克唑替尼在制备抗***药物中的应用

文档序号:1592132 发布日期:2020-01-07 浏览:28次 >En<

阅读说明:本技术 克唑替尼在制备抗***药物中的应用 (Application of crizotinib in preparation of anti-gram-positive-bacteria drugs ) 是由 孙雪松 郑云丹 于 2018-12-28 设计创作,主要内容包括:本发明提供了克唑替尼在制备抗革兰氏阳性细菌药物中的应用,首次提出了抗肿瘤药物克唑替尼可以有效抑制革兰氏阳性细菌,特别是可显著抑制单耐药菌株及临床的多耐药菌株的生长,抗菌谱广,扩展了克唑替尼的应用范围,具有开发成抗细菌药物的潜力。克唑替尼已在世界范围内被多个国家的药品监督管理部门批准上市的药物,其药理安全性更加可靠,无需再进行毒理等实验,开发利用的前景好,本发明对革兰氏阳性细菌感染(特别是耐药菌感染)的治疗具有重要现实意义,为革兰氏阳性菌感染的临床治疗提供一种新的用药选择。(The invention provides the application of crizotinib in preparing the anti-gram-positive bacteria medicament, firstly provides that the anti-tumor medicament, namely the crizotinib, can effectively inhibit gram-positive bacteria, particularly can obviously inhibit the growth of single-drug-resistant strains and clinical multi-drug-resistant strains, has a wide antibacterial spectrum, expands the application range of the crizotinib and has the potential of being developed into the anti-bacterial medicament. The crizotinib is approved by drug supervision and management departments of multiple countries to be marketed as a drug in the world, has more reliable pharmacological safety, does not need experiments such as toxicology and the like, has good development and utilization prospects, has important practical significance for treating gram-positive bacterial infection (particularly drug-resistant bacterial infection), and provides a new drug choice for clinical treatment of the gram-positive bacterial infection.)

克唑替尼在制备抗***药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域,特别涉及克唑替尼在制备抗***药物中的应用。

背景技术

一直以来,致病微生物引起的感染性疾病都是危害人类健康的重要因素。致病细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖,产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染,尤其是老人、儿童、有慢性病或免疫功能低下者、治疗不及时及有并发症者,可发展为败血症或者脓毒血症而死亡。目前临床上常用抗生素来抑制细菌,抗生素也给感染性疾病的治疗带来了巨大的变化,由于抗生素的过度使用和不适当的应用使得耐药菌广泛出现,特别是多重耐药菌和超级耐药菌。耐药菌的感染会增加发病率、死亡率、住院时间和医疗保健成本。以耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)为主的革兰阳性菌的耐药现象已成为全球医疗保健中急需解决的重要问题之一。细菌抗生素耐药性产生的速度远远超过新药物研发的速度。因此找到安全、高效的抑制细菌生长的非抗生素药物刻不容缓。

近年来,“老药新用”作为药物开发策略越来越受到重视,并由此诞生了不少的新适应症药物;在抗细菌感染领域,探究已被普及应用的临床非抗生素药物的抑菌活性为药物研发提供了新思路与新方向。一方面,既可排除细菌耐药性的问题,另一方面,也可在药物的物化、药代和安全性得到一定的保证。

克唑替尼是美国食品药品监督局(FDA)批准的长效抗肺癌药物,是一种抑制Met/ALK/ROS的ATP竞争性的多靶点蛋白激酶的抑制剂,抗肺癌作用强而持久,更适用于病情缓解者的维持治疗,分别在ALK、ROS和MET激酶活性异常的肿瘤患者中证实克唑替尼对人体有显著临床疗效。

但目前为止,并没有克唑替尼抑制细菌研究的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供克唑替尼在制备抗***药物中的应用;不仅可以避免细菌耐药性的问题,也在药物的物化、药代和安全性得到一定的保证。

本发明的目的通过下述技术方案实现:

克唑替尼在制备抗***药物中的应用。

具体的,所述的***包括葡萄球菌、链球菌、粪肠球菌、芽孢杆菌等。

所述的葡萄球菌优选为金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌;所述的链球菌优选为肺炎链球菌、猪链球菌;所述的芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌等。

所述的***包括耐药的***,包括单耐药或多重耐药的***;所述的耐药类型包括耐β-内酰胺类抗生素的***,例如,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐阿莫西林金黄色葡萄球菌;耐氨基糖苷类抗生素的***,例如耐庆大霉素金黄色葡萄球菌、耐阿米卡星金黄色葡萄球菌;耐喹诺酮类抗生素的***,例如耐环丙沙星金黄色葡萄球菌、耐左氧氟沙星金黄色葡萄球菌;耐四环素类抗生素的***,例如耐四环素金黄色葡萄球菌;耐林可霉素类抗生素的***,例如耐克林霉素金黄色葡萄球菌。

所述的克唑替尼对***的最小抑菌浓度(MIC)为12.6~54μg/mL;所述的克唑替尼对耐药的***的最小抑菌浓度(MIC)为14.4~38.3μg/mL。

所述的克唑替尼对耐药的***的最小抑菌浓度(MIC)为14.4~38.3μg/mL,所述的耐药的***包括耐药的金黄色葡萄球菌。

具体的,所述的克唑替尼对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为15.3~31.5μg/mL;所述的克唑替尼对耐克林霉素金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为18~31.5μg/mL;所述的克唑替尼对耐庆大霉素金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为22.5μg/mL;所述的克唑替尼对耐环丙沙星金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为14.4μg/mL。

所述的克唑替尼对肺炎链球菌的最小抑菌浓度(MIC)为12.6μg/mL;所述的克唑替尼对猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)为28.8μg/mL;所述的克唑替尼对枯草芽胞杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为54μg/mL;所述的克唑替尼对溶血葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为27μg/mL;所述的克唑替尼对粪肠球菌的最小抑菌浓度(MIC)为18μg/mL。

所述的抗***药物含有克唑替尼和其药学上可接受的盐中的至少一种。

所述的抗***药物还包含其他起配伍协同或相加作用的有效成分。

所述的起配伍协同或相加作用的有效成分优选为β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、喹诺酮类抗生素、耐四环素类抗生素和林可霉素类抗生素中的至少一种;进一步优选为氨苄西林、庆大霉素、环丙沙星、克林霉素中的至少一种。

所述的抗***药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

所述的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

所述的辅料优选为微晶纤维素和甘油的至少一种,所述的辅料与克唑替尼共同使用时,抑菌效果获得进一步提高。

所述的抗***药物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型,如胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂、注射剂等剂型。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

1.本发明首次提出了抗肿瘤药物克唑替尼可以有效抑制***,抗菌谱广,扩展了克唑替尼的应用范围,具有开发成抗细菌药物的潜力。

2.本发明首次发现了克唑替尼不仅可以有效抑制***,同时能够显著抑制单耐药菌株及临床的多耐药菌株的生长,为临床耐药菌感染的治疗提供了新的解决思路。

3.本发明还发现了克唑替尼与已知抗生素联合用药可实现协同或相加作用;与辅料微晶纤维素或甘油共同作用抑菌效果产生了进一步的提升,提供了更多效果显著的抑菌方案。

4.克唑替尼已在世界范围内被多个国家的药品监督管理部门批准上市的药物,其药理安全性更加可靠,无需再进行毒理等实验,开发利用的前景好,对***(特别是耐药菌感染)的治疗具有重要现实意义,为革兰氏阳性菌感染的临床治疗提供一种新的用药选择。

附图说明

图1克唑替尼对金黄色葡萄球菌耐药菌及敏感菌作用效果比较分析图。

图2是实施例5中辅料对克唑替尼的抑菌结果分析图;其中,A是甘油(Glycerine)作为克唑替尼的辅料时的抑菌结果分析图;B是微晶纤维素(MicrocrystallineCellulose)作为克唑替尼的辅料时的抑菌结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。

1.相关药物及试剂

克唑替尼购于上海蓝木化工有限公司;DMSO购于广州斯佳生物科技公司;胰蛋白胨干粉、酵母提取物、Todd-Hewitt broth、氨苄西林(Ampicillin,Amp)、阿莫西林(Amoxicillin,Amo)、左氧氟沙星(Levofloxacin,Lev)、环丙沙星(Ciprofloxacin,Cip)、克林霉素(Clindamycin,Cli)均购于Sigma;胰蛋白胨大豆肉汤干粉购于广州环凯微生物;甘油(Glycerine,Gly)微晶纤维素(Microcrystalline cellulose,MCC)、氯化钠购于广州化工。

2.相关培养基的配制

(1)TSB液体培养基:胰蛋白胨大豆肉汤干粉30g加入1000mL蒸馏水,121℃灭菌15min,注意无菌操作。

(2)LB液体培养基:胰蛋白胨干粉10g,酵母提取物5g,氯化钠10g(固体培养基则再加入15g琼脂粉)加入1000mL蒸馏水,灭菌30min,注意无菌操作。

(3)THYE液体培养基:酵母提取物干粉5g,Todd-Hewitt broth干粉36.4g加入1000mL水,加入121℃灭菌15min,备用,注意无菌操作。

3.相关仪器

生物安全柜、酶标仪、紫外分光光度计及恒温摇床(Thermo)。

实施例1克唑替尼的抗菌谱研究

本实施例对克唑替尼的抗菌谱情况进行研究。

受试菌株:肺炎链球菌(S.pneumoniae D39)购自中国典型培养物保藏中心;猪链球菌(S.suis BM407)、金黄色葡萄球菌(S.aureus 29213)、MRSA(S.aureus ATCC43300)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;枯草芽胞杆菌(B.subtilis 2508)来自广东省微生物菌种保藏中心;革兰氏阴性菌中的大肠杆菌(E.coli BW25113)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC9027)来自美国模式培养物集存库,模型的最小抑菌浓度(MIC)测定(各个菌株三个单克隆)。

1.实验步骤

肺炎链球菌,按5%的接种量接种到0.5%THYE液体培养基过夜活化,次日再按5%的量转接一次到新鲜培养基培养,当OD600达0.6左右取出,取5μL菌液加入细胞板,同时将10mM克唑替尼母液用无菌水稀释至1mM,分别在细胞培养板中加入以2μM为浓度梯度,工作浓度范围在10~60μM的克唑替尼,随后用0.5%THYE培养基补至500μL进行培养,整个培养过程置于5%CO2,37℃恒温培养箱培养10h。

猪链球菌,按1%的接种量接种到0.5%THYE液体培养基过夜活化;金黄色葡萄球菌及MRSA,按1%的接种量接种到TSB液体培养基过夜活化。次日再按1%的量转接一次到新鲜培养基培养。当OD600到0.6左右,取5μL菌液加入细胞板,同时将10mM克唑替尼母液用无菌水稀释至1mM,分别在细胞培养板中加入以2μM为浓度梯度,工作浓度范围在10~60μM的克唑替尼。随后用培养基补至500μL培养。

枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌分别按1%的接种量接种到新鲜的LB液体培养基过夜活化,次日再按1%的量转接一次到新鲜培养基培养,当OD600到0.6左右,取5μL菌液加入细胞板,同时将10mM克唑替尼母液用无菌水稀释至1mM,分别在细胞培养板中加入以2μM为浓度梯度,工作浓度范围在10~150μM的克唑替尼。随后用LB液体培养基补至500μL进行培养,整个培养过程放置220rpm,37℃恒温摇床培养12h。

再利用酶标仪在波长为600nm的条件下对菌液浓度进行测定,吸光值OD600<0.1的孔,即肉眼未见细菌生长的最低药物浓度则记为MIC,进而得知克唑替尼对多种***的MIC,并用DMSO作为阴性对照。

2.实验结果

克唑替尼对S.pneumoniae D39,S.suisBM407,S.aureus29213,B.subtilis2508,MRSAATCC43300,E.coliBW25113,P.aeruginosaATCC9027菌株的最低抑制浓度(MIC)如表1所示。由表1可知,克唑替尼对多种***感染的抑制作用,可以抑制多种***感染;但克唑替尼对革兰氏阴性菌没有抑制作用。

表1克唑替尼对本实施例的受试菌株的最低抑制浓度(MIC)

Figure BDA0001926258940000061

实施例2克唑替尼对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)测定

本实施例的受试菌株:金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株MRSA(ATCC43300)和金黄色葡萄球菌(29213)的敏感株来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;金黄色葡萄球菌单耐克林霉素菌株(29213-K),金黄色葡萄球菌单耐庆大霉素菌株(29213-G),金黄色葡萄球菌单耐环丙沙星菌株(29213-C),金黄色葡萄球菌单耐阿莫西林(29213-A),金黄色葡萄球菌单耐左氧氟沙星株(29213-L)为由金黄色葡萄球菌(29213)的敏感株驯化得到。

其中,金黄色葡萄球菌单耐克林霉素菌株(29213-K),金黄色葡萄球菌单耐庆大霉素菌株(29213-G),金黄色葡萄球菌单耐环丙沙星菌株(29213-C),金黄色葡萄球菌单耐阿莫西林(29213-A),金黄色葡萄球菌单耐左氧氟沙星株(29213-L)的驯化方式为:

(1)分别测出克林霉素、庆大霉素、环丙沙星对金黄色葡萄球菌(29213)敏感株的最低抑制浓度(MIC);

(2)每次驯化细菌时,在上一代所测定的MIC的基础上,分别取三种药物1/2MIC的药量加入到含有1%上一代驯化的菌的TSB培养基里,若是驯化第一代,则分别取三种药物对金黄色葡萄球菌的敏感菌的1/2MIC的药量加入到含有1%敏感菌的TSB培养基里;

(3)放置在37℃,180rpm的摇床里驯化12小时后测定其MIC,重复步骤(1)~(3),直到三种抗生素对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度为50μg/mL;分别得到金黄色葡萄球菌单耐克林霉素菌株(29213-K),金黄色葡萄球菌单耐庆大霉素菌株(29213-G),金黄色葡萄球菌单耐环丙沙星菌株(29213-C),金黄色葡萄球菌单耐阿莫西林(29213-A),金黄色葡萄球菌单耐左氧氟沙星株(29213-L)。

1.实验步骤

挑取单耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌株MRSA(ATCC43300),单耐克林霉素的金黄色葡萄球菌株(29213-K),单耐庆大霉素的金黄色葡萄球菌株(29213-G),单耐环丙沙星的金黄色葡萄球菌株(29213-C),单耐阿莫西林的金黄色葡萄球菌株(29213-A),单耐左氧氟沙星的金黄色葡萄球菌株(29213-L)的六个单克隆保存液,按1%的接种量接种到TSB液体培养基过夜活化。次日再按1%的量转接一次到新鲜TSB培养基培养。当OD600到0.8左右,取5μL菌液加入细胞板,同时将10mM克唑替尼母液用无菌水稀释至1mM,分别在细胞培养板中加入以2μM为浓度梯度,工作浓度范围在10~60μM的克唑替尼。随后用TSB培养基补至500μL进行培养,整个培养过程置于220rpm,37℃恒温培养箱培养12h,再利用酶标仪在波长为600nm的条件下对培养后的菌液浓度进行测定,吸光值OD600<0.1的孔,即肉眼未见细菌生长的最低药物浓度则记为MIC,进而得知克唑替尼对耐不同抗生素的金黄色葡萄球菌的MIC,并用DMSO作为阴性对照。

2.实验结果

结果如表2所示,克唑替尼可以抑制金黄色葡萄球菌耐药株的生长。其对耐药菌的MIC明显低于敏感菌。结合实施例1和实施例2的研究发现,克唑替尼对金黄色葡萄球菌耐药菌的作用效果显著优于金黄色葡萄球菌的敏感菌,其结果详见图1。

表2克唑替尼对金黄色葡萄球菌耐药株的最小抑菌浓度(MIC)

Figure BDA0001926258940000071

实施例3克唑替尼对临床分离的多耐药的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、溶血葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)测定

本实施例的受试菌株为临床分离的多耐药的金黄色葡萄球菌(168272,168023,166471,166534,166138,168293,900624,168205,179634,179148,179475,179459,178425,178524,178360),粪肠球菌(179521),溶血葡萄球菌(179595),来自南方医科大学检验科,上述编号为相应菌株在南方医科大学检验科的系统编号,相关菌株的耐药情况如表3所示。

表3相关菌株的耐药情况(MIC单位:μg/mL)

Figure BDA0001926258940000081

Figure BDA0001926258940000091

1.实验步骤

挑取临床分离的多耐药的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、溶血葡萄球菌活化液,按1%的接种量接种到TSB液体培养基过夜活化。次日再按1%的量转接一次到新鲜TSB培养基培养。当OD600到0.8左右,取5μL菌液加入细胞板,同时将10mM克唑替尼母液用无菌水稀释至1mM,分别在细胞培养板中加入以2μM为浓度梯度,工作浓度范围在10~60μM的克唑替尼。随后用TSB培养基补至500μL进行培养,整个培养过程置于220rpm,37℃恒温培养箱进行培养12h,再利用酶标仪在波长为600nm的条件下对培养后的菌液浓度进行测定,吸光值OD600<0.1的孔,即肉眼未见细菌生长的最低药物浓度则记为MIC,进而得知克唑替尼对耐多种抗生素的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、溶血葡萄球菌活化液的MIC,并用DMSO作为阴性对照。

2.实验结果

结果如表4所示,克唑替尼对***的临床耐药菌具有抑制作用,可以抑制***的临床耐药菌的生长。

表4克唑替尼对***的临床耐药菌的最小抑菌浓度(MIC)

Figure BDA0001926258940000101

实施例4克唑替尼与已知抗生素联合用药

本实施例分别选择了四种不同的抗生素分别与克唑替尼联合用药,分别是β-内酰胺类抗生素氨苄西林(Ampicillin,Amp)、氨基糖苷类抗生素庆大霉素(Gentamicin,Gen)、喹诺酮类抗生素环丙沙星(Ciprofloxacin,Cip)、林可霉素类抗生素克林霉素(Clindamycin)。首先分别检测了四种抗生素对金黄色葡萄球菌(29213)敏感株的MIC,测定MIC的方法方式同实施例1中MIC的测定方式,其结果见表5。在利用四种不同类型的抗生素分别与克唑替尼联合用药,即各个抗生素的1/2MIC的浓度与1/2MIC的克唑替尼联合、各个抗生素的1/2MIC的浓度与1/4MIC的克唑替尼联合、各个抗生素的1/4MIC的浓度与1/2MIC的克唑替尼联合、各个抗生素的1/4MIC的浓度与1/5MIC的克唑替尼联合、各个抗生素的1/5MIC的浓度与1/4MIC的克唑替尼联合,其实验方法与实施例1中MIC的测定方式相同。最终通过计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration,FIC)判断相互作用。FIC=联合用药时甲药MIC/单独应用甲药时MIC+联合用药时乙药MIC/单独应用乙药时MIC,FIC指数为≤0.5、>0.5~1、>1~2、>2时分别表示协同、相加、无关、拮抗作用。

实验结果:四种抗生素对金黄色葡萄球菌敏感菌的MIC如表5所示。克唑替尼与氨苄西林、庆大霉素、克林霉素有协同作用,而与环丙沙星有相加作用如表6所示,为临床治疗细菌感染,多重耐药感染及重症感染的提供了又一新思路。

表5四种抗生素分别对金黄色葡萄球菌的MIC

Figure BDA0001926258940000111

表6四种抗生素分别与克唑替尼联合应用

Figure BDA0001926258940000112

实施例5克唑替尼与其辅料共同作用抑菌

在实施例中利用3mg/mL的微晶纤维素(MCC)及15%的甘油(Glycerine)作为克唑替尼的辅料,研究克唑替尼与其辅料共同作用抑菌效果。

1.实验步骤

取保存于15%甘油的金黄色葡萄球菌(29213)敏感株,按1%的接种量接种到TSB液体培养基过夜活化。次日再按1%的量转接一次到新鲜TSB培养基培养。当OD600到0.8左右,取5μL菌液加入细胞板,同时在细胞板里加入在最终体积为500μL的体系里分别加入工作浓度9.9μg/mL的克唑替尼和工作浓度为3mg/mL的微晶纤维素、及工作浓度9.9μg/mL的克唑替尼和工作浓度为15%的甘油,然后利用TSB液体培养基把总体积补至500μL,最后在37℃,180rpm的恒温培养箱培养12h,再利用酶标仪在波长为600nm的条件下对培养后的菌液浓度进行测定,吸光值OD600<0.1的孔,即肉眼未见细菌生长的最低药物浓度则记为MIC,进而得知克唑替尼和辅料作用下对金黄色葡萄球菌(29213)敏感株的MIC;以不加辅料的组作为阴性对照。

2.实验结果

如图2所示,甘油和微晶纤维素作为辅料使用时,都能够增加克挫替尼的抑菌效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

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