阅读说明：本技术 阿法替尼在抗结核分枝杆菌药物中的应用 (Application of afatinib in anti-mycobacterium tuberculosis drugs ) 是由 杨倩婷 张明霞 邓国防 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及阿法替尼在抗结核分枝杆菌药物中的应用。在临床上阿法替尼主要用于治疗恶性淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病；而本发明研究发现其具有抗结核的作用,具有很好的开发价值；本发明涉及的阿法替尼在抗结核分枝杆菌药物中的应用以及阿法替尼具有明显的抗结核分枝杆菌的作用属于首次公开。(The invention relates to application of afatinib in an anti-mycobacterium tuberculosis drug. In clinic, afatinib is mainly used for treating malignant lymphoma and acute lymphocytic leukemia; the research of the invention finds that the compound has the anti-tuberculosis effect and has good development value; the application of afatinib in the anti-mycobacterium tuberculosis medicine and the obvious anti-mycobacterium tuberculosis effect of afatinib are disclosed for the first time.)

阿法替尼在抗结核分枝杆菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及阿法替尼在抗结核分枝杆菌药物中的应用。

背景技术

在结核病治疗方面，面临的挑战主要有：1)耐多药结核(MDR-TB)的治愈成功率极低；2)现有的抗结核标准短程治疗方案，治疗时间仍然太长；加上毒副作用等原因，导致患者依从性和治疗不足，初治敏感结核病的复发率高达3％-9％。由于上述原因，使这一古老的传染病再次面临无药可用的严峻挑战。现在所用的一线抗结核药物均为40多年前所研发，新型有效的抗结核药物研发缓慢，而且这些药物都是直接作用于结核菌本身，始终存在着交叉耐药的风险。

阿法替尼是一种二苯甲酸盐形式的4-苯胺基喹唑啉酪氨酸激酶抑制剂，阿法替尼片剂是转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的一线(初始)治疗药物，具有常见的表皮生长因子受体(EGFR)突变，Afatinib是一种有效且具有选择性，不可逆转的ErbB家族阻断剂；阿法替尼共价结合并且不可逆地阻断由ErbB家族成员EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2)，ErbB3和ErbB4形成的所有同源二聚体和异二聚体的信号传导，阿法替尼共价结合EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2)和HER4(ErbB4)的激酶结构域，并且不可逆地抑制酪氨酸激酶自身磷酸化，导致ErbB信号传导的下调。EGFR中的某些突变，包括其激酶结构域中的非抗性突变，导致受体的自身磷酸化增加，导致受体活化，在没有配体结合的情况下也可以支持NSCLC中的细胞增殖。非抗性突变定义为发生在构成EGFR激酶结构域的外显子中，其导致受体活化增加，并且其中通过临床上有意义的肿瘤收缩与推荐剂量的阿法替尼和/或抑制细胞增殖来预测功效；这些突变中最常见的是外显子21 L858R取代和外显子19缺失。

阿法替尼分子式为C₂₄H₂₅ClFN₅O₃，分子量为485.94，其结构式如下：

本研究发现此药具有抗结核的作用，具有很好的开发价值。

发明内容

本发明的目的是研发高效的抗结核新药，发现了阿法替尼的抗结核作用以及在抗结核分枝杆菌药物中的应用，安全性高，具有很好的开发价值。

本发明的技术方案主要为阿法替尼在抗结核分枝杆菌药物中的应用。

进一步地，结核分枝杆菌具体为结核分枝杆菌H₃₇Rv。

本发明还提供了阿法替尼在制备抗结核药物中的应用。

在本发明的一个实施例方案中，提供了一种有效成分为阿法替尼的抗结核药物。这种抗结核药物能够应用于治疗结核病。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次发现了阿法替尼具有明显的抗结核分枝杆菌的作用，作为潜在的靶向HDT的药物，已经被FDA批准，安全性高，具有很好的开发价值；

(2)本发明首次提出了阿法替尼在制备抗结核药物中的应用；

(3)本发明发现了阿法替尼在细胞中可以显著增强细胞杀伤结核菌。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同浓度阿法替尼对细胞的存活率的影响；

图2为本发明实施例2中阿法替尼对细胞中结核分枝杆菌存活率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所有原料均为通用材料。

实施例1

1.U937巨噬细胞(编号BNCC100967)的分化：将悬浮的U937培养于含有10％FBS的RPMI-1640培养基中，并放置于温度37℃，含有5％CO₂的细胞培养箱中培养，加入终浓度为20ng/ml的PMA，培养过夜，将其分化成巨噬细胞，用PBS清洗两遍，利用胰酶消化、重悬后，加入96孔细胞培养板中，使每孔的细胞数为1x104个；

2.细胞存活率的测定：将上述U937巨噬细胞培养24h后，加入不同浓度的药物，使药物终浓度为100uM、10uM、1uM，每个浓度分别重复3次，利用DMSO作为平行对照实验，对照组中加入与药物体积相同的DMSO，分别重复3次实验，在48h后每孔加入10ul WST-1溶液，在温度为37℃的条件下继续培养4h，利用酶标仪测定OD450 nm吸光值；

细胞存活率按照以下公式计算：细胞存活率％＝[A/A₀]×100，其中A₀为DMSO对照的吸光值，A为不同浓度药物处理的吸光值。

图1表示不同浓度阿法替尼对细胞的存活率的影响；其中，“**”代表具有显著性差异，“ns”代表没有统计学差异。

实验结果显示，阿法替尼浓度为100uM、10uM、1uM，对应的细胞存活率分别为：40％、95％、103％；当药物浓度为10uM时，细胞存活率与对照组相比没有统计学差异。

实施例2：

1.U937巨噬细胞的分化：将悬浮的U937培养于含10％FBS的RPMI-1640中，并放置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，加入终浓度为20ng/ml的PMA，培养过夜，将其分化成巨噬细胞，用PBS洗两遍，利用胰酶消化、重悬后，加入96孔细胞培养板中，使每孔的细胞数为1x104个；

2.细胞内杀菌活性测定：将上述U937巨噬细胞培养24h后，加入阿法替尼使其终浓度为1uM，每个浓度分别重复3次实验，利用DMSO作为平行对照实验，对照组中加入与药物体积相同的DMSO，分别重复3次实验，在4h后吸去培养基，，用PBS洗两遍，加入新鲜培养基72h后加入裂解液，梯度稀释后涂布于7H10平板上，3周后计算菌落；

结果如附图2所示，利用1uM阿法替尼处理细胞，其对细胞中结核菌的存活率相对于对照组只有2.72％，而且在这个浓度下没有明显的细胞毒性，可用于开发高效、低毒的抗结核药物。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求限定的范围中。