阅读说明：本技术 整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法 (Method for detecting non-destructive measurement information and genome-related information of single cells in integrity ) 是由 谷内江望 太田祯生 于 2018-05-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法。更具体而言,本发明使用包括下述工序的方法：准备多个隔室,每1个隔室包含单个细胞或来源于其的物质、第一微珠、和第二微珠；在准备各隔室前或在各隔室中,对单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行检测,将单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息进行关联；得到杂交复合物；制造来源于该杂交复合物的扩增产物；整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。(The present invention provides methods for the integrity of non-destructive measurements and genomic related information from individual cells. More specifically, the present invention uses a method comprising the following steps: preparing a plurality of compartments, each 1 compartment comprising a single cell or a substance derived therefrom, a first microbead, and a second microbead; before preparing each compartment or in each compartment, detecting the nondestructive measurement information of the single cell and the imaging information of the first microbead together, and correlating the nondestructive measurement information of the single cell and the imaging information of the first microbead; obtaining a hybrid compound; producing an amplification product derived from the hybridization complex; integrity testing individual cells for non-destructive measurement information and genome-related information.)

整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息 的方法

相关申请参考

本专利申请主张基于2017年5月2日提出申请的日本专利申请2017-091961号的优先权，该在先专利申请的全部公开内容通过引用而成为本说明书的一部分。

技术领域

本发明涉及整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法。

背景技术

细胞是构成生物的最小单位。以往，仅针对细胞群尝试阐明生物的功能、结构、形态等。然而，最近的研究中发现，在癌组织等的类似的细胞类型中，每个细胞的基因表达也各不相同，是多样的，产生了对每一个细胞的基因表达等进行阐明的需要。

因此，当前，作为检测来源于一个细胞的转录产物的方法，下述方法是已知的：使用结合有包含条形码(barcode)序列的寡核苷酸的微珠，利用测序技术得到细胞的遗传信息的数据。(专利文献1、非专利文献1)

另一方面，为了确定细胞的形态学信息而使用以显微镜为代表的成像技术是已知的。通过利用显微镜或成像细胞仪等成像技术，可得到每一个细胞的非破坏性测量信息。

然而，利用上述的成像技术和测序技术测得的细胞的数据仅能够通过选择性且物理性的细胞分选来进行关联。例如，为了得到成像的细胞的基因组的信息，需要针对各个细胞独立实施物理性地捕捉单个细胞并进行区室化、使细胞溶解并扩增核酸的工艺。这样的方法通量低且成本高。因此，难以将单个细胞的非破坏性测量信息与遗传信息相关联。

此外，目前，通过目视对利用成像技术拍摄的细胞形态信息进行评价。即使今后利用机器学习技术推进判别，也仍然需要对该判别的妥当性进行评价。在当前的情况下，只能对通过目视等观察到的单个细胞进行物理分选，实施与基因、其他诊断技术之间的比较。

在这样的技术背景之下，为了促进对单个细胞的非破坏性测量信息与基因组相关信息的相互利用、及提高各信息间的价值，可以说需求整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的手段。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide ExpressionProfiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)

专利文献

专利文献1:WO2015/166768

发明内容

本发明的目的在于整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。

本申请的发明人此次发现，若使1个隔室(compartment)中与单个细胞或来源于其的物质一同包含与条形码核酸连接的多个微珠，在将单个细胞的非破坏性测量信息及微珠的成像信息相关联的基础上测定基因组相关信息并进行关联，则能够整体性且高效地检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。另外，单个细胞的非破坏性测量信息与微珠的成像信息之间的关联也可在被包含于隔室前的单个细胞与所述微珠之间进行。本发明是基于上述见解完成的。

本发明包括以下的发明。

(1)整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法，所述方法包括下述工序：

准备多个隔室，每1个隔室包含单个细胞或来源于其的物质、第一微珠、和第二微珠，

其中，第一微珠是各自以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，

并且，各隔室中的第一微珠的成像信息可彼此区分，

所述第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交；

在准备各隔室前或在各隔室中，对单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行检测，将单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息进行关联；

自所述关联的第一微珠切割第一条形码核酸，使所述基因组相关核酸及第一条形码核酸分别与第二条形码核酸杂交而得到杂交复合物；

制造来源于所述杂交复合物的扩增产物；

以所述扩增产物的表达模式作为指标，整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。

(2)如(1)所述的方法，其中，所述多个隔室是通过对细胞群或来源于其的物质、多个第一微珠、及多个第二微珠进行分配处理而得到的。

(3)如(1)或(2)所述的方法，其中，以来源于第一条形码核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第一扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的非破坏性测量信息，

以来源于所述基因组相关核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第二扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的基因组相关信息。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，每1个隔室的第一微珠的数量为多个。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，每1个隔室的第二微珠的数量为1个。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，所述隔室为孔、液滴或凝胶粒子的形态。

(7)如(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，所述基因组相关核酸为所述单个细胞基因组DNA、来源于所述单个细胞基因组的RNA或其cDNA、或者对在所述单个细胞中表达的蛋白质具有特异性的核酸探针。

(8)如(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，所述非破坏性测量信息为基于选自颜色、荧光、大小、形状、电磁波、透过、相位、散射、反射、相干拉曼、拉曼及吸收光谱中的至少1种测定信息的非破坏性测量信息。

(9)如(1)～(8)中任一项所述的方法，其中，第一微珠的第一条形码核酸各自包含在与相同的成像信息对应的第一微珠中共通的第一共通条形码区、和能与第二条形码核酸杂交的第一杂交区。

(10)如(1)～(9)中任一项所述的方法，其中，第一共通条形码区的序列信息为确定单个细胞的非破坏性测量信息的指标。

(11)如(1)～(10)中任一项所述的方法，其中，与所述第二微珠连接的多条第二条形码核酸各自包含彼此共通的第二共通条形码区、可彼此区分的第二固有条形码区、和能与基因组相关核酸或第一条形码核酸杂交的第二杂交区。

(12)如(11)所述的方法，其中，所述第二共通条形码区的序列信息为确定存在于隔室中的单个细胞或来源于其的物质的指标。

(13)如(11)或(12)所述的方法，其中，所述第二固有条形码区的序列信息为确定基因组相关核酸的指标。

(14)如(1)～(13)中任一项所述的方法，其中，第二条形码核酸还包含PCR引物区。

(15)如(14)所述的方法，其中，第二条形码核酸是自第二微珠侧起依次包含PCR引物区、第二共通条形码区、第二固有条形码区及第二杂交区而成的。

(16)如(11)～(15)中任一项所述的方法，其中，第二杂交区是包含与所述第一杂交区或所述基因组相关核酸互补的核酸而成的。

(17)如(1)～(16)中任一项所述的方法，其中，第一条形码核酸及第二条形码核酸为RNA、DNA或它们的组合。

(18)如(1)～(17)中任一项所述的方法，其中，非破坏性测量信息的测定利用流式细胞仪或显微镜进行。

(19)如(1)～(18)中任一项所述的方法，其中，所述非破坏性测量信息为成像信息。

(20)如(1)～(18)中任一项所述的方法，其中，所述非破坏性测量信息为细胞的形态信息。

(21)整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的系统，其包含：

隔室准备部，其准备多个隔室，每1个隔室包含单个细胞或来源于其的物质、第一微珠、和第二微珠，其中，

第一微珠是各自以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，

并且，各隔室中的第一微珠的成像信息可彼此区分，

所述第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交；

非破坏性测量信息测定部，其对准备各隔室前或各隔室中的、单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行测定，将单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息进行关联；

杂交复合物形成部，其自所述关联的第一微珠切割与各成像信息对应的第一条形码核酸，使所述基因组相关核酸及第一条形码核酸分别与第二条形码核酸杂交而得到杂交复合物；

扩增产物制造部，其制造来源于所述杂交复合物的扩增产物；及

非破坏性测量信息及基因组相关信息的检测部，其以所述扩增产物的表达模式作为指标来整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。

(22)如(21)所述的系统，其中，所述非破坏性测量信息及成像信息的测定部包含选自显微镜、流式细胞仪装置中的至少1种。

(23)第一微珠及第二微珠的组合物，其用于整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息，其中，

第一微珠是以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，

第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交，

所述组合物能以来源于第一条形码核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第一扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的非破坏性测量信息，且以来源于所述基因组相关核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第二扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的基因组相关信息。

(24)含有第一微珠而成的检测剂，其与第二微珠一同使用，用于整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息，其中，

第一微珠是以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，

第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交，

所述检测剂能以来源于第一条形码核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第一扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的非破坏性测量信息，且以来源于所述基因组相关核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第二扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的基因组相关信息。

(25)含有第二微珠而成的检测剂，其与第一微珠一同使用，用于整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息，其中，

第一微珠是以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，

第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交，

所述检测剂能以来源于第一条形码核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第一扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的非破坏性测量信息，且以来源于所述基因组相关核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第二扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的基因组相关信息。

(26)对被测细胞进行分类的方法，其使用基于利用(1)～(20)中任一项所述的方法整体性检测得到的非破坏性测量信息和基因组相关信息而获得的分类模型，基于被测细胞的非破坏性测量信息，对所述被测细胞进行分类。

(27)获得针对被测物质的单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法，其使用(1)～(20)中任一项所述的整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法，

其包括使所述被测物质与单个细胞或来源于其的物质、所述第一微珠及所述第二微珠共存的工序。

(28)筛选被测物质的方法，其使用通过(27)所述的方法得到的针对被测物质的单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息来筛选被测物质。

根据本发明，能够整体性且高效地检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。

附图说明

[图1]为关于本发明的检测方法的示意图。

[图2]为关于本发明的以可切割的方式连接于第一条形码核酸的第一微珠的示意图。

[图3]为关于本发明的与第二条形码核酸连接的第二微珠的示意图。

[图4]为表示本发明的与第一条形码核酸连接的第一微珠及与第二条形码核酸连接的第二微珠的其他方式的示意图。

[图5]为表示本发明的与第一条形码核酸连接的第一微珠及与第二条形码核酸连接的第二微珠的另一其他方式的示意图。

[图6]为表示本发明的与第一条形码核酸连接的第一微珠的其他方式的示意图。

[图7]为表示本发明的与第一条形码核酸连接的第一微珠及与第二条形码核酸连接的第二微珠的其他方式的示意图。

[图8]为表示本发明的隔室的制造方法的示意图。

[图9]为表示本发明的隔室的制造方法的其他方式的示意图。

[图10]为表示本发明的隔室的制造方法的其他方式的示意图。

[图11]为表示本发明的隔室的制造方法的其他方式的示意图。

[图12]为本发明的系统的流程图。

[图13]为包含第一微珠、第二微珠及NIH3T3细胞的油包水型隔室的照片。

[图14]A为担载有绿色荧光微珠的NIH3T3细胞的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片。B为担载有红色荧光微珠的K562细胞的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片。C为担载有绿色荧光微珠和红色荧光微珠的MIA-PaCa2细胞的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片。

[图15]A为包含细胞的第一微珠的相位差显微镜照片。B为包含细胞的第一微珠的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片。

[图16]为针对隔室内的基因转录产物的个数的测定结果。

[图17]A为含有第一条形码核酸的细菌的混合物的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片。B为具有EGFP蛋白基因区、第一共通条形码区的质粒的序列的测序结果。C为包含含有第一条形码核酸的细菌及细胞的油包水型隔室的照片。D为包含第三固有条形码区的序列和与EGFP对应的第一共通条形码区的扩增产物的电泳照片。

具体实施方式

定义

本说明书中所谓“基因组相关信息”，是指来源于与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸的核酸序列信息。此处，所谓“基因组相关核酸”，优选表示单个细胞的基因组DNA、来源于单个细胞基因组的mRNA等RNA或其cDNA、或者对在单个细胞中表达的蛋白质等分子具有特异性的核酸探针。前述核酸探针优选包含条形码核酸，所述条形码核酸以可切割的方式连接于能与成为靶标的蛋白质等分子特异性结合的分子(以下也称为结合分子)，且可彼此区分。另外，核酸为基因组DNA时，该DNA可以是被限制性内切酶等切割而成的片段，也可导入有DNA标签。

本说明书中所谓“条形码区”，是指包含T(胸腺嘧啶)或U(尿嘧啶)、A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、及C(胞嘧啶)的随机碱基序列的区域。另外，条形码核酸是包含条形码区的核酸，并且能识别细胞的基因组相关信息、来自微珠的成像信息。

作为条形码区，存在共通条形码区、固有条形码区这两者。

所谓共通条形码区，是在同一识别对象中共通的条形码区。识别对象为细胞的基因组相关信息时，是随每个细胞而不同的条形码区、即在一个细胞中共通的条形码区。通过在共通条形码区处进行标记，可识别来源于同一细胞的基因组相关信息。另外，识别对象为微珠的成像信息时，是按具有相同成像信息的微珠而各异的条形码区、即在具有相同成像信息的微珠中共通的条形码区。通过在共通条形码区处进行标记，可识别来自具有相同成像信息的微珠的成像信息。

此外，在对在单个细胞中表达的蛋白质等分子具有特异性的核酸探针中，该核酸探针包含能与该蛋白质等分子特异性结合的分子(结合分子)。其中，前述核酸探针中的按前述结合分子而各异的条形码区、即在相同的结合分子方面共通的条形码区也被视为共通条形码区。

另外，所谓固有条形码区，是指通过在按条形码核酸而各异的条形码区处进行标记、从而能够分别对各条形码核酸进行区分的区域，可识别与各条形码核酸连接的微珠、与各条形码核酸杂交的基因组相关核酸。条形码区的长度没有特别限定，优选为10～40个碱基长度的序列，例如条形码区为12个碱基长度的情况下，可对具有4¹²种多样性的条形码序列一次性进行核酸扩增，可制作4¹²种微珠。

本说明书中所谓“杂交”，是指条形码核酸的杂交区在严格条件下和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者其他条形码核酸形成双链复合物。此处，所谓严格条件，是指形成所谓的特异性复合物、而不形成非特异性复合物的条件。这样的严格条件是本领域技术人员周知的，可参考例如《分子克隆》(第三版，冷泉港实验室出版社，纽约)、《最新分子生物学实验方法汇编》(Current protocols in molecular biology)(Frederick M.Ausubel等编，1987)进行设定。

因此，所谓“杂交区”，是指能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者其他条形码核酸结合(杂交)的区域。

例如，基因组相关核酸为mRNA的情况下，第二条形码核酸中的第二杂交区优选为由T构成的多聚胸腺嘧啶。多聚胸腺嘧啶的长度为能与mRNA的多聚腺嘌呤(A)尾部退火(杂交)的长度即可。上述的情况下，第一杂交区优选为与多聚胸腺嘧啶互补的序列、例如多聚腺嘌呤(多聚A)。

基因组相关核酸为基因组DNA等DNA的情况下，第二条形码核酸中的第二杂交区优选包含与该DNA的特定的序列或被导入该DNA的DNA标签的序列互补的序列而成。上述的情况下，第一杂交区优选为与第二杂交区互补的序列。

另外，对在单个细胞中表达的蛋白质等分子具有特异性的核酸探针包含条形码核酸、且该条形码核酸包含杂交区时，第二条形码核酸中的第二杂交区优选包含与该杂交区互补的序列而成。上述的情况下，与上述核酸探针连接的条形码核酸中的杂交区优选为与第二杂交区互补的序列。

本说明书中所谓“隔室”，是指处于与其他液体或周围的介质隔离的状态的空间。优选为被保持于上述空间中的一定容量的液体或凝胶。另外，上述隔室也称为微小区室。隔室与周围的隔离可利用隔室的周围的固体阻隔、或利用相分离而实现。例如，悬浮于疏水性载体液中的水性液滴可构成隔室。上述隔室可以是例如孔、液滴、凝胶粒子的形态，具体而言，可举出水性液滴、油滴、水凝胶(例如琼脂糖、胶原蛋白、海藻酸)的凝胶粒子、乳液等多种非混合界面重叠的水·油的结构体、多孔板的孔等。

检测方法

本发明的整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法的特征在于，其包括下述工序：

准备多个隔室，每1个隔室包含单个细胞或来源于其的物质、第一微珠、和第二微珠，

其中，第一微珠是各自以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，

并且，各隔室中的第一微珠的成像信息可彼此区分，

所述第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交；

在准备各隔室前或在各隔室中，对单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行检测，将单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息进行关联；

自所述关联的第一微珠切割第一条形码核酸，使所述基因组相关核酸及第一条形码核酸分别与第二条形码核酸杂交而得到杂交复合物；

制造来源于所述杂交复合物的扩增产物；

以所述扩增产物的表达模式作为指标，整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。

以下，基于优选的实施方式说明本发明的检测方法，但对本发明不构成特别限定。

隔室准备工序

本发明的隔室准备工序是下述工序：准备多个隔室，每1个隔室包含单个细胞或来源于其的物质、第一微珠、和第二微珠。其中，第一微珠是各自以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，并且，各隔室中的第一微珠的成像信息可彼此区分。前述第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交。

此处，各隔室中的细胞与第一微珠的位置关系只要不妨碍获得细胞的非破坏性测量信息及第一微珠的成像信息即可，没有特别限定，可根据细胞、第一微珠的种类、大小、性质而适当设定。即，本发明中，对于细胞和第一微珠而言，只要能够一同获得成像信息即可，第一微珠与细胞可以在接触或不接触的情况下共同存在于同一隔室内，也可将第一微珠导入至细胞的内部。作为第一微珠与细胞接触的方式的优选例，可举出例如将细胞表面与第一微珠直接粘接、或通过使用市售的细胞膜修饰剂从而使细胞担载第一微珠的方式等。另外，作为第一微珠与细胞不接触的方式的优选例，可举出在同一隔室内第一微珠与细胞不接合地存在的方式、通过使不包含细胞但包含第一微珠的子隔室与细胞接合而使细胞担载子隔室的方式等。另外，作为将第一微珠导入至细胞的内部的优选例，可举出第一微珠被细胞吞食的方式等。

对于作为检测对象的细胞的种类、形态而言，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，可根据目的而选择细胞。另外，上述隔室中包含的细胞也可以是来源于细胞的物质。作为所述来源于细胞的物质，可举出细胞的破碎物、细胞的内容物、细胞的溶解物、由细胞构成的单元(例如，细胞块、细胞球、类器官)。

来源于细胞的物质可通过使用使细胞与细胞溶解缓冲液等共存等已知方法来获得。从细胞中获得来源于其的物质的工序可在一同获得细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的图像信息并进行关联后、于与第二微珠一同隔室化之前实施，也可将细胞、第一微珠及第二微珠以及细胞溶解缓冲液一同封入而使所述物质在隔室中生成。

以下，按照图1a对本发明的隔室准备工序的一个方式进行说明，但对本发明不构成特别限定。

首先，分别准备组织或多个细胞等作为检测对象的细胞群101、多个第一微珠102、多个第二微珠103。需要说明的是，图1a中，第一条形码核酸为RNA，包含第一共通条形码区及多聚腺嘌呤，介由可紫外线切割的接头与第一微珠连接。另外，第二条形码核酸为DNA，包含PCR引物区、第二共通条形码区、第二固有条形码区及多聚胸腺嘧啶。

然后，通过对细胞群101、多个第一微珠102、及多个第二微珠103进行分配处理来得到多个隔室104。通过上述分配处理，将上述细胞群101之中的单个细胞105、第一微珠102、第二微珠103的组合分配至多个隔室104。

分配处理的方法如后文所述。

上述第一微珠在每1个隔室中的数量没有特别限定，可以是1个，但为了增加可彼此区分的隔室的种类数量，优选为多个，更优选为2～100个，进一步优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10个。通过将多个第一微珠同时封闭于隔室，从而能够基于较少种类的第一微珠的成像信息的组合而急剧增加隔室内的第一微珠的成像信息的组合的变化(variation)的数量，可将大量的隔室彼此区分。此处，第一微珠也存在具有相同的成像信息的微珠，但优选在隔室中存在多个具有不同种类的成像信息的第一微珠。

例如，选择了微珠的大小、荧光的颜色、荧光的浓度作为第一微珠的成像信息的例子如下所示。微珠的大小为3种(3、7、11μm)、荧光色素的颜色为3个颜色(蓝、绿、红)、基于荧光色素浓度的强度水平为6种(0、1、2、3、4、5)。这种情况下，作为微珠的种类，为(强度水平^大小种类-1)×大小种类＝(6³-1)×3＝645。

此处，在隔室中存在3个第一微珠的情况下，作为第一微珠的各组合的种类，可得到₆₄₅C₃＞10⁷这样极多种类的组合。

上述第二微珠在每1个隔室中的数量没有特别限定，从识别来源于同一细胞的基因组相关信息的观点考虑，优选每1个隔室为1个。

此外，也可在分配处理时同时封入后续工序中需要的试剂、例如细胞溶解缓冲液、PCR反应混合物(reaction mix)等PCR用试剂。

单个细胞的非破坏性测量信息与微珠的成像信息的关联工序

本发明的单个细胞的非破坏性测量信息与微珠的成像信息的关联工序包括下述工序：在准备各隔室前或在各隔室中，对单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行检测，将单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息进行关联。

以下，按照图1b对本发明的非破坏性测量信息的关联工序的一个方式进行说明，但对本发明不构成特别限定。

对隔室104中的细胞105的非破坏性测量信息和第一微珠102的成像信息一同进行测定。然后，基于得到的测定结果，将隔室104中的细胞105的非破坏性测量信息与第一微珠102的成像信息进行关联。

作为对上述单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行检测或测定的方法，可举出流式细胞术(例如，观察在流路中流动的隔室的成像流式细胞术法等)、显微镜测定(使用了常见的光学显微镜的微孔内的隔室观察法等)等。

另外，根据本发明的其他方式，隔室104可利用微珠的成像信息进行确定，因此，例如，也可在经过孵育、化学分析、获得成像信息或细胞的非破坏性测量信息之后的规定时间后、例如10分钟后，再次对细胞的非破坏性测量信息等进行测定。

此处，作为上述第一微珠的成像信息，只要各隔室中的第一微珠的成像信息可彼此区分即可，没有特别限定，可以是微珠自身所具有的成像信息，也可以是通过进行标记而赋予的成像信息。此处，所谓“成像”，包括能基于空间信息、对在时间上重叠的微珠等被测对象的测量信息进行分离测定的方法。将通过上述成像获得的被测对象的测量信息称为成像信息。作为上述成像信息，可举出例如选自颜色(色彩)、荧光、大小、形状、电磁波、透过、相位、散射、反射、相干拉曼、红外分光、拉曼分光、吸收光谱、第一微珠的数量中的至少1种测定信息。作为成像信息，优选为红外分光成像、拉曼分光成像、彩色成像、荧光成像。

作为荧光，可利用有机系荧光分子、来源于生物体的荧光分子、量子点、重金属等无机物质、或它们的组合而得到。

透过、相位、散射、反射等测定信息可利用折射率、颜色根据浓度而异的有机物质、无机物质、或它们的组合而得到。另外，这些信息可利用明视野观察法等得到。

吸收光谱、拉曼可利用具有吸收、拉曼散射光谱的吸收波长带(分子印迹)不同的有机分子、无机物质、它们的组合而得到，可举出例如具有不与细胞信号重叠的波长带的炔系化合物。

另外，关于相干拉曼，可利用例如相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)法、受激拉曼散射(SRS)法进行测定。

关于微珠的大小、颜色、形状，其也成为第一微珠的成像信息，上述大小、颜色、形状可通过利用例如流式平板印刷(flow lithography)形成微珠而成为各种各样的。另外，这些信息可利用明视野观察法等得到。

另外，由于微珠的成像信息在空间上与细胞分离，因此，能够在不干扰细胞的非破坏性测量信息的情况下进行分离。

此外，作为上述细胞的非破坏性测量信息，只要能够识别细胞的特征即可，没有特别限定，可举出成像信息、从细胞得到的形态信息、从细胞得到的物理波(例如声音、超声波)的测定信息、从细胞得到的电磁波(例如光、太赫兹)的测定信息。此处，上述成像信息可与第一微珠的成像信息同样地得到。作为上述非破坏性测量信息，可举出例如基于颜色、荧光、大小、形状、电磁波、透过、相位、散射、反射、相干拉曼、红外分光、拉曼、或吸收光谱等的测定信息的成像信息，或者核、细胞质的大小、细胞骨架的疏密度、内部结构的特征量、膜的均匀度、各结构的荧光强度、分子局部存在、分子或观察对象的位置关系等细胞的形态信息，优选为从细胞得到的形态信息。

图1f及图1g中，作为一例，更具体地说明成像信息的分析流程。

图1f为以控制大小、RGB、荧光亮度、其他光学特性而制作的n种(ID)微珠的成像信息作为指标的情况下的第一微珠的数据库的示意图。图1f中，测量第一微珠的成像信息，将得到的第一微珠的成像信息与光学微珠ID联系起来。

此外，图1g中，对细胞及第一微珠的组合进行测定，将细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息相关联。首先，读取各第一微珠的光学条形码ID(此处实施光学校准)。另外，在各第一微珠上，基于与第一微珠连接的第一条形码核酸的第一共通条形码区而赋予了核酸条形码ID。因此，将上述第一微珠的核酸条形码ID的组合与上述光学微珠ID的组合进行对照，可确定细胞。然后，可将细胞的非破坏性测量信息与细胞的基因组相关信息联系起来。

本发明的将单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息关联的工序可在准备各隔室前实施，也可在准备各隔室后实施。尤其在准备各隔室前对单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行检测并关联的方式中，优选的是，在该关联后将细胞溶解·破碎等而得到来源于细胞的物质，将该来源物质与第一微珠的混合物和第二微珠一同封入隔室内，实施后续的杂交复合物获得工序。

此处，在准备各隔室前对单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行检测并关联的方式中的、细胞与第一微珠的位置关系与上述的各隔室中的细胞与第一微珠的位置关系同样，只要不妨碍获得细胞的非破坏性测量信息及第一微珠的成像信息即可，没有特别限定，可根据细胞、第一微珠的种类、大小、性质适当设定。即，本发明中，只要能够一同获得细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息即可，第一微珠与细胞可以在接触或不接触的情况下共同存在于同一隔室内，也可将第一微珠导入细胞的内部。作为优选例，可举出例如使细胞担载第一微珠的方式、通过使不包含细胞但包含第一微珠的子隔室与细胞接合而使细胞担载子隔室的方式、第一微珠被细胞吞食的方式等。

杂交复合物获得工序

杂交复合物获得工序包括下述工序：自前述关联的第一微珠切割第一条形码核酸后，使前述基因组相关核酸及第一条形码核酸分别与第二条形码核酸杂交而得到杂交复合物。

上述工序可利用已知的方法实施。例如，可利用E.Z.Macosko等，Highly ParallelGenome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using NanoliterDroplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法实施。

以下，按照图1c对杂交复合物获得工序的一个方式进行说明，但没有特别限定。

继上述的单个细胞的非破坏性测量信息与微珠的成像信息的关联工序之后，对可切割的接头进行切割(例如，通过紫外线照射对可紫外线切割的接头进行切割)，切离第一条形码核酸106，然后，将细胞溶解。然后，在隔室内，使来自细胞的mRNA107及来自第一微珠的第一条形码核酸106分别与第二条形码核酸108杂交，得到杂交复合物120。然后，破坏液滴。

来源于杂交复合物的扩增产物的制造工序

来源于杂交复合物的扩增产物的制造工序包括下述工序：制造来源于上述杂交复合物获得工序中得到的杂交复合物的扩增产物。

上述工序可利用已知的方法实施。例如，可利用E.Z.Macosko等，Highly ParallelGenome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using NanoliterDroplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法实施。

以下，按照图1d对来源于杂交复合物的扩增产物的制造工序的一个方式进行说明，但没有特别限定。

针对上述的杂交复合物获得工序中得到的杂交复合物实施逆转录反应。通过该逆转录反应可合成针对来自细胞的mRNA107的cDNA110，并合成针对第一条形码核酸106的cDNA109。然后，可进行模板转换(template switching)。

然后，实施PCR反应。通过该PCR反应，生成来源于第一条形码核酸106与第二条形码核酸108形成的杂交复合物的第一扩增产物112、及来源于来自细胞的mRNA107与第二条形码核酸108形成的杂交复合物的第二扩增产物113这2种扩增产物111。需要说明的是，基因组相关核酸为DNA时，作为上述PCR反应，可实施延伸PCR法。

然后，基于得到的扩增产物，制备来源于1～n的各隔室的、包含第一扩增产物及第二扩增产物的扩增产物的文库。

单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的整体性检测工序

整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的工序包括下述工序：以上述来源于杂交复合物的扩增产物的制造工序中得到的扩增产物的表达模式作为指标，整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。作为上述扩增产物的表达模式，可举出例如通过测序得到的、扩增产物的序列信息、或者该序列信息中的第一条形码核酸的序列信息、第一共通条形码区的序列信息、第一固有条形码区的序列信息、第二条形码核酸的序列信息、第二共通条形码区的序列信息、或第二固有条形码区的序列信息等。

以下，按照图1e对整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的工序的一个方式进行说明，但没有特别限定。

通过测序仪确定上述的来源于杂交复合物的扩增产物的制造工序中得到的扩增产物(第一扩增产物、第二扩增产物)的序列，对扩增产物的序列信息进行分析。第二扩增产物的分析中，以第二共通条形码区的序列信息作为指标，对作为各扩增产物来源的细胞进行划分。另外，由于能够基于第二固有条形码区的序列信息识别各mRNA分子，因此，以该序列信息作为指标，可得到各细胞的mRNA的序列及其表达量等信息。基于上述第二扩增产物的分析中得到的信息，可得到各细胞的转录组信息115。

接着，对细胞的非破坏性测量信息114进行分析。此处，如上所述，单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息被相关联，在该第一微珠上连接有与各成像信息对应的第一条形码核酸。因此，上述分析中，基于第一条形码核酸的第一共通条形码区的序列信息，可针对各第一扩增产物，划分作为来源的细胞的非破坏性测量信息114。

接着，将细胞的非破坏性测量信息114与转录组信息115进行匹配。因此，可将各隔室中的单个细胞的基因组相关信息与非破坏性测量信息以1对1的方式结合起来。

此外，可提供使用基于上述中得到的单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息而获得的分类模型、基于被测细胞的非破坏性测量信息对该被测细胞进行分析、判别或分类的方法。

上述方法中，首先，可制作单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的数据库。然后，使用上述数据库，基于上述的单个细胞的非破坏性测量信息与该细胞的转录组等的基因组相关信息的匹配结果，对基因组相关信息实施聚类116，由此可将各细胞标注为数个类型117(A、B、C、……N型细胞)，进行分类。另外，可将得到的上述的单个细胞的非破坏性测量信息和细胞分类结果用作训练数据，就单个细胞的非破坏性测量信息进行机器学习而获得分类模型(有监督的机器学习)。

此外，可使用上述中获得的分类模型，基于被测细胞的非破坏性测量信息，对该被测细胞进行分析、判别或分类。例如，可以基于上述被测细胞的非破坏性测量信息，针对该细胞，鉴定基于基因组相关信息进行聚类而得的细胞类型。

另外，作为上述对被测细胞进行分析、判别或分类的方法的其他方式，还可举出以下的方法。

首先，可制作单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的数据库。使用上述数据库，基于上述的单个细胞的非破坏性测量信息与该细胞的转录组等的基因组相关信息的匹配结果，对非破坏性测量信息进行聚类，由此可将各细胞标注为数个类型(A、B、C、……N型细胞)，进行分类。另外，可将得到的上述的单个细胞的非破坏性测量信息和细胞分类结果用作训练数据，就单个细胞的非破坏性测量信息进行机器学习而获得分类模型(有监督的机器学习)。

此外，可使用上述中获得的分类模型，基于被测细胞的基因组相关信息，对该被测细胞进行分析、判别或分类。

以下，关于本说明书中使用的第一微珠、第二微珠等进行记载。

以可切割的方式连接于第一条形码核酸且具有可彼此区分的成像信息的第一微 珠

图2中，作为以可切割的方式连接于第一条形码核酸且具有可彼此区分的成像信息的第一微珠(以下，也称为与第一条形码核酸连接的第一微珠)的一个方式，示出第一条形码核酸为RNA的方式。

第一条形码核酸202与具有可彼此区分的成像信息的第一微珠201连接。第一条形码核酸202包含第一共通条形码区203及第一杂交区204。第一条形码核酸202自第一微珠侧起依次包含第一共通条形码区203及第一杂交区204。其中，作为第一杂交区204，可举出多聚腺嘌呤。此外，第一条形码核酸202以可介由可切割接头205进行切割的方式与第一微珠201连接。

含有第一条形码核酸的生物

本发明的第一微珠也可以是含有第一条形码核酸且具有可彼此区分的成像信息的生物(以下，也称为含有第一条形码核酸的生物)。

该生物优选含有具有第一条形码核酸的质粒。另外，该生物的成像信息只要是本发明的成像信息即可，没有特别限定，优选为生物的个数、荧光，作为荧光，不仅包括各种颜色的光谱，也包括其亮度信息。此外，荧光优选利用存在于质粒中的荧光蛋白基因所表达的荧光蛋白而得到。因此，本发明的生物优选含有例如具有第一条形码核酸和荧光蛋白基因的质粒。此处，第一条形码核酸包含第一共通条形码区(例如，在各荧光蛋白中共通的共通条形码区)及第一杂交区，作为第一杂交区，可举出多聚腺嘌呤。此外，第一条形码核酸可包含第三固有条形码区。该第三固有条形码区使得能够区分生物的各个克隆。因此，本发明的生物中的质粒的构成例如依次为荧光蛋白基因区、第三固有条形码区、第一共通条形码区、及第一杂交区。

第一微珠

本发明的第一微珠是可基于成像信息彼此区分的微珠。

本说明书中，所谓微珠，只要是条形码核酸所能连接的粒子或能够含有条形码核酸的生物即可，没有特别限定，形状也没有限定。

第一微珠为粒子的情况下，其材质没有特别限定，可举出以硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、硫化镉(CdS)、硒化锌(ZnSe)、氧化锌(ZnO)等半导体材料制成的量子点(半导体纳米粒子)等半导体、金等重金属等无机物质、丙烯酰胺、琼脂糖、胶原蛋白、海藻酸、PEG系等的水凝胶、聚苯乙烯、聚丙烯、亲水性乙烯基聚合物(例如，Toyopearl HW-65S(TOSOHCORPORATION))等树脂、或者PEG或其衍生物结合而成的亲水性乙烯基聚合物等，优选为水凝胶，更优选为丙烯酰胺、海藻酸。

第一微珠为生物的情况下，生物的种类、形态只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，可根据目的而选择生物。作为该生物，可举出真核生物或原核生物或者它们的细胞，例如为微生物等，具体而言，可举出大肠杆菌等细菌、酵母等真菌。该生物优选能够扩增具有第一条形码核酸的质粒。

第一条形码核酸

本发明的第一条形码核酸只要包含与各成像信息对应的条形码区即可，没有特别限定，例如，该核酸为RNA、DNA或它们的组合。

本发明的第一条形码核酸优选包含在各自与相同的成像信息对应的第一微珠中共通的第一共通条形码区、和能与第二条形码核酸杂交的第一杂交区。这里，通过使用第一共通条形码区的序列信息，可与各隔室中的具有相同的成像信息的第一微珠的成像信息一对一地对应。因此，通过进行关联，可成为确定存在于同一隔室中的单个细胞的非破坏性测量信息的指标。

上述第一条形码核酸优选在每1个第一微珠上连接有多条。

另外，本发明的第一微珠优选连接有一种第一条形码核酸。

第一条形码核酸可与第一微珠直接或间接地连接。第一条形码核酸优选以可切割的方式与第一微珠连接，例如，可经由可切割的接头而连接。本发明中，所谓可切割的接头，可举出可进行化学切割的接头、可利用紫外线等光切割的接头、可进行热切割的接头、可进行酶切割的接头等。表明通过使用上述接头，可自微珠切割所连接的核酸，使其分离或游离。作为这样的接头，例如，作为可利用光切割的接头，可举出PC-生物素、iSpPC等，作为可进行化学切割的接头，可举出二硫键等。

作为本发明的第一微珠的优选的其他方式，可以还包含各自可彼此区分的第一固有条形码区、引物区。作为本发明的第一微珠的优选的另一其他方式，可以介由可切割的接头而具有丙烯基亚磷酰胺部分(Acrydite(商标))等丙烯酰胺部分。

以可切割的方式连接于第一条形码核酸且具有可彼此区分的成像信息的第一微 珠的制造方法

与第一条形码核酸连接的第一微珠的制造方法可按照已知的方法进行制造。例如，可以按照A.M.Klein等，Droplet Barcoding for Single-Cell TranscriptomicsApplied to Embryonic Stem Cells.Cell.161,1187-1201(2015)中记载的方法进行制造。

作为上述方法的一例，利用微流体乳液技术，将含有第一条形码核酸的丙烯酰胺：双丙烯酰胺水溶液在有机溶剂层中制成丙烯酰胺聚合物，用作第一微珠。此处，与第一条形码核酸结合的可切割的接头的微珠连接侧可用丙烯基亚磷酰胺部分(Acrydite(商标))等丙烯酰胺部分进行修饰。通过上述修饰，在丙烯酰胺聚合时，第一条形码核酸也与丙烯酰胺聚合物一同进行聚合。在该乳液化之前，例如，可预先使经荧光标记的丙烯酰胺单体溶解于上述水溶液中，由此制作具有各种颜色、各种荧光强度的第一微珠。具体而言，第一微珠可使用利用了流体聚焦装置(flow focusing device)、或微孔等微流体技术的液滴制造方法进行制造。对于微珠的大小而言，流体聚焦装置中可通过改变流体条件进行控制，微孔中可通过变更各腔室的大小进行控制。聚合化后，从液滴中取出得到的第一微珠，洗涤若干次，用作第一微珠。

与第一条形码核酸连接的第一微珠的制造方法也可利用已知的方法进行制造。例如，可利用日本特表2009-513948号公报、日本特表2017-506877号公报中记载的方法进行制造。

对上述方法的一例进行说明。首先，对于第一条形码核酸而言，利用固相合成法或酶合成法制备特定的核酸序列。然后，介由可切割的接头与第一微珠结合。条形码核酸为RNA的情况下，合成作为单链条形码核酸的互补链的DNA模板后，可通过线性扩增反应，利用T7等RNA聚合酶(其与DNA模板上的启动子序列结合而合成包含单链条形码区的RNA)进行合成。

与多条第二条形码核酸连接的第二微珠

图3中，示出了与能与基因组相关核酸、及第一条形码核酸杂交的多条第二条形码核酸连接的第二微珠(以下，也称为与第二条形码核酸连接的第二微珠)的一个方式。

图3中，第二条形码核酸302与第二微珠301连接。第二条形码核酸302包含第二共通条形码区303、第二固有条形码区304及第二杂交区305。第二条形码核酸302自第二微珠侧起依次包含PCR引物区306、第二共通条形码区303、第二固有条形码区304及第二杂交区305。上述第二杂交区305为多聚胸腺嘧啶。

从能够与许多条基因组相关核酸杂交的观点考虑，第二微珠优选与1,000～100,000条第二条形码核酸连接。

第二微珠

本发明的第二微珠的材质可使用与第一微珠粒子同样的材质。

本发明的第二微珠的材质优选为水凝胶、树脂，更优选为丙烯酰胺、聚苯乙烯、亲水性乙烯基聚合物、PEG或其衍生物结合而成的亲水性乙烯基聚合物。

第二条形码核酸

本发明的第二条形码核酸只要包含条形码区即可，没有特别限定，例如，该核酸为RNA、DNA或它们的组合。第二条形码核酸可与第二微珠直接或间接地连接。

本发明的第二条形码核酸优选包含彼此共通的第二共通条形码区、可彼此区分的第二固有条形码区、和第二杂交区。此处，上述第二共通条形码区的序列信息可用作确定在隔室中与第二条形码核酸一同存在的细胞的指标。此外，上述第二固有条形码区的序列信息可用作确定基因组相关核酸的指标。另外，上述第二杂交区可与基因组相关核酸及第一条形码核酸分别杂交。因此，第二杂交区优选包含多聚胸腺嘧啶、或与基因组相关核酸互补的核酸。

如上所述，基因组相关核酸与上述第二共通条形码区的序列信息被相关联，因此可确定作为该基因组相关核酸来源的细胞。此外，由于上述第二条形码核酸与第一条形码核酸杂交，因此，第一微珠的第一共通条形码区等序列信息也与上述第二共通条形码区的序列信息相关联。需要说明的是，第一共通条形码区的序列信息与各第一微珠的成像信息相关联。另外，细胞的非破坏性测量信息也与各第一微珠的成像信息相关联。因此，基因组相关核酸信息可与细胞的非破坏性测量信息一对一地对应。

此外，与第一条形码核酸连接的第一微珠及与第二条形码核酸连接的第二微珠的其他方式示于图4。图4中，作为其他方式，示出了第一条形码核酸及第二条形码核酸各自为DNA的方式。

图4A的与第一条形码核酸连接的第一微珠400中，第一条形码核酸402与具有可彼此区分的成像信息的第一微珠401连接。第一条形码核酸402包含第一共通条形码区403及第一杂交区404。第一条形码核酸402自第一微珠侧起依次包含第一共通条形码区403及第一杂交区404。此外，第一条形码核酸402介由可切割的接头405以可切割的方式与第一微珠401连接。此外，第一杂交区404为与下述第二杂交区415互补的序列。

另外，图4A的与第二条形码核酸连接的第二微珠410中，第二条形码核酸412与第二微珠411连接。第二条形码核酸412包含第二共通条形码区413、第二固有条形码区414及第二杂交区415。第二条形码核酸412自第二微珠侧起依次包含PCR引物区416、第二共通条形码区413、第二固有条形码区414及第二杂交区415。上述第二杂交区415为与基因组相关核酸422的特定的序列杂交的、与该序列互补的序列。

此外，图4A中，将包含细胞420的隔室430和与第一条形码核酸连接的第一微珠400及与第二条形码核酸连接的第二微珠410一同示出。

另外，图4B中示出了杂交复合物。此处，第二条形码核酸412在第二杂交区415处与第一条形码核酸402的第一杂交区404杂交。此外，第二条形码核酸412在第二杂交区415处与基因组相关核酸422的特定的序列421杂交。

此外，与第一条形码核酸连接的第一微珠及与第二条形码核酸连接的第二微珠的另一其他方式示于图5。图5中，示出了第一条形码核酸及第二条形码核酸各自为DNA、且包含对在单个细胞中表达的蛋白质等分子具有特异性的核酸探针520(以下也称为核酸探针520)的方式。

图5A的与第一条形码核酸连接的第一微珠500中，第一条形码核酸502与具有可彼此区分的成像信息的第一微珠501连接。第一条形码核酸502包含第一共通条形码区503及第一杂交区504。第一条形码核酸502自第一微珠侧起依次包含第一共通条形码区503及第一杂交区504。此外，第一条形码核酸502介由可切割的接头505以可切割的方式与第一微珠501连接。此外，第一杂交区504为与下述第二杂交区515互补的序列。

另外，图5A的与第二条形码核酸连接的第二微珠510中，第二条形码核酸512与第二微珠511连接。第二条形码核酸512包含第二共通条形码区513、第二固有条形码区514及第二杂交区515。第二条形码核酸512自第二微珠侧起依次包含PCR引物区516、第二共通条形码区513、第二固有条形码区514及第二杂交区515。上述第二杂交区515为与核酸探针520的杂交区524互补的序列。

图5B(1)中，示出了核酸探针520。图5B(2)中，示出了上述核酸探针520与在细胞530中表达的蛋白质结合的方式，所述方式是通过将上述核酸探针520与细胞530混合并进行洗涤而实现的。此外，图5B(3)中，将包含上述核酸探针520所结合的细胞530的隔室540和与第一条形码核酸连接的第一微珠500及与第二条形码核酸连接的第二微珠510一同示出。

图5B(1)的核酸探针520中，第三条形码核酸522连接于能与在单个细胞中表达的目标蛋白等分子特异性结合的分子521(以下也称为结合分子521)。第三条形码核酸522包含第三共通条形码区523及第三杂交区524。第三条形码核酸522自结合分子521起依次包含第三共通条形码区523及第三杂交区524。此外，第三条形码核酸522介由可切割的接头525以可切割的方式与结合分子521连接。此外，第三杂交区524为与第二杂交区515互补的序列。上述核酸探针520可以是包含按各结合分子521而各异的第三条形码核酸522的多种探针。

另外，图5C示出了杂交复合物。第二条形码核酸512在第二杂交区515处与第一条形码核酸502的第一杂交区504杂交。此外，第二条形码核酸512在第二杂交区515处与第三条形码核酸522的第三杂交区524杂交。

通过对来源于上述核酸探针520的第三共通条形码区523的序列的扩增产物的序列信息进行分析，可确认目标分子在细胞中有无表达、表达量。

因此，通过使用对在单个细胞中表达的分子具有特异性的核酸探针，大量蛋白质组与细胞的非破坏性测量信息能一对一地对应。

此外，与第一条形码核酸连接的第一微珠的其他方式示于图6。图6中，作为其他方式，示出了第一条形码核酸为DNA、且包含特定的序列的方式。

图6A的与第一条形码核酸连接的第一微珠600中，第一条形码核酸602与具有可彼此区分的成像信息的第一微珠601连接。第一条形码核酸602包含第一共通条形码区603及第一杂交区604。第一条形码核酸602自第一微珠侧起依次包含第一共通条形码区603及第一杂交区604。此外，第一条形码核酸602介由可切割的接头605以可切割的方式与第一微珠601连接。此外，在第一条形码核酸603与可切割的接头605之间，包含特定的序列606。此外，第一杂交区604为与第二杂交区615互补的序列。

另外，图6B(1)中示出了杂交复合物。610表示与第二条形码核酸连接的第二微珠。其中，第二条形码核酸612在第二杂交区615处与第一条形码核酸602的第一杂交区604杂交。此外，如图6B(2)所示，通过使用与特定的序列606互补的序列的引物607，可合成与第一条形码核酸602及第二条形码核酸612互补的DNA，此外，第二条形码核酸612的互补DNA可通过模板转换进行合成。

此外，与第一条形码核酸连接的第一微珠及与第二条形码核酸连接的第二微珠的其他方式示于图7。图7中，作为其他方式，示出了第一条形码核酸及第二条形码核酸各自为DNA的方式。

图7A示出了隔室的准备工序。图7A的与第一条形码核酸连接的第一微珠700中，第一条形码核酸702与具有可彼此区分的成像信息的第一微珠701连接。第一条形码核酸702包含第一共通条形码区703及第一杂交区705。第一条形码核酸702自第一微珠侧起依次包含PCR引物区708、第一共通条形码区703、第一固有条形码区704及第一杂交区705。此外，第一条形码核酸702介由可切割的接头706以可切割的方式与结合于第一微珠701的丙烯基亚磷酰胺部分(Acrydite(商标))等丙烯酰胺部分707连接。此外，第一杂交区705为多聚腺嘌呤。

另外，图7A的与第二条形码核酸连接的第二微珠710中，第二条形码核酸712与第二微珠711连接。第二条形码核酸712包含第二共通条形码区713、第二固有条形码区714及第二杂交区715。第二条形码核酸712自第二微珠侧起依次包含PCR引物区416、第二共通条形码区713、第二固有条形码区714及第二杂交区715。上述第二杂交区715为多聚胸腺嘧啶。720表示细胞。

图7B～E示出了经过单个细胞的非破坏性测量信息与微珠的成像信息的关联工序后的、获得杂交复合物的工序。

图7B中，对可光切割的接头进行切割，将细胞溶解。图7B中，示出了已切割第一条形码核酸702后的第一微珠701、与第二条形码核酸连接的第二微珠710、及来自细胞的mRNA721。

另外，图7C中示出了杂交复合物。此处，第二条形码核酸712在第二杂交区715处与第一条形码核酸702的第一杂交区705杂交。此外，利用DNA聚合酶722合成互补链DNA723。此外，第二条形码核酸712在第二杂交区715处与来自细胞的mRNA721的多聚腺嘌呤杂交。

图7D中，在杂交复合物中，进行逆转录反应，合成针对来自细胞的mRNA721的cDNA724。

图7E中，利用DNA标签725对合成的cDNA的3’末端进行标记。上述DNA标签可用作PCR的引物位点，可举出例如转座子嵌合端(Mosaic End，ME)序列。

与多条第二条形码核酸连接的第二微珠的制造方法

关于与多条第二条形码核酸连接的第二微珠的制造方法，可利用已知的方法进行制造。例如，可利用E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide ExpressionProfiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法进行制造。

对上述方法进行简单说明时，第二条形码核酸中的第二共通条形码区可通过分割-汇合合成(split-and-pool synthesis)进行制造。例如，可通过实施n轮(round)分割-汇合合成工序来进行制造。各轮包括：i)将微珠群分割成4个的工序；ii)针对各微珠群分别合成A、G、C、T中的任一者的工序；iii)将4个微珠群合并而进行汇合的工序。轮数n可根据要制造的条形码序列的长度适当设定。例如，可举出n＝6～40。

在制造上述第二共通条形码后，合成第二固有条形码区。针对与第二共通条形码区连接的全部微珠，在A、T、G、C全部碱基的存在下实施m轮合成。轮数m可根据要制造的条形码序列的长度适当设定。例如，可举出m＝3～15。

分配处理

基于图8、9，对分配处理、即隔室的制造方法的一个方式进行具体说明。

图8a、b示出了以单一步骤制造隔室、并对单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行检测及/或测定的方法。具体而言，将含有细胞801、与第一条形码核酸连接的第一微珠802、及与第二条形码核酸连接的第二微珠803的溶液加入油806中，制作作为隔室807的液滴，于出口808释放。图8a中，非破坏性测量信息的测定在隔室的形成之前及之后进行，图8b中，非破坏性测量信息的测定在隔室的形成之后进行。图8a中，可在隔室的形成之前及之后实施各1种测定，例如荧光成像测定804、明视野成像805。此处，在制作隔室之前的测定中，可得到细胞及第一微珠的正确的成像信息，在制作隔室之后的测定中，可确认隔室中的细胞及第一微珠的组合。另外，根据图8a、b的方法，能够拍摄细胞及第一微珠的自然状态。上述方法中，作为具体使用的设备，对于隔室的制造，可举出流体聚焦装置等在使用了微流体技术的液滴制造方法中使用的设备；对于非破坏性测量信息的测定，可举出成像流式细胞仪等。作为上述设备，只要不妨碍本发明即可，可使用已知的设备。作为流体聚焦装置等在使用了微流体技术的液滴制造方法中使用的设备，可举出例如E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of IndividualCells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)、Microfluid Nanofluid(2008)5:585-594,Applied Physics Letters、Vol.85,No.13,27,September 2004,p2649-2651、T.M.Gierahn等，Seq-Well:portable,low-cost RNA sequencing of single cellsat high throughput,Nature Methods,14,395-398(2017)、日本特表2013-508156等中记载的设备。利用上述流体聚焦装置等在使用了微流体技术的液滴制造方法中使用的设备，可高效且大量地制造具有以颜色、形状、大小为代表的成像信息的微珠。

另外，图9中，示出了以2个步骤制造隔室的方法。首先，步骤A中，将含有细胞901、与第一条形码核酸连接的第一微珠902、及与第二条形码核酸连接的第二微珠903的溶液加入油904中，形成隔室905后，于出口906释放，进行凝胶化907。然后，步骤B中，示出了下述方法：将凝胶化的粒子907释放至含有细胞溶解缓冲液908的水性溶剂中，实施荧光成像测定909，封入油910中进一步形成隔室911。利用图9的方法，虽然可能在计划对液滴等隔室中的细胞进行拍摄时发生转动，但封闭于存在于水相内的凝胶粒子内的细胞、微珠可在不转动的情况下稳定地拍摄。

另外，图10中，示出了以2个步骤制造隔室的方法的其他方式。首先，步骤A中，将含有与第一条形码核酸连接的第一微珠1002、及与第二条形码核酸连接的第二微珠1003的溶液加入油1004中，形成隔室1005后，于出口1006释放，进行凝胶化1007。然后，步骤B中，示出了下述方法：将凝胶化的粒子1007和细胞1001释放至含有细胞溶解缓冲液1008的水性溶剂中，实施荧光成像测定1009，封入油1004中进一步形成隔室1010。在封闭有细胞、细胞溶解缓冲液、第一微珠及第二微珠的隔室内，最终该溶解缓冲液将细胞及凝胶化的粒子溶解，可获得杂交复合物。

另外，图11中，示出了以2个步骤制造隔室的方法的另一其他方式。首先，步骤A中，制作包含与第一条形码核酸连接的第一微珠1102和细胞1101的溶液并进行混合。然后，例如，可在流路中得到担载有第一微珠的细胞。实施得到的细胞的荧光成像测定1103。然后，步骤B中，将含有担载有第一微珠的细胞1104的溶液、与第二条形码核酸连接的第二微珠1105、及含有细胞溶解缓冲液1106的水性溶剂在流路中混合。将得到的混合液释放至填充有油1108的流路中，制作作为隔室1107的液滴，于出口1109释放。上述方法也可用于在隔室中包含来源于细胞的物质的方式。

系统

本发明的整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的系统的特征在于，其包含：隔室准备部，其准备多个隔室，每1个隔室包含单个细胞或来源于其的物质、第一微珠、和第二微珠，其中，第一微珠是各自以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，并且，各隔室中的第一微珠的成像信息可彼此区分，所述第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交；非破坏性测量信息的测定部，其对准备各隔室前或各隔室中的、单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行测定，将单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息进行关联；杂交复合物形成部，其自所述关联的第一微珠切割与各成像信息对应的第一条形码核酸，使所述基因组相关核酸及第一条形码核酸分别与第二条形码核酸杂交而得到杂交复合物；扩增产物制造部，其制造来源于所述杂交复合物的扩增产物；及非破坏性测量信息及基因组相关信息的检测部，其以所述扩增产物的表达模式作为指标来整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。

按照图12的流程图，对本系统进行说明。

(A)隔室准备部中，准备多个隔室，每1个隔室包含单个细胞或来源于其的物质、第一微珠、和第二微珠。上述多个隔室优选通过对细胞群、多个第一微珠、及多个第二微珠进行分配处理来得到。此处，上述第一微珠是各自以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子，或者是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，并且，各隔室中的第一微珠的成像信息可彼此区分。此外，上述第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交。作为用作上述隔室准备部的设备，可举出流体聚焦装置等在使用了微流体技术的液滴制造方法中使用的装置。

(B)非破坏性测量信息及成像信息的测定部中，对准备各隔室前或各隔室中的、单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息一同进行测定，将单个细胞的非破坏性测量信息与第一微珠的成像信息进行关联。作为用于测定非破坏性测量信息的设备，可举出流式细胞仪装置或显微镜。需要说明的是，隔室为液滴或凝胶粒子等不会因非破坏性测量信息、成像信息测定而被破坏的形态时，细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息可在一次测定后再次进行测定。从能够以时间序列的形式获得细胞的非破坏性测量信息的变化的方面来看，再次测定是有利的。

另外，在隔室中包含来源于细胞的物质的情况下，优选在准备隔室前实施单个细胞的非破坏性测量信息及第一微珠的成像信息的测定及关联。因此，可以于在(A)隔室准备部中准备隔室之前，在(B)非破坏性测量信息及成像信息的测定部中，实施单个细胞的非破坏性测量信息和第一微珠的成像信息的测定及关联。

(C)杂交复合物形成部中，从上述关联的第一微珠切割固有的第一条形码核酸，使上述基因组相关核酸及第一条形码核酸分别与第二条形码核酸杂交而得到杂交复合物。作为用于形成杂交复合物的设备、试剂，可举出与第一条形码核酸连接的可切割接头的切割装置、及用于形成杂交复合物的试剂、装置。上述可切割接头的切割装置可以根据可切割接头的种类而适当选择，例如，该可切割接头为可紫外线切割的接头(例如，iSpPC(Integrated DNA Technologies公司))时，可举出紫外线照射装置(例如，安装有BlackRay氙气灯的装置)。另外，作为形成杂交复合物的试剂，可举出通常的核酸的杂交中使用的试剂，作为装置，可举出水浴等。

(D)扩增产物制造部中，可制造来源于上述杂交复合物的扩增产物。作为扩增产物的制造，例如，基因组相关核酸为RNA时，可举出逆转录及PCR，基因组相关核酸为DNA时，可举出延伸PCR。作为用于制造扩增产物的试剂，可举出通常的逆转录或PCR反应中使用的试剂，作为设备，可举出PCR装置。

(E)非破坏性测量信息及基因组相关信息的检测部中，以上述扩增产物的表达模式作为指标来整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息。基因组相关信息可通过用测序仪确定基因组相关核酸的序列信息来得到。可利用计算机将得到的基因组相关信息与单个细胞的非破坏性测量信息进行关联。

需要说明的是，上述系统的方式可按照本发明的关于检测方法的记载实施。

组合物

作为本发明的其他实施方式，有用于整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的、第一微珠及第二微珠的组合物，其特征在于，第一微珠是以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子、或是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交，所述组合物能以来源于第一条形码核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第一扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的非破坏性测量信息，且以来源于所述基因组相关核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第二扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的基因组相关信息。另外，本发明的组合物只要用于整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息即可，没有特别限定，可以是1种组合物或试剂等药剂的形态，也可以由多种组合物或试剂等药剂的组合构成。另外，上述组合物可以以整体的或独立个体的形式构成。作为上述多种或独立个体形式的组合物的组合，可举出例如含有第一微珠而成的组合物、与含有第二微珠而成的组合物的组合。此处，上述组合物也可以是用于在整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法中使用的试剂盒。该试剂盒可具备缓冲液、逆转录反应或PCR反应所需要的试剂、细胞溶解缓冲液等必需的试剂、使用说明书等。

含有第一微珠而成的检测剂

作为本发明的其他实施方式，有含有第一微珠而成的检测剂，其与第二微珠一同使用，用于整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息，其特征在于，第一微珠是以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子、或是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交，所述检测剂能以来源于第一条形码核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第一扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的非破坏性测量信息，且以来源于所述基因组相关核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第二扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的基因组相关信息。

含有第二微珠而成的检测剂

含有第二微珠而成的检测剂，其与第一微珠一同使用，用于整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息，其特征在于，第一微珠是以可切割的方式连接于与各成像信息对应的第一条形码核酸的粒子、或是各自含有与各成像信息对应的第一条形码核酸的生物，第二微珠与多条第二条形码核酸连接，所述第二条形码核酸能和与细胞基因组或其表达产物对应的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交，所述检测剂能以来源于第一条形码核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第一扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的非破坏性测量信息，且以来源于所述基因组相关核酸与第二条形码核酸形成的杂交复合物的第二扩增产物的表达模式作为指标来检测单个细胞的基因组相关信息。

获得针对被测物质的单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法

另外，作为本发明的其他方式，可提供使用本发明的整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法来获得针对被测物质的单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法。上述的获得针对被测物质的单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法的特征在于，在隔室中，使单个细胞或来源于其的物质、上述第一微珠、及上述第二微珠一同与上述被测物质共存。使被测物质共存的时机(例如，添加的时机)可举出隔室的形成前、形成时、或形成后。另外，作为被测物质，可举出低分子化合物、肽、蛋白质、核酸、病毒等药剂等。各隔室中的被测物质可以相同或不同。另外，被测物质的浓度也可以在各隔室中相同或不同。

此外，可使用上述方法中得到的针对被测物质的单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息，实施被测物质的筛选等分析。可以根据得到的细胞的基因组相关信息及/或非破坏性测量信息，测量该细胞针对被测物质的应答(例如，分子表达·局部存在、形态、分化的变化等)，并基于该应答的测量结果实施被测物质的筛选等分析。

上述的组合物、含有第一微珠而成的检测剂、含有第二微珠而成的检测剂、获得方法的方式均可按照本发明的关于检测方法的记载实施。

实施例

以下，基于实施例具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。另外，只要没有特别提及，则本发明的测定方法及单位遵循日本工业标准(JIS)的规定。

例1：第一微珠的制备

第一微珠的制备

首先，制备荧光标记海藻酸钠溶液。具体而言，向2质量％海藻酸钠溶液中以所期望的浓度添加荧光色素，制备绿色、红色或蓝色的荧光海藻酸钠溶液。需要说明的是，作为绿色的荧光色素，使用了5FTSC(荧光素-5-氨基硫脲)；作为红色的荧光色素，使用了AF555酰肼；作为蓝色的荧光色素，使用了Cascade Blue酰肼。

接着，制备连接有第一条形码核酸的海藻酸钠溶液。具体而言，向海藻酸钠溶液中添加N-β-马来酰亚胺基丙酸酰肼(BMPH)，制备BMPH-海藻酸钠溶液。向得到的BMPH-海藻酸钠溶液中添加5’末端经硫醇修饰的第一条形码核酸，制备连接有第一条形码核酸的海藻酸钠溶液。

将由荧光海藻酸钠溶液与连接有第一条形码核酸的海藻酸钠溶液形成的2质量％海藻酸钠混合液、与Ca-EDTA溶液(50mM-EDTA/50mM氯化钠pH7.2)等量混合，得到分散相溶液。此处，第一条形码核酸具有在相同颜色的荧光方面共通的第一共通条形码区。接着，按照E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling ofIndividual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法将分散相溶液添加至连续相溶液(含有表面活性剂的氟系油)中，使所得到的混合液中形成液滴。接着，向该混合液中以成为0.05％的方式添加乙酸，使Ca自Ca-EDTA游离，使液滴凝胶化从而生成连接有第一条形码核酸的荧光海藻酸微珠(以下也称为第一微珠、或者绿色、红色或蓝色荧光第一微珠)。混合液中的第一微珠使用1H,1H,2H,2H全氟辛醇洗涤并进行分离。

微珠的荧光稳定性的确认

向5mL的TEBST缓冲液(10mM Tris-HCl[pH8.0]，137mM NaCl，2.7mM KCl，及0.1％(v/v)Triton X-100)中添加约10,000,000个第一微珠(绿色、红色或蓝色荧光第一微珠)并使其悬浮。于自添加至缓冲液起0小时及72小时的时间点，利用流式细胞仪确认第一微珠的亮度。结果，于0小时及72小时的时间点未确认到荧光光谱的变化。

例2：隔室(包含第一微珠、第二微珠及细胞的油包水型液滴)的制备

按照E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling ofIndividual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法，通过使用了微流体技术的液滴制造方法制备包含例1中得到的第一微珠、第二微珠(Chemgenes)及NIH3T3细胞的油包水型隔室。此处，第二微珠的第二条形码核酸介由接头与第二微珠连接。该第二条形码核酸自第二微珠侧起依次为7个碱基的多聚胸腺嘧啶、25个碱基的PCR引物区、12个碱基的第二共通条形码区、8个碱基的第二固有条形码区、及30个碱基的多聚胸腺嘧啶(第二杂交区)。得到的隔室的照片示于图13。

例3：担载有第一微珠的细胞的制备

(a)担载有绿色荧光第一微珠的NIH3T3细胞

将自培养板剥离并经CellCover固定的NIH3T3细胞5×10⁵个和例1中得到的绿色荧光第一微珠5×10⁵个于4℃孵育40小时后，进而于4℃以150G离心1小时从而促进粘接，得到担载有绿色荧光第一微珠的NIH3T3细胞。构成绿色荧光第一微珠的海藻酸含有50％的经BAM试剂(细胞膜修饰剂)修饰的海藻酸。得到的细胞的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片示于图14A。

(b)担载有红色荧光第一微珠的K562细胞

除了使细胞为K562细胞、第一微珠为红色荧光第一微珠以外，利用与(a)同样的方法，得到担载有红色荧光第一微珠的K562细胞。得到的细胞的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片示于图14B。

(c)担载有绿色荧光第一微珠及红色荧光第一微珠的MIA-PaCa2细胞

除了使细胞为MIA-PaCa2细胞、第一微珠为绿色荧光第一微珠及红色荧光第一微珠以外，利用与(a)同样的方法，得到担载有绿色荧光第一微珠及红色荧光第一微珠的MIA-PaCa2细胞。得到的细胞的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片示于图14C。

例4：得到来自第一微珠的成像信息及与其对应的第一共通条形码区的验证

隔室(含有包含细胞的第一微珠、及第二微珠的隔室)的制备

除了向分散相溶液中添加细胞(NIH3T3细胞、K562细胞或MIA-PaCa2细胞)以外，通过与例1同样的方法，制备绿色、红色或蓝色荧光第一微珠。因此，上述第一微珠为包含细胞的微珠。需要说明的是，使相同颜色的第一微珠各自包含相同种类的细胞。结果示于图15。图15A示出了相位差显微镜下的观察结果，图15B示出了通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片。

接着，按照E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide ExpressionProfiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法，通过使用了微流体技术的液滴制造方法制备含有包含上述细胞的第一微珠、及例2中记载的第二微珠(Chemgenes)的隔室。另外，还制备了除了不包含第一微珠以外与上述同样的隔室。此处，不包含第一微珠的隔室与上述包含第一微珠的隔室同样地包含细胞。

对来源于上述中得到的隔室中的杂交复合物的扩增产物进行全测序的碱基序列分析。计数其中具有包含第一共通条形码区的序列的15个碱基的读段(read)数量。其结果示于表1。

[表1]

如上述结果所示，成功读取了与第一微珠的成像信息对应的第一共通条形码区。

例5：第一微珠的成像信息与细胞的基因组相关信息相关联的验证

按照E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling ofIndividual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)或T.M.Gierahn等，Seq-Well:portable,low-cost RNA sequencing of single cells athigh throughput,Nature Methods,14,395-398(2017)中记载的方法，通过使用了微流体技术的液滴制造方法制备包含例3中得到的担载有第一微珠的细胞及例2中记载的第二微珠的隔室。此处，作为担载有第一微珠的细胞，使用了担载有绿色荧光第一微珠的NIH3T3细胞(小鼠源细胞)及担载有红色荧光第一微珠的K562细胞(人源细胞)的混合物。在隔室的制备中，以各隔室中包含担载有绿色荧光第一微珠的NIH3T3细胞、及担载有红色荧光第一微珠的K562细胞中的任一者的方式进行制备。

然后，对来源于得到的隔室中的杂交复合物的扩增产物的碱基序列进行分析。具体而言，基于红色荧光第一微珠所归属的隔室中、与红色荧光第一微珠(其中，微珠上连接有多条第一条形码核酸)的第一共通条形码区10个碱基匹配的读段的数量进行排序，按排位高低顺序选取100个。进一步，对这些读段所归属的隔室内的基因转录产物的个数进行测定。结果示于图16。对于图中的绘图而言，纵轴表示小鼠基因转录产物的数量，横轴表示人基因转录产物的数量。由图16可知，第一微珠的成像信息与细胞的基因组相关信息相关联。

例6：含有与成像信息对应的第一条形码核酸的生物

制备含有具有荧光蛋白基因区及第一共通条形码区的质粒的细菌。具体而言，制备含有具有EGFP蛋白基因区及与EGFP对应的第一共通条形码区的质粒、具有Venus蛋白基因区及与Venus对应的第一共通条形码区的质粒、或具有EBFP蛋白基因区及与EBFP对应的第一共通条形码区的质粒的细菌。得到的细菌的混合物的通过用荧光显微镜及明视野显微镜拍摄而得到的复合照片示于图17A。

图17B中，示出了具有EGFP蛋白基因区及与EGFP对应的第一共通条形码区的质粒序列的测序结果。确认到继EGFP蛋白基因区之后为细菌的菌落各自所特有的序列区域(第三固有条形码区)、与EGFP对应的第一共通条形码区、及多聚A序列区。

按照E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling ofIndividual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法，通过使用了微流体技术的液滴制造方法制备包含含有第一条形码核酸的细菌及细胞的油包水型隔室。得到的隔室的照片示于图17C。然后，对来源于得到的隔室中的杂交复合物的扩增产物的大小进行测定。结果，检测到包含第三固有条形码区的序列和与EGFP对应的第一共通条形码区的288个碱基。结果示于图17D。

附图标记说明

101 细胞群

102 第一微珠

103 第二微珠

104 隔室

105 单个细胞

106 第一条形码核酸

107 来自细胞的mRNA

108 第二条形码核酸

109 针对第一条形码核酸的cDNA

110 针对来自细胞的mRNA的cDNA

111 扩增产物

112 第一扩增产物

113 第二扩增产物

114 细胞的非破坏性测量信息

115 细胞的转录组信息

116 聚类

117 细胞类型

120 杂交复合物

201 第一微珠

202 第一条形码核酸

203 第一共通条形码区

204 第一杂交区

205 可切割的接头

301 第二微珠

302 第二条形码核酸

303 第二共通条形码区

304 第二固有条形码区

305 第二杂交区

306 PCR引物区

400 与第一条形码核酸连接的第一微珠

401 第一微珠

402 第一条形码核酸

403 第一共通条形码区

404 第一杂交区

405 可切割的接头

410 与第二条形码核酸连接的第二微珠

411 第二微珠

412 第二条形码核酸

413 第二共通条形码区

414 第二固有条形码区

415 第二杂交区

416 PCR引物区

420 细胞

421 基因组相关核酸的特定的序列

422 基因组相关核酸

430 隔室

500 与第一条形码核酸连接的第一微珠

501 第一微珠

502 第一条形码核酸

503 第一共通条形码区

504 第一杂交区

505 可切割的接头

510 与第二条形码核酸连接的第二微珠

511 第二微珠

512 第二条形码核酸

513 第二共通条形码区

514 第二固有条形码区

515 第二杂交区

516 PCR引物区

520 核酸探针

521 能与在单个细胞中表达的目标蛋白等分子特异性结合的分子

522 第三条形码核酸

523 第三共通条形码区

524 第三杂交区

525 可切割的接头

530 细胞

540 隔室

600 与第一条形码核酸连接的第一微珠

601 第一微珠

602 第一条形码核酸

603 第一共通条形码区

604 第一杂交区

605 可切割的接头

606 特定的序列

607 与特定的序列互补的序列的引物

610 与第二条形码核酸连接的第二微珠

612 第二条形码核酸

615 第二杂交区

700 与第一条形码核酸连接的第一微珠

701 第一微珠

702 第一条形码核酸

703 第一共通条形码区

704 第一固有条形码区

705 第一杂交区

706 可切割的接头

707 丙烯酰胺部分

708 PCR引物区

710 与第二条形码核酸连接的第二微珠

711 第二微珠

712 第二条形码核酸

713 第二共通条形码区

714 第二固有条形码区

715 第二杂交区

716 PCR引物区

720 细胞

721 来自细胞的mRNA

722 DNA聚合酶

723 互补链DNA

724 针对来自细胞的mRNA的cDNA

801 细胞

802 与第一条形码核酸连接的第一微珠

803 与第二条形码核酸连接的第二微珠

804 荧光成像测定

805 明视野成像

806 油

807 隔室

808 出口

901 细胞

902 与第一条形码核酸连接的第一微珠

903 与第二条形码核酸连接的第二微珠

904 油

905 隔室

906 出口

907 凝胶化的粒子

908 细胞溶解缓冲液

909 荧光成像测定

910 油

911 隔室

1001 细胞

1002 与第一条形码核酸连接的第一微珠

1003 与第二条形码核酸连接的第二微珠

1004 油

1005 隔室

1006 出口

1007 凝胶化的粒子

1008 细胞溶解缓冲液

1009 荧光成像测定

1010 隔室

1101 细胞

1102 与第一条形码核酸连接的第一微珠

1103 荧光成像测定

1104 担载有第一微珠的细胞

1105 与第二条形码核酸连接的第二微珠

1106 细胞溶解缓冲液

1107 隔室

1108 油

1109 出口