一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法
阅读说明：本技术 一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法 (Sea squirt antioxidant polypeptide and preparation method thereof ) 是由 卜迁 麻蕊 侯青 高鸿 于 2021-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法,所述抗氧化多肽的氨基酸序列为Ile-Ser-Trp。以海鞘内囊肉块为原料,采用复合蛋白酶对其进行酶解,分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。本发明抗氧化多肽缓解了人工抗氧化剂可能引起的副作用,提供了一种新的天然抗氧化剂,可以取代传统的合成食品抗氧化剂。(The invention discloses ascidian antioxidant polypeptide and a preparation method thereof, wherein the amino acid sequence of the antioxidant polypeptide is Ile-Ser-Trp. The sea squirt inner bag meat blocks are used as raw materials, and are subjected to enzymolysis by adopting compound protease, separation and purification, and freeze drying to obtain the antioxidant polypeptide. The antioxidant polypeptide relieves the possible side effect caused by artificial antioxidant, provides a new natural antioxidant, and can replace the traditional synthetic food antioxidant.)
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，具体涉及一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法。背景技术
人体每天都会产生大量的自由基，环境因素也会促进人体生成自由基，自由基氧化能力极强，适量的自由基是人体的卫士，可杀灭细菌、病毒，分解毒物，但过量的自由基却会氧化人体正常物质，破坏细胞结构，促使细胞恶变，引起机体细胞和组织损伤，自由基的负面作用与人体的衰老和许多健康疾病有关，如糖尿病、癌症、神经退行性疾病等。
人体内存在一些天然的抗氧化剂可以消除自由基对人体的危害，例如维生素C和维生素E，一些合成抗氧化剂也能起到清除自由基的作用。但研究表明，人工合成抗氧化剂对人体具有一定的毒副作用。例如2-叔丁基对苯二酚(TBHQ)导致DNA损伤对动物有致突变的可能，2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)有致癌作用，没食子酸丙酯(PG)对肾脏有损害同等。为缓解众人对人工合成抗氧化剂安全性的担忧，开发天然抗氧化剂越来越受到食品工业和科学界的关注。蛋白质经过酶水解后得到生物活性多肽，多肽中的氨基酸残基赋予蛋白质本身不具备的某些生物学活性，例如抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、免疫调节等。抗氧化肽是一类具有清除基体自由基、抑制延缓脂质过氧化以及与金属离子螯合等能力的生物活性肽。
海洋作为地球最庞大的生态系统，蕴藏着极其丰富的生物资源，海洋生物为了适应纷繁复杂的海洋环境，产生了大量异于陆地生物的功能性物质。目前已从海洋生物中分离出多种具有良好抗氧化活性的多肽。海鞘俗称海凤梨，种类约有1500种，常附着在舰船底部、海底礁石上。真海鞘是其中广泛食用养殖的经济海产品。真海鞘中蛋白质含量占34％，是除水分外含量最多的物质，但对真海鞘中抗氧化活性肽的研究较少。如何从可食用的真海鞘中获取具有特定氨基酸序列的高效抗氧化多肽就成为迫切的研究方向。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种从真海鞘内囊中制备抗氧化多肽的方法，用天然抗氧化剂代替合成抗氧化剂，为开发基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定基础。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种海鞘抗氧化多肽，其氨基酸序列为Ile-Ser-Trp。
在本发明的另一方面，提供了所述海鞘抗氧化多肽的制备方法，以海鞘内囊肉块为原料，采用中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。
本发明采用复合蛋白酶，作为一种内切酶，作用于蛋白质分子内部肽键，不会切割末端产生游离氨基酸，保证产生的都是多肽链。同时酶法制备活性肽中最明显的副作用是在酶切过程中，会出现漏切位点和非专一性酶切位点，最终无法保证绝对把蛋白质酶切为常规的肽段，造成许多不必要的产物生成。不同种类酶的切割位点不同，复合蛋白酶中含有多种单酶，含有多种酶切位点，防止漏切位点。其中的风味蛋白酶对水解的苦味和风味起着优化作用，广泛应用于动物蛋白的水解。
所述海鞘抗氧化多肽的制备方法具体包括以下步骤：
1)取真海鞘内囊，去除内脏和筋膜，煮沸灭酶，制得海鞘内囊肉块；
2)肉块破碎后置于石油醚中除脂、加入乙醇除色素，制得海鞘粗蛋白；
3)采用复合蛋白酶酶解海鞘内囊蛋白，酶解后沸水浴灭酶，冷却至室温，离心取上清液待用；
4)用卷式聚砜超滤膜进行超滤，得到不同分子量的多肽组分；
5)蒸发浓缩后的超滤液在真空下进行冷冻干燥，得到多肽组分；
6)采用DPPH和ABTS自由基活性测定，选取活性最高的组分；
7)通过柱层析进行分离纯化，冷冻干燥后测定各吸收峰对应洗脱液的抗氧化活性，收集得到的抗氧化活性最高的组分；
8)使用C18色谱柱和DPPH消去法确定抗氧化活性峰，收集抗氧化多肽。
进一步的，步骤1)中采用超纯水100℃煮15min灭酶。
进一步的，步骤3)中酶解条件为：水浴加热保持温度为50℃，酶与底物的比例为1:4。
进一步的，步骤4)中卷式聚砜超滤膜的截留量包括30kDa、5kDa、1kDa和500Da；得到的多肽组分包括分子量为30kDa-5kDa、5kDa-1kDa、1kDa-500Da以及<500Da的多肽。
进一步的，步骤5)中蒸发浓缩条件为：55℃，压力为0.1Mpa。
进一步的，步骤7)中固定相为葡聚糖凝胶G-25，流动相为超纯水，其中凝胶柱体积为500ml，进样量为24ml，进样浓度为20mg/ml，流速为1.5ml/min，检测波长280nm。
本发明的有益效果为：
本发明从可食用的真海鞘内囊中制备出一条氨基酸序列为Ile-Ser-Trp的高效抗氧化多肽，提供了一种新的天然抗氧化剂，可以替代合成抗氧化剂，打消了人们对人工合成抗氧化剂安全问题的担忧，同时满足了抗氧化剂的市场需求。同时开发出一种针对真海鞘内囊抗氧化肽的制备及分离纯化方法，提高了真海鞘加工的附加值，拓宽了海洋天然产物的研究。
附图说明
图1为本发明实施例1超滤后各个组分的ABTS自由基清除活性；
图2为本发明实施例1超滤后E组分(<500Da)的DPPH自由基清除活性；
图3为本发明实施例1Sephadex G-25分离纯化图谱；
图4为本发明实施例1Sephadex G-25分离纯化后各个组分的自由基清除活性；
图5为本发明实施例1DPPH消去法确定抗氧化活性峰；
图6为合成多肽Ile-Ser-Trp的自由基清除能力。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
海鞘抗氧化多肽的制备，包括以下步骤：
1)真海鞘处理：真海鞘解冻后去除外壳取内囊，去除内囊中的内脏、筋膜，加超纯水100℃煮15min灭酶，制得海鞘内囊肉块待用。
2)除杂：肉块破碎后置于石油醚中除脂、加入乙醇除色素，制得海鞘粗蛋白，待用。
3)海鞘内囊蛋白的酶解：采用复合蛋白酶酶解海鞘内囊蛋白，pH为7.0，水浴加热保持温度为50℃，酶与底物的比例为1:4，酶解7h后沸水浴15min灭酶，迅速冷却至室温，12000rpm/min，离心15min，取上清液待用；
其中复合蛋白酶，购自江苏锐阳生物科技(中国·无锡)。
4)超滤：用截留量分别为30kDa、5kDa、1kDa、500Da的卷式聚砜超滤膜进行超滤，制得分子量分别为30kDa-5kDa、5kDa-1kDa、1kDa-500Da以及<500Da的4个组分超滤液(A、B、C、D、E)，其ABTS自由基清除活性如图1所示。分子量<500Da的多肽组分的DPPH自由基清除活性如图2所示。
其中卷式聚砜超滤膜分子截留量可替换为20k-800Da。
5)蒸发浓缩：设置旋转蒸发仪温度为55℃，压力为0.1Mpa，分别蒸发浓缩4个组分的超滤液。
6)冷冻干燥：旋转蒸发后的超滤液在真空下，温度为-80℃进行冷冻干燥，制得4个组分的多肽粉末。
7)抗氧化活性测定：DPPH和ABTS自由基活性测定，选取活性最高的组分。
8)凝胶柱层析：最佳抗氧化活性的组分E通过柱层析进行分离纯化，固定相为葡聚糖凝胶G-25，流动相为超纯水，冷冻干燥后测定各吸收峰对应洗脱液的抗氧化活性，收集得到的抗氧化活性最高的组分。
其中凝胶柱体积为500ml，进样量为24ml，进样浓度为20mg/ml，流速为1.5ml/min,检测波长280nm，得到F1、F2两个吸收峰(图3)。DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力见附图4。
另外本发明还可选用其他层析方法，如离子层析、疏水层析。
9)反相高效液相色谱RP-HPLC：选取最佳抗氧化活性组分F2，使用C18色谱柱采用DPPH消去法确定抗氧化活性峰(图5)。
10)质谱鉴定：通过LC-MS/MS鉴定其分子量为405Da，氨基酸序列为Ile-Ser-Trp。
实施例2抗氧化活性测定
1)DPPH自由基清除能力
95％乙醇配制浓度为0.1mM的DPPH自由基溶液，不同浓度的样品与DPPH以1:1的比例混合，室温避光反应30min后517nm处测定吸光值。空白组用同等体积的95％乙醇代替样品，样品的DPPH自由基清除能力按下式计算：
式中，Acontrol为空白组吸光值，Asample为实验组吸光值。
2)ABTS自由基清除能力
超纯水配制浓度为7mM的ABTS溶液及2.45mM的过硫酸钾溶液，以1:1的比例混合，室温避光孵育12-16h后，得到ABTS自由基母液。用磷酸盐缓冲溶液(5mM，pH7.4)稀释至734nm处吸光值为0.70±0.02，得到ABTS自由基工作液，现配现用。实验组为0.1ml样品与3.9mlABTS工作液，室温反应6min后734nm处测定吸光值。空白组用同等体积的超纯水代替样品，样品的ABTS自由基清除能力按下式计算：
式中，Acontrol为空白组吸光值，Asample为实验组吸光值。
3)利用UPLC/Q-TOF-MS鉴定实施例1得到的抗氧化多肽的氨基酸全序为Trp-Leu-Pro，分子量为405Da。测定其抗氧化活性见附图6所示，其中DPPH自由基清除率为58％，ABTS自由基清除率为64％，抗氧化活性与阳性对照谷胱甘肽(GSH)接近。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Ser Trp
1