阅读说明：本技术 复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量检测方法 (Method for detecting content of miconazole nitrate and chlorhexidine gluconate in compound shampoo ) 是由 徐奇清 孙迎 聂姣 林孝崇 赵奉君 于 2018-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种复方香波中硝酸米康唑和葡萄糖酸氯己定的含量检测方法,其采用高效液相色谱外标法同时测定复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量。该检测方法的条件响应值高,在保证待测样品中组分分离度的情况下出峰快,硝酸咪康唑的保留时间约为3.0min左右、葡萄糖酸氯己定的保留时间为3.9min左右,能够快速测定被测组分的含量,大大提高了检测工作效率和检测结果的准确性,有利于控制产品的质量。(The invention relates to a method for detecting the content of miconazole nitrate and chlorhexidine gluconate in compound shampoo, which adopts a high performance liquid chromatography external standard method to simultaneously determine the content of miconazole nitrate and chlorhexidine gluconate in compound shampoo. The detection method has high condition response value, is quick in peak emergence under the condition of ensuring the separation degree of components in a sample to be detected, can quickly determine the content of the detected components, greatly improves the detection working efficiency and the accuracy of a detection result, and is beneficial to controlling the quality of products, and the retention time of miconazole nitrate is about 3.0min and the retention time of chlorhexidine gluconate is about 3.9 min.)

复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量检测方法

技术领域

本发明涉及兽药检测技术领域，特别是涉及一种复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量检测方法。

背景技术

香波是外来语“shampoo”的译音，主要由洗涤剂、辅助洗涤剂和添加剂组成，主要具有清洁和保养毛发的作用；添加剂可满足香波的特殊需要并赋予香波多种不同的功效，使香波的作用不断细化，在香波中添加具有抗菌作用的硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定制成的复方香波制剂，是一种新型的宠物用兽药香波制剂。

传统硝酸咪康唑的含量检测方法是采用电位滴定法测定，其滴定液是0.1mol/L高氯酸滴定液；电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法，此方法在运用上存在一定的局限性，在检测低浓度药物时其灵敏度可能会影响检测结果的准确度，而且高氯酸是一种酸性较强的无机酸，其具有强氧化性，在室温下容易分解，作为滴定液具有不稳定的因素，浓度的变化易使得检测结果出现误差。葡萄糖酸氯己定的检测通常采用紫外-可见分光光度法检测，此检测方法存在准确度相对不高的缺点。中国药典中采用高效液相色谱法(HPLC，High Performance Liquid Chromatography)仅控制硝酸咪康唑原料或其单方制剂中的的有关物质，对其复方制剂的检测方法未见记载。葡萄糖酸氯己定含漱液中的葡萄糖酸氯己定含量检测是采用梯度洗脱的高效液相色谱法检测，但是该方法的洗脱出峰时间较慢、且响应值较低。且经实验验证，结果表明采用传统的检测方法和中国药典中记载的方法，无法适用于复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量测定；目前，也尚未有针对该类制剂的质量标准和检测其中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定含量的有效方法。

发明内容

基于此，提供一种复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量检测方法，能够同时快速、有效的检测出其中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量。

一种复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量检测方法，采用高效液相色谱法同时测定复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量，包括如下步骤：

用溶剂将待测样品稀释，得到供试品溶液；所述待测样品与所述溶剂的用量比为1g：100～200)mL；

取10μL～20μL所述供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，得到所述待测样品中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量；

所述高效液相色谱检测时的色谱条件为：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：由乙腈、磷酸盐溶液和三乙胺按体积比为(35～50):(50～65):1组成，pH为3±0.1；所述磷酸盐溶液的浓度为0.02mol/L～0.08mol/L；

流速：0.5mL/min～1.5mL/min；

柱温：25℃～35℃；

检测波长：210nm～240nm；

所述溶剂的组成与所述流动相相同。

在其中一个实施例中，所述流动相由乙腈、磷酸盐溶液和三乙胺按体积比为(40～50):(50～60):1组成。

进一步地，所述流动相由乙腈、磷酸盐溶液和三乙胺按体积比为45:55:1组成。

在其中一个实施例中，所述检测波长为230nm。

在其中一个实施例中，所述磷酸盐溶液为磷酸氢二钠溶液。

在其中一个实施例中，所述色谱柱为ZORBZX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×150mm 5-Micron或Kromasil 100-5-C18 4.6×150mm。

较优地，所述色谱柱为ZORBZX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×150mm 5-Micron。

在其中一个实施例中，所述流速为0.8mL/min～1.2mL/min。

在其中一个实施例中，所述供试品溶液中葡萄糖酸氯己定的含量为0.02mg/mL～0.2mg/mL，硝酸咪康唑的含量为0.02mg/mL～0.2mg/mL。

在其中一个实施例中，调节所述流动相的pH值所用的调节剂为磷酸。

在其中一个实施例中，所述检测方法还包括以下步骤：

按外标法用硝酸咪康唑对照品进行HPLC检测，得到硝酸咪康唑的含量与与峰面积的关系，根据所述硝酸咪康唑的含量与峰面积的关系及所述供试品溶液在高效液相色谱仪中检测得到的色谱图中硝酸咪康唑的峰面积，计算得到所述待测样品中硝酸咪康唑的含量；

按外标法用葡萄糖酸氯己定对照品进行HPLC检测，得到葡萄糖酸氯己定与峰面积的关系，根据所述葡萄糖酸氯己定的含量与峰面积的关系及所述供试品溶液在高效液相色谱仪中检测得到的色谱图中葡萄糖酸氯己定的峰面积，计算得到所述待测样品中葡萄糖酸氯己定的含量。

具体的，取适量硝酸咪康唑对照品，于所述溶剂中配制成含0.02mg/mL～0.2mg/mL硝酸咪康唑对照样品，与所述供试品溶液平行地进行样品处理和检测，记录色谱图，测出所述色谱图中峰面积对应的硝酸咪康唑的浓度，绘制出标准曲线；

测出所述供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测得到的色谱图中硝酸咪康唑的峰面积，根据所述标准曲线，计算得到所述待测样品中硝酸咪康唑的含量。

上述检测方法采用高效液相外标法能同时测定复方香波制剂中硝酸咪康唑、葡萄糖酸氯己的含量，通过选择合适的流动相组分，并调整流动相的配比组成以及结合其他参数条件，检测条件响应值高，可使待测样品中的被测组分很好地分离，硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定均出峰快，能够有效缩短被测组分的保留时间，快速准确地同时测定硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量，解决了复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定含量测定的问题，同时大大提高了检测工作效率，为更好的控制产品质量提供了有效的检测方法。

附图说明

图1为实施例1复方硝酸咪康唑香波的HPLC检测色谱图；

图2为实施例1硝酸咪康唑对照品的HPLC检测色谱图；

图3为实施例1葡萄糖酸氯己定对照品HPLC检测色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明所用复方硝酸咪康唑香波为佛山市南海东方澳龙制药有限公司自制，主要由硝酸咪康唑、葡萄糖酸氯己定、洗涤剂和多种添加剂组成；硝酸咪康唑对照品和葡萄糖酸氯己定对照品购自Siga公司；乙腈、三乙胺、磷酸为色谱纯，磷酸氢二钠为分析纯。

实施例1

一种复方香波中硝酸米康唑和葡萄糖酸氯己定的含量检测方法，包括以下步骤：

1)精密称取复方硝酸咪康唑香波1g，用溶剂配制成200mL供试品溶液，其中硝酸咪康唑的含量约为0.1mg/mL，葡萄糖酸氯己定的含量约为0.1mg/mL；所述溶剂由乙腈、0.05mol/L磷酸氢二钠溶液和三乙胺按体积比为45:55:1组成，用磷酸溶液调节pH值至3.0。

2)取10μL供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行检测，得到如图1所示的色谱图，其中峰1对应的是硝酸咪康唑，峰2对应的是葡萄糖酸氯己定。

色谱条件为：

色谱柱：ZORBZX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×150mm 5-Micron；

流动相：由乙腈、0.05mol/L磷酸氢二钠溶液和三乙胺按体积比为45:35:1组成，用磷酸溶液调节pH至3.0；

流速：1.0mL/min

柱温：30℃；

检测波长：230nm。

3)精密称取硝酸咪康唑对照品和葡萄糖酸氯己定对照品各1g，分别用上述溶剂稀释成0.1mg/mL对照品溶液，同以上步骤2)的方法测定，记录色谱图，得到如图2和图3所示的色谱图。

4)按外标法绘制标准曲线，根据图1的色谱图中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的峰面积计算，得到复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量。

从图1～图3中可知，实施例1的检测方法响应值高，出峰快，硝酸咪康唑的保留时间在2.8min左右、葡萄糖酸氯己定的保留时间在4min左右，且峰1、峰2附近无杂质峰干扰，因此表明，在上述设定的色谱条件下，能在较短时间内(5min钟)即可完成对硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的分析测定，在保证被测成分分离度的情况下，实现了快速有效的分析，能够解决复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定含量的测定，且复方香波中的香波基质对样品的含量测定无干扰，有利于控制产品的质量。

实施例2系统适用性验证

色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相由乙腈-0.05mol/L磷酸氢二钠溶液-三乙胺按体积比为45:55:1组成，用磷酸调节pH至3.0；柱温为30℃，流速1.0mL/min，检测波长230nm。按硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的理论塔板数均应大于2000，分离度应大于1.5。

经过实验验证，硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的理论塔板数均大于2000，且分离度大于1.5，表明系统适用性良好。

实施例3专属性试验

将稀释液(甲醇)精密量取10μL注入液相色谱仪，记录图谱，得到空白图谱。

将硝酸咪康唑的对照品加流动相制成每1mL中约含0.1mg硝酸咪康唑的溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，按照实施例1的色谱条件进行，记录色谱图，得到对照品的色谱图(参照图1)，从色图谱中得知硝酸咪康唑的保留时间为2.79min左右。

将葡萄糖酸氯己定对照品加流动相制成每1mL中约含0.1mg葡萄糖酸氯己定的溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，按照实施例1的色谱条件进行，记录色谱图，得到对照品的色谱图(参照图3)，从色谱图中得知葡萄糖酸氯己定的保留时间为4.0min左右。

将复方硝酸咪康唑供试品加流动相制成每1mL中约含0.1mg葡萄糖酸氯己定和0.1mg硝酸咪康唑的溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，按实施例1的色谱条件进行，记录色谱图，得到供试品色谱图(参照图1)；从色谱图中得知硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的保留时间分别为3.0min和3.9min左右；

通过色谱图中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的保留时间，可判断出该发明检测方法的专属性好。

实施例4线性试验

将葡萄糖酸氯己定对照品加流动相分别配置成0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL的溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，按实施例1的色谱条件，记录色谱图，获得葡萄糖酸氯己定的回归曲线图，得到R＝0.9999，说明该检测方法线性好。

将硝酸咪康唑对照品加流动相分别配置成0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL的溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，按实施例1的色谱条件，记录色谱图，获得葡萄糖酸氯己定的回归曲线图，得到R＝0.9998，说明该检测方法线性好。

实施例5准确度试验

按复方硝酸咪康唑香波的处方比例，分别按标示量的80％、100％、120％配置三种不同浓度的样品各100mL，每个浓度测定3份，按照按实施例1含量测定的方法进行回收率试验，计算回收率，分别计算RSD值，结果见下表1。

表1

从上表1中的结果可以看出，该检测方法的准确度高。

实施例6精密度试验

1、精密度——重复性

取复方硝酸咪康唑香波供试品0.5g，用流动相溶剂稀释并定容至100mL的溶液，精密量取10μL，注入高效液相色谱仪，按实施例1的色谱条件进行，重复进样6次，比较峰面积，计算其RSD值，得到硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的RSD值分别为0.04％和0.03％，说明该发明的精密度重现好。

2、精密度——中间精密度

取复方硝酸咪康唑香波供试样品按照实施例1取样量80％、100％、120％，精密称取，每个浓度分别制备3份供试品溶液，按实施例1的检测方法进行测定，计算RSD值，得到硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的RSD值分别为0.05％和0.04％，说明该发明的精密度中间精密度好。

3、精密度——再现性

在不同实验室，由不同的试验人员分别取同一批次复方硝酸咪康唑香波供试品0.5g，用流动相溶剂稀释并定容至100mL的溶液，精密量取10μL，注入高效液相色谱仪，按实施例1的检测方法进行测定，重复进样6次，计算RSD值，得到硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的RSD值分别为0.03％和0.04％，说明该发明的精密度再现性好。

实施例7检测限

称取葡萄糖酸氯己定对照品适量，用流动相溶解，并逐级稀释样品溶液，调节供试品溶液的浓度使葡萄糖酸氯己定峰的响应值约为噪音水平的10倍，记录色谱图，得到实施例1检测方法的检测限为0.015mg/mL。

称取硝酸咪康唑对照品适量，用流动相溶解，并逐级稀释样品溶液，调节供试品溶液的浓度使硝酸咪康唑峰的响应值约为噪音水平的10倍，记录色谱图，得到该发明检测方法的检测限为0.02mg/mL。

实施例8定量限

称取葡萄糖酸氯己定对照品适量，用流动相溶解，并逐级稀释样品溶液，调节供试品溶液的浓度，使葡萄糖酸氯己定峰的响应值约为噪音水平的3倍，记录色谱图，得到实施例1检测方法的定量限为0.018mg/mL。

称取硝酸咪康唑对照品适量，用流动相溶解，并逐级稀释样品溶液，调节供试品溶液的浓度，使硝酸咪康唑峰的响应值约为噪音水平的3倍，记录色谱图，得到该发明检测方法的定量限为0.02mg/mL。

实施例9耐用性试验

1、耐用性——对色谱柱

在实施例1的检测方法下、不改变其他色谱条件下将不同的C18柱对本发明检测方法进行验证；称取硝酸咪康唑、葡萄糖酸氯己定对照品，分别用流动相稀释成含0.1mg/mL硝酸咪康唑和0.1mg/mL葡萄糖酸氯己定的溶液，精密量取10μL，注入高效液相色谱仪中进行检测，重复6次，计算RSD值，得到色谱柱1(ZORBZX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×150mm 5-Micron)的RSD值为0.02％；同法用色谱柱2(Kromasil 100-5-C18 4.6×150mm)进行验证，得到RSD值为0.02％；综上结果，可证明该发明对色谱柱的耐用性好。

2、耐用性——对温度

在本发明实施例1的检测方法、不改变其他色谱条件下将色谱柱的温度分别设置为25℃、30℃、35℃，分别计算RSD值，RSD值均在要求范围内(≤2％)，说明本发明的方法对色谱柱的温度耐用性好。

3、耐用性——对流速

在本发明实施例1的检测方法、不改变其他色谱条件下将洗脱流速设置0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min，分别计算RSD值，RSD值均在要求范围内(≤2％)，说明本发明对流速的耐用性好。

4、耐用性——对流动相中pH

在本发明实施例1的检测方法、不改变其他色谱条件下将流动相中pH调为2.9、3.0、3.1，分别进样并计算RSD值，RSD值均在要求范围内(≤2％)，说明本发明对流动相中pH值的耐用性好。

实施例10

实施例10与实施例1基本相同，不同之处在于：流动相由乙腈、0.05mol/L磷酸氢二钠溶液和三乙胺按体积比为40:60:1组成，用磷酸溶液调节pH至3.0。

实施例10的色图谱显示，葡萄糖酸氯己定的条件响应值高，分离度大，硝酸咪康唑的出峰响应时间为4.8min左右、葡萄糖酸氯己定的出峰响应时间为6.5min左右，能有效测定复方硝酸咪康唑香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量。

实施例11

实施例11与实施例1基本相同，不同之处在于：流动相由乙腈、0.05mol/L磷酸氢二钠溶液和三乙胺按体积比为50:50:1组成，用磷酸溶液调节pH至3.0。

实施例11的色图谱显示(未附图)，葡萄糖酸氯己定的条件响应值高，分离度大，硝酸咪康唑的出峰响应时间为6.5min左右、葡萄糖酸氯己定的出峰响应时间为8.0min左右，能有效测定复方硝酸咪康唑香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量。

对比例1

对比例1与实施例1的待测样品、对照品的处理方法和检测方法基本相同，不同之处在于色谱条件有所不同，具体如下:

对比例1参照中国药典中葡萄糖酸氯己定含漱液中葡萄糖酸氯己定含量测定的方法，采用梯度洗脱方法进行复方硝酸咪康唑香波中葡萄糖酸氯己定含量的HPLC检测。

流动相：取磷酸二氢钠27.6g，加三乙胺10mL，加水1500mL，振摇使磷酸二氢钠完全溶解后，用磷酸调节pH值至3.0，用水稀释至2000mL，得到磷酸二氢钠溶液，按磷酸二氢钠溶液与乙腈的体积比为70:30配制成流动相A，乙腈为流动相B。

检测波长：239nm；柱温为40℃；按梯度洗脱。

所得色谱图中出现双峰，且峰出现拖尾，结果表明，对比例1的检测方法不能准确的测定该复方硝酸咪康唑香波中的葡萄糖酸氯己定和硝酸咪康唑的含量。

对比例2

对比例2参照中国药典中硝酸咪康唑单方制剂中硝酸咪康唑的含量HPLC测定的方法进行，其与实施例1的待测样品、对照品的处理方法和检测方法基本相同，不同之处在于色谱条件中的流动相有所不同，具体如下:

流动相：按体积比为40:40:20，由甲醇、乙腈和1.5％醋酸铵溶液组成。

从检测得到的色谱图可以看出基线非常不稳定，而且在检测过程中容易造成色谱柱和高效液相色谱仪堵塞，对色谱仪和色谱柱损坏较大，因此，表明对比例1的检测方法(即中国药典中记载的硝酸咪康唑HPLC检测方法)不适用于复方香波制剂中的硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量检测。

对比例3

对比例3与实施例1基本相同，不同之处在于：流动相由乙腈、0.05mol/L磷酸氢二钠溶液和三乙胺按体积比为60:40:1组成，用磷酸溶液调节pH至3.0

对比例3所得色谱图显示，葡萄糖酸氯己定和硝酸咪康唑的峰有部分重叠说明该方法不能很好的将葡萄糖酸氯己定和硝酸咪康唑分离，从而无法实现准确有效的测定。

结论：通过上述实施例1～11和对比例1～3的检测结果可以说明，本发明实施例的检测方法，可以同时测定复方香波中硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定的含量，在上述检测条件下，条件响应值高，被测组分能很好地分离，两峰完全分离，且硝酸咪康唑和葡萄糖酸氯己定均出峰快，硝酸咪康唑的保留时间约为3.0min左右、葡萄糖酸氯己定的保留时间为3.9min左右，能明显缩短检测时间，提高检测结果的准确性，增强复方香波的质量可控性；而且经过实验验证，本发明上述方法专属性强、线性好、准确度高、精密度好、耐用性好等优势。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。