)组、模型(Tg)组、阳性药利鲁唑(Tg-Riluzole)组、阳性药依达拉奉15mg/kg(Tg-E15)组、组合物5mg/kg(Tg-C5组、15mg/kg(Tg-C15)组。组合物组中依达拉奉与天然冰片质量比为4:1。
1.3.2实验给药
自动物10周龄起开始给药，持续整个存活期。组合物各剂量及阳性药依达拉奉组腹腔注射给药，每日一次。阳性药利鲁唑组药物溶解于饮用水中，100μg/ml。野生对照组及模型组动物腹腔注射给于相应体积溶剂。
1.3.3实验过程
动物自10周龄起，对体重、运动功能(运动能力评分、转棒实验)进行监测，一周一次。以动物转棒实验连续两次落棒作为动物发病标志。当动物置于一侧时30秒内无法翻正，定义为疾病终点进行安乐死。
1.3.4检测指标
以体重、运动能力评分、转棒实验落棒潜伏期随时间的变化，发病时间，存活时间作为观察疾病进程的指标。
1.3.5试验方法
1.3.5.1运动功能评分
后肢：3，无衰弱；2，一肢麻痹(提尾时一肢震颤)；1，下肢轻瘫(双腿衰弱，但能动)；0，下身麻痹(腿不能动)
前肢：3，无衰弱；2，轻瘫(能微微握住拉杆)；1，瘫痪(不能握住拉杆，但能支撑胸部离开地面)；0，不能支撑胸部离开地面
躯干：1，当从转棒上落下，能扭转躯干；0，不能做上述动作
全身活动性：3，能跑；2，能走或爬；1，能翻正；0，30秒内无法翻正
每部分评分相加即为运动功能评分总分。
1.3.5.2转棒实验
第10周连续训练三天，第11周开始检测，转棒转速14rpm，记录动物落棒潜伏期，最长持续时间180s，共进行三次，记录持续时间最长一次。
试验结果
2.1对SOD1-G93A小鼠生存时间的影响
SOD1-G93A对照组小鼠在日龄110d左右时开始发病，平均生存时间为(141.4.±11.1)d。各给药组在小鼠70d时开始给药，对小鼠发病时间没有影响，但能明显延长小鼠的生存时间，见表2，组合物对生存时间的延长作用具有一定量效关系，高剂量作用优于阳性药依达拉奉及利鲁唑。野生对照小鼠无临床症状。
表2组合物对SOD1-G93A小鼠发病时间及生存时间的影响(均值±标准差)
注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与SOD1-G93A对照组比较
2.2对SOD1-G93A小鼠体重的影响
由图4可见，SOD1-G93A对照组小鼠体重从16周起逐步下降。与模型组相比，各给药组均能不同程度的减慢SOD1-G93A小鼠体重下降的进程，其中利鲁唑(Tg-Riluzole)组及组合物高剂量(Tg-C15)组动物在21周龄时体重显著高于模型对照组(p<0.05)。
2.3对SOD1-G93A小鼠运动功能的影响
2.3.1对SOD1-G93A小鼠运动功能评分的影响
由图5可见，SOD1-G93A对照组小鼠运动功能评分从16周起逐步下降。与模型组相比，各给药组均能不同程度的延缓SOD1-G93A小鼠运动功能衰退的进程。利鲁唑及组合物高剂量组小鼠16-21周龄时的评分均显著高于模型组(p<0.05)，依达拉奉组在动物17、20、21周龄的评分显著高于模型组(p<0.05)，组合物低剂量组在动物21周龄的评分显著高于模型组(p<0.05)。组合物药效具有一定量效关系，高剂量作用优于阳性药依达拉奉及利鲁唑。
2.3.2对SOD1-G93A小鼠转棒实验落棒时间的影响
由图6可见，SOD1-G93A对照组小鼠转棒实验落棒时间从16周起逐步减小。与模型组相比，各给药组均能显著延迟SOD1-G93A小鼠落棒时间，改善动物运动功能利鲁唑及组合物高剂量组小鼠16-21周龄时的落棒时间均显著长于模型组(p<0.05)，依达拉奉组在动物16、19、20、21周龄的落棒时间均显著长于模型组(p<0.05)，组合物低剂量组在动物19、20、21周龄的落棒时间均显著长于模型组(p<0.05)。组合物药效具有一定量效关系，高剂量作用优于阳性药依达拉奉及利鲁唑。
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