阅读说明：本技术 一种九制黄精的质量检测方法 (Quality detection method of nine-process sealwort ) 是由 胡昌江 陈志敏 胡麟 于 2018-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了九制黄精的单糖检测方法,它包括如下操作步骤：1)对照品溶液制备；2)供试品溶液制备；3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪,检测。本发明还提供了九制黄精的质量检测方法。本发明九制黄精的单糖检测方法可以准确检测其单糖含量,在九制黄精质量检测方法增加单糖检测使得质量检测体系更加完善,应用前景良好。(The invention provides a monosaccharide detection method of nine-process sealwort, which comprises the following operation steps: 1) preparing a reference substance solution; 2) preparing a test solution; 3) respectively sucking the reference solution and the sample solution, injecting into a high performance liquid chromatograph, and detecting. The invention also provides a quality detection method of the nine-process sealwort. The monosaccharide detection method for the Jiuzhi sealwort can accurately detect the monosaccharide content of the Jiuzhi sealwort, and the monosaccharide detection is added in the quality detection method for the Jiuzhi sealwort, so that the quality detection system is more perfect, and the application prospect is good.)

一种九制黄精的质量检测方法

技术领域

本发明具体涉及一种九制黄精的质量检测方法。

背景技术

黄精为百合科黄精属植物，始载于《名医别录》，其来源为滇黄精Polygonatumkingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatumcyrtonema Hua的干燥根茎。多为本草生植物，按形状不同，***。归脾、肺、肾经。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾。用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴，是中医常用滋补强壮药。研究发现黄精尚具有降血压、降血糖、降血脂、抗肿瘤。唐朝诗圣杜甫描述黄精“扫除白发黄精在，君看他年冰雪容”，充分说明了服食黄精可令人皮肤光滑、肤色红润、须发黑亮，有延年益寿、葆精养颜之功效。在前期工作，我们已对九制黄精进行了工艺优化，并申请了专利保护。

但是九制黄精的质量标准研究尚不完善，无法全面地控制九制黄精质量，需要进一步改善。

发明内容

本发明结合九制黄精蒸制过程中成分变化特性，新加入单糖作为质控标准之一，建立更加符合九制黄精的质量标准体系。

首先，本发明提供了一种九制黄精的单糖检测方法，它包括如下操作步骤：

1)对照品溶液制备：取D-葡萄糖为对照品，溶解，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生，即得对照品溶液；

2)供试品溶液制备：取待检九制黄精药材，提取，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生，即得供试品溶液；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，检测，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250nm；流动相：0.02mol·L^-1乙酸铵溶液与乙腈的混合溶液。

步骤1)所述溶解是加入水溶解。

步骤1)和步骤2)所述的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生的步骤如下：

取待衍生溶液，加入氢氧化钠溶液，再加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，混匀，避光反应，加入盐酸溶液中和，加三氯甲烷，混匀，离心，去除三氯甲烷层，得水层。

优选地，每100μL待衍生溶液中，加入100μL氢氧化钠溶液、100μL1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液、100μL盐酸溶液、1mL三氯甲烷；所述氢氧化钠溶液的浓度为0.6mol·L^-1，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.5mol·L^-1，所述盐酸溶液的浓度为0.3mol·L^-1。

步骤2)所述提取方法为：取九制黄精药材，水提取。优选地，取九制黄精药材，加入药材50w/v(g/ml)倍的水，超声提取，放冷，用水补足减失的质量，滤过，取续滤液。

步骤3)中，所用色谱柱为Welch

XB。

步骤3)中，所述柱温为30℃；和/或，流速为1mL·min^-1。

本发明还提供了一种九制黄精的质量检测方法，它包括：

(1)浸出物测定；

(2)多糖含量测定；

(3)水分测定；

(4)总灰分测定；

(5)按照前述方法进行单糖测定。

本发明还提供了一种九制黄精的制备方法，步骤如下：取切制好的黄精饮片，加黑豆汁闷润3h，105℃下蒸1h，70℃干燥5h，如此反复9次。

本发明结合九制黄精蒸制过程中成分变化特性，提供了九制黄精单糖的检测方法，并将单糖作为九制黄精的质控标准之一，建立更加符合九制黄精的质量标准体系，同时提供了一种新的九制黄精制备方法，该方法制备的九制黄精可以兼顾、单糖、多糖等指标，品质优良。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1系统适用性试验结果图。

图2不同流动相考察，上：乙腈-水；下：乙腈-乙酸铵。

具体实施方式

实施例1本发明九制黄精的质量检测方法

1仪器与材料

Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司)；UV-1100紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；BP211D电子天平(感量0.01mg)、BS200S电子天平(感量0.001g)，德国Sartorius公司；DSX-280B型手提式压力蒸气灭菌锅，上海申安医疗器械厂。

黄精药材购于荷花池药材市场，经成都中医药大学胡昌江教授鉴定为黄精正品，其他检查均符合药典规定，水分11.8％，不超过18％；总灰分3.5％，不超过4.0％；醇溶性浸出物76％，不少于45％；多糖含量测定结果10.9％，不少于7％。黑豆购于温江菜市场，经成都中医药大学胡昌江教授鉴定为豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的干燥成熟种子。黄精(制)对照药材(批号：121553-201202)，D-无水葡萄糖(批号：110833-201506)，购于中国食品药品检定研究院。

2方法与结果

2.1九制黄精样品制备

取黄精片加20％的黑豆熬汁分成9等分，第一次用水稀释至规定用量后，拌匀，润制，105℃下蒸1h，取出，80℃干燥12h，把第二等分黑豆汁以甑脚水稀释后拌入，混匀，润制，再蒸再晒，如此反复九次即得九制黄精(最后一次甑脚水为烘制单次规定时间后拌入，再烘干)。将九制黄精中试样品粉碎，备用。

2.2性状鉴别

肥厚、肉质的不规则厚片。表面滋润黑褐色，具光泽，中心棕色至浅褐色，可见筋脉小点。质较柔软。味甜，嚼之有黏性。

2.3薄层色谱鉴别

2.3.1方法考察

根据《中国药典》和《四川省中药饮片炮制规范》薄层鉴别，药典方法适用于黄精及其饮片鉴别，故直接选用药典方法进行验证。

供试品溶液的制备

取本品粉末1g，加70％乙醇20mL，加热回流1小时，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

层析条件

薄层板：硅胶G板。点样量：对照药材溶液10ul；供试品溶液10ul。

展开系：石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5：2：0.1)为展开剂

展开方式：展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

由上述结果可知，药典方法适用于九制黄精的鉴别。故沿用药典方法进行薄层鉴别。2.3.2耐用性验证

由2.3.1可知，药典方法能够较好的对黄精及其炮制品进行薄层鉴别，故选用药典方法进行耐用性考察。

(1)不同薄层板

(2)不同温度考察：进行了高温(40℃)和低温(4℃)的考察。

(3)不同湿度的考察：进行了不同湿度的比较，分别在32％和88％的湿度环境下进行展开考察，在实验结果的基础上确定TLC法的湿度耐受性。

2.4水分测定

取10-20目之间黄精样品按《中国药典》2015年版通则0832第四法测定。

表1水分测定结果

2.5总灰分的测定

按《中国药典》2015年版通则2302测定：取黄精样品，粉碎，使能通过二号筛，混合均匀后，取供试品2～3g(如须测定酸不溶性灰分，可取供试品3～5g)，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量(准确至0.01g)，缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量(％)。

表2总灰分测定结果

2.6浸出物的测定

前期对比了水溶剂和醇溶剂的浸出物考察，发现水提取九制黄精基本难以过滤。故按《中国药典》2015年版通则2201测定：取黄精样品，粉碎，使能通过二号筛，并混合均匀，用稀乙醇作溶剂照醇溶性浸出物测定法(2201)项下的热浸法测定。结果见表3

表3浸出物测定结果

2.7多糖含量测定

(1)对照品溶液的制备

取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品39.79mg，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1mL中含无水葡萄糖0.3979mg)。

(2)标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL，分别置10mL具塞刻度试管中，各加水至2.0mL，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2％蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10分钟，取出，立即置冰水浴中冷却10分钟，取出，以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在582nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

表4葡萄糖对照品溶液不同浓度的吸光度

(3)供试液制备方法

取60℃干燥至恒重的样品细粉约0.25g，精密称定，置圆底烧瓶中，加80％乙醇150mL，置水浴中加热回流1h，趁热滤过，残渣用80％热乙醇洗涤3次，每次10mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150mL，置沸水浴中加热回流1h，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10mL，合并滤液与洗液，放冷，转移至250mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。

(4)测定

精密量取1mL，置10mL具塞干燥试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至2.0mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量(mg)，计算，即得。

表5多糖测定结果

(5)精密度试验

取(1)对照品溶液1.0mL加水稀释至5ml，再精密量取稀释液1.0mL，于582nm波长处扫描，连续重复测定吸光度6次。结果的RSD＝1.58％，表明仪器精密度良好。

表6精密度试验结果

(6)稳定性试验

取同一供试品溶液(20170309)，分别在放置0，20，40，60，80，100，120min后测定吸光度。结果RSD＝1.95％，表明供试品溶液在2.0h内稳定。

表7精密度试验结果

(7)重复性试验

取同一批样品(20170309)，按供试品溶液项下制备6份平行样品。结果RSD＝1.90％，表明方法重复性良好。

表8重复性试验结果

(8)加样回收试验

取6份已知含量的同一批(批号20170309)样品0.125g，分别精密加入已知浓度葡萄糖对照品溶液，依法测定。计算回收率，结果见表

表9回收率试验结果

2.8单糖含量

(1)色谱条件

色谱柱：Welch

XB(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：0.02mol·L^-1乙酸铵溶液-乙腈(78∶22)，检测波长250nm，柱温30℃，流速1mL·min^-1。

(2)对照品溶液的制备

取D-葡萄糖对照品适量，精密称定，加水配制成葡萄糖糖对照品溶液(质量浓度约为19.15mg·mL^-1)。利用PMP衍生化方法进行柱前衍生(精密吸取对照品溶液100μL置5mL的安瓶中，精密加入0.6mol·L^-1氢氧化钠溶液100μL，摇匀，精密加入0.5mol·L^-1的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液100μL，漩涡混匀，在70℃条件下烘箱中避光反应60min。取出避光放置，冷却至室温，精密加入0.3mol·L^-1盐酸溶液100μL中和。混匀后转移至5mL离心管中。加三氯甲烷1mL，涡旋混匀，离心(3000r·min^-1)10min，小心弃去三氯甲烷层，重复多次至三氯甲烷层无色，水层为对照品溶液。

(3)供试品溶液制备

取九制黄精粉末1g，精密称定，加入50mL水，称重，超声提取40min，放冷，补足失重，滤过。精密吸取滤液100μL置5mL的安瓶中，精密加入0.6mol·L^-1氢氧化钠溶液100μL，摇匀，精密加入0.5mol·L^-1的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液100μL，漩涡混匀，在70℃条件下烘箱中避光反应60min。取出避光放置，冷却至室温，精密加入0.3mol·L^-1盐酸溶液100μL中和。混匀后转移至5mL离心管中。加三氯甲烷1mL，涡旋混匀，离心(3000r·min^-1)10min，小心弃去三氯甲烷层，重复多次至三氯甲烷层无色，水层为供试品溶液。

(4)系统适用性试验

取对照品溶液，进样测定，记录色谱，详见图1。结果表明，理论板数以葡萄糖峰计为6498；分离度4.03，各成分基线分离良好。

(5)线性关系的考察

精密吸取对照品溶液，进样10μL，测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量为横坐标(X)，色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程。y＝2037.3x-428.42，R²＝0.9999。

(6)精密度试验

取已经制备好的供试品溶液。连续进样6次试验完成后，记录各个成分的峰面积，最后再计算葡萄糖峰面积的RSD。RSD为0.76％，表明仪器精密度良好。

表10精密度实验结果

(7)稳定性试验

取同一批(批号20170403)的供试品溶液，分别于制备后的0、1、2、4、8、12h进行进样测定，结果RSD为1.81％。表明供试品溶液在12h内稳定。

表11稳定性实验结果

(8)重复性试验

取同一批(批号20170309)样品6份，按单糖供试品溶液项下方法制备供试品溶液，按色谱条件分别进样测定。结果RSD为1.49％，表明本方法重复性良好。

表12重复性实验结果

(9)加样回收率试验

取6份已知含量的同一批(批号20170520)样品0.5g，分别精密加入已知浓度葡萄糖对照品溶液(质量浓度约为39.05mg·mL^-1)1ml，按照单糖供试品制备项下制备相应供试品溶液，检测，然后分别计算各个成分的加样回收率。试验结果表明，本方法具有良好的回收率。

表13回收率试验结果

(10)不同仪器影响

实验考察了2个实验室高效液相对单糖出峰的影响，结果表明对色谱峰的保留时间有一定的影响，但色谱图的分离度分别是3.43和2.87，分离度较好。

(11)不同流动相考察

实验考察了乙腈-水和乙腈-乙酸铵为流动相进行试验，分别得到色谱图，见图2，经分析可知乙腈-乙酸铵作为流动相时色谱峰的分离度较好，保留时间较合理，故选择乙腈-乙酸铵为流动相。

(12)色谱柱影响

选用Welch

XB(4.6mm×250mm，5μm)和Therm C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)分别记录供试品溶液的色谱图。结果表明两种色谱柱分离度分别为3.20和3.36，分离度较好，且保留时间较合理。

(13)柱温影响

分别在25℃、30℃和35℃条件下分析比较供试品溶液的色谱图。结果表明，柱温对色谱峰的保留时间有一定的影响，但三种柱温条件下色谱图的峰形和分离度分别为4.72、3.43和1.71，均较好，峰形以30℃较优，本实验选用30℃作为供试品溶液的检测柱温。

(14)流速影响

分别比较了0.8、1.0和1.2mL/min流速对供试品溶液的色谱图的影响。结果表明，流速对色谱峰的保留时间影响明显，但三种流速条件下色谱图的峰形和分离度分别为3.40、3.68和4.43，均较好。

(15)含量的测定

取九制黄精样品，按单糖检测项下方法制备供试品溶液和色谱条件测定，记录葡萄糖的峰面积，按外标法计算其质量分数。

实施例2九制黄精炮制工艺研究

九制黄精作为川帮重要的炮制品，具有巨大的药用及保健价值，但由于其操作工艺复杂且缺乏明确的工艺参数，限制了工业大生产，导致市场九制黄精几近失传。现四川省炮制规范所载制黄精仅蒸制数小时，与传统黄精相去甚远。因此，有必要对九制黄精的炮制工艺进行研究，使古人的炮制工艺得到更好的传承与发展。

(一)切制工艺考察

1仪器、试药

1.1仪器

1.2试剂与试药

D-无水葡萄糖(批号：110833-201506)，中国食品药品检定研究院。95％乙醇、正丁醇、甲醇、硫酸、蒽酮，均购于成都科龙化工试剂厂。

黄精药材购于荷花池药材市场，经成都中医药大学胡昌江教授鉴定为滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.的干燥根茎，其他检查均符合药典规定，水分11.8％，不超过18％；总灰分3.5％，不超过4.0％；醇溶性浸出物76％，不少于45％；多糖含量测定结果10.9％，不少于7％。因此，药材质量合格，可用于炮制工艺和药效学的研究。黑购于温江菜市场，经成都中医药大学胡昌江教授鉴定为豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的干燥成熟种子。

2方法与结果

根据多糖含量、醇溶性浸出物含量、单糖含量、外观和口感筛选蒸制工艺，最终筛选到在如下工艺条件下，多糖含量、醇溶性浸出物含量、单糖含量、外观和口感的综合评分最高：

取切制好的黄精饮片(黑豆用量为黄精用量的20％熬汁：按《中国药典》2015版九制黄精制备方法中的方法进行黑豆汁的制备)闷润3h，105℃下蒸1h，70℃干燥5h，如此反复9次(最后一次烘制时，当烘制七八成干时拌入甑脚水再进行烘干即可)。

实验结果说明，本发明以多糖含量、醇溶性浸出物含量、单糖含量、外观和口感为综合指标，得到了一种新的九制黄精炮制方法。

综上，本发明结合九制黄精蒸制过程中成分变化特性，提供了九制黄精单糖的检测方法，并将单糖作为九制黄精的质控标准之一，建立更加符合九制黄精的质量标准体系，同时提供了一种新的九制黄精制备方法，该方法制备的九制黄精可以兼顾、单糖、多糖等指标，品质优良。