阅读说明：本技术 大豆角质层蜡质合成基因或其蛋白的应用 (Application of waxy synthetic gene of soybean cuticle or protein thereof ) 是由 冯献忠 杨素欣 高金珊 宋晓峰 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及遗传育种技术领域,尤其涉及大豆角质层蜡质合成基因或其蛋白的应用。本发明研究表明,来源于大豆的编码甘油三磷酸激酶的GmGK1基因能够调控大豆叶表面角质层蜡质的发育,因此可以用于实现提高大豆抗旱及抗病能力。研究表明,过量表达GmGK1基因的gmgk1突变体植株叶片皱缩恢复正常,与野生型大豆叶片形态一致。利用GmGK1作为标志物,能够实现对植物种质,特别是大豆种质抗旱性能的鉴定。(The invention relates to the technical field of genetic breeding, in particular to an application of a waxy synthetic gene of soybean cuticle or a protein thereof. The research of the invention shows that the GmGK1 gene which is derived from soybean and codes glycerol triphosphate kinase can regulate and control the development of the cuticle wax of the soybean leaf surface, thereby being used for realizing the improvement of the drought resistance and disease resistance of the soybean. Research shows that the shriveling of the leaf of the GmGK1 mutant plant with the overexpression of the GmGK1 gene is recovered to be normal and is consistent with the shape of the wild soybean leaf. The GmGK1 is used as a marker, so that the identification of the drought resistance of plant germplasm, particularly soybean germplasm, can be realized.)

大豆角质层蜡质合成基因或其蛋白的应用

技术领域

本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及大豆角质层蜡质合成基因或其蛋白的应用。

背景技术

大豆(Glycine max)作为古老的农作物，具有重要的且特殊的经济价值，其对缺水较为敏感，且耐高温能力较弱。大豆在生育期遭遇干旱、高温、盐碱等非生物逆境胁迫是造成大豆减产的重要影响因素。因此，提高大豆抗旱能力已经成为现代育种工作中的关键问题之一。

角质层对于植物最重要的作用是应对干旱的威胁，也具有防御机械损伤，抵抗病菌和昆虫的侵袭，阻挡紫外线等功能。角质层的显微结构分为角质和蜡质两层，蜡质在角质最表层形成蜡质晶体，渗透于网架状结构的角质中称之为内层蜡质。陆地植物角质层的主要任务就是防止体内水分的非气孔性蒸发，使得植物可以通过气孔开闭动态调节气体交换以及水势等。植物在不断进化过程中为应对环境变化角质层又衍生出一系列其他功能，如：是植物应对病原菌及昆虫胁迫的第一道物理屏障；最表面的蜡质晶体够阻止灰尘等在叶表皮的附着；屏蔽紫外线，减小紫外线损伤；作为表皮细胞的附属物在器官发育中起着决定边界的作用。

角质层生物合成的调控很复杂，涉及很多信号途径包括：对环境胁迫的应答，对病原体的应答以及角质层自身基于结构以及完整性的反馈性调节。除此之外，角质层的成分均由表皮细胞合成，表皮细胞与其他细胞的区别也是角质层合成调控的一部分。此前有研究表明，Glyma.07G028600基因的突变导致了角质层中蜡质的成分比例发生了很大的变化，同时又影响了角质的发育。

研究影响角质蜡质合成及调控相关基因及其作用机制，不仅能进一步充分认知植物角质层形成和调控过程，也为进一步改良大豆抗旱、抗病能力提供基因资源。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供大豆角质层蜡质合成基因或其蛋白的在大豆亚角质层发育和叶片发育过程中的应用。

本发明提供了如下I)～V)中的至少一种在调控植物蜡质形成中的应用；

I)、GmGK1蛋白；

II)、在GmGK1蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且与GmGK1具有相同或相似功能的蛋白；

III)、编码I)或II)所述蛋白的核酸分子；

IV)、在III)的所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；

V)、能够调控I)～V)中的至少一种的水平或活性的物质。

本发明中，所述GmGK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

编码SEQ ID NO:1所示蛋白的核酸分子的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明中，所述植物为豆科植物；本发明中用以验证GmGK1功能的植物为豆科植物大豆，具体为大豆Williams 82和菏豆12。研究表明，Williams 82和菏豆12中GmGK1蛋白及核酸序列完全一致。

本发明中，所述调控植物蜡质形成包括：调控蜡质晶体堆积，调控烷烃类物质形成和/或调控三萜类物质的形成。本发明中，所述调控包括正相调控或负向调控两个方面。gmgk1突变体表型的Glyma.07G028600基因，该基因在外显子处缺失TCTTTTATCC十个碱基并且***一个A碱基研究表明，GmGK1基因的突变体较野生型菏豆12表皮层变薄，密度变低，叶表面蜡质晶体堆积变得稀疏，叶片皱缩。而过表达GmGK1基因的gmgk1突变体植株叶片皱缩恢复正常。因此证明过表达GmGK1基因、促进GmGK1基因的转录水平、提高GmGK1蛋白水平或促进GmGK1蛋白活性有利于叶表面蜡质的积累与堆积、促进烷烃类物质的形成、降低三萜类物质的含量。而敲除或敲低GmGK1基因、抑制GmGK1基因的转录水平、降低GmGK1蛋白水平或抑制GmGK1蛋白活性则会抑制叶片表面蜡质的积累与堆积、抑制烷烃类物质的形成。

本发明还提供了一种促进植物蜡质形成的制剂，其包括如下i)～v)中的至少一种：

i)、GmGK1蛋白或编码GmGK1蛋白的核酸分子；

ii)、包含编码GmGK1蛋白的核酸的表达载体；

iii)、含有ii)的重组宿主；

iv)、增强GmGK1基因表达的启动子或增强子；

v)、促进GmGK1基因表达的诱导剂；

vi)、提高GmGK1蛋白活性的制剂。

植物表皮蜡质层的积累有利于对抗干旱胁迫、防御机械损伤、抵抗病菌或昆虫的侵袭，并能够阻挡紫外线。本发明所述的制剂能够用于提高植株或种质的内源GmGK1蛋白的水平和/或活性，或使不含有GmGK1的植物表达GmGK1蛋白，故而能够起到提高植物抗干旱胁迫能力、提高抗病能力、提高防御机械损伤能力的作用。

本发明所述的制剂中，GmGK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码GmGK1蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

包含编码GmGK1蛋白的核酸的表达载体的骨架载体为植物表达载体，在本发明中，采用pCAMBIA3301H载体进行功能验证。

含有上述表达载体的重组宿主为农杆菌，本发明所述的促进植物蜡质形成的方法采用农杆菌介导法将含有编码GmGK1蛋白的核酸分子的表达载体转化入植物外植体。作为受体材料的外植体为胚轴细胞。

本发明所述的制剂在提高植物抗旱和/或抗病能力中的应用。

本发明还提供了一种提高植物抗旱和/或抗病能力的方法，其以本发明所述的制剂，提高植物内源GmGK1蛋白的水平和/或活性，或者使不含有GmGK1或GmGK1失活的植物表达GmGK1蛋白。

本发明中，所述提高植物抗旱和/或抗病能力，是指对现有的种质进行育种改良，从而获得新的具有更良好抗旱能力和/或抗病能力的新品种。或者是指对植株施与能够促进GmGK1基因表达的诱导剂或者提高GmGK1蛋白活性的制剂，从而提高植株的抗旱和/或抗病能力。

一些具体实施例中，使GmGK1失活的植物表达GmGK1蛋白的方法包括：

构建包含编码GmGK1蛋白的核酸的载体，转化入农杆菌；以所述农杆菌感染植物种子或外植体。

并且，GmGK1还可作为植物育种筛选中，鉴定蜡质形成能力的标志物。

本发明还提供了一种鉴定植物蜡质形成能力的制剂，其包括：

检测植物种质的GmGK1基因转录水平的制剂；

和/或检测GmGK1蛋白的表达水平或活性制剂。

本发明所述的制剂在鉴定植物种质抗旱和/或抗病能力中的应用。

本发明还提供了一种鉴定植物种质抗旱和/或抗病能力的方法，其以本发明所述的制剂检测GmGK1基因转录水平或检测GmGK1蛋白的表达水平或活性。

本发明所述检测包括表达量或活性水平的检测。例如，对GmGK1蛋白表达水平的检测采用Western blot的方法；对GmGK1基因转录水平的检测采用real-time PCR的方式。利用本发明所述的鉴定方法，仅对植物幼嫩组织进行检测就可实现对该种质抗旱和/或抗病能力的预测，缩短育种周期。

本发明研究表明，来源于大豆的编码甘油三磷酸激酶的GmGK1基因能够调控大豆叶表面角质层蜡质的发育，因此可以用于实现提高大豆抗旱及抗病能力。研究表明，过量表达GmGK1基因的gmgk1突变体植株叶片皱缩恢复正常，与野生型大豆叶片形态一致。利用GmGK1作为标志物，能够实现对植物种质，特别是大豆种质抗旱性能的鉴定。

附图说明

图1示大豆GmGK1基因的基因组和转录序列，其中：粗体表示外显子序列，斜体表示内含子序列，

表示启动子，

表示终止子；

图2示带有GFP标签的GmGK1正义的表达载体pCAMBIA3301H-GmGK1；

图3示野生型菏豆12与gmgk1突变体离体叶片，标尺＝4cm；

图4示种植后17天下午17:00离体大豆第一对真叶TB染色，上为野生型，下位突变体，标尺＝3cm；

图5示过量表达GmGK1基因的gmgk1突变体植株叶片皱缩恢复正常，其中，植株1示野生型菏豆12叶片形态，植株2示gmgk1突变体叶片形态，植株3示过量表达GmGK1基因的gmgk1突变体叶片形态，标尺＝15cm；

图6示GmGK1基因影响角质层厚度和蜡质晶体堆积密度，其中，6-A为菏豆12和gmgk1突变体叶片上下表皮透射电镜，标尺为500nm；6-B为菏豆122和gmgk1突变体叶片表皮扫描电镜，标尺为500μm；

图7示野生型与gmgk1突变体角质层蜡质分析结果，其中，A示野生型与gmgk1突变体的蜡质总量，B示野生型与gmgk1突变体的蜡质组成；

图8示野生型和gmgk1突变体离体叶片失水速率。

具体实施方式

本发明提供了大豆角质层蜡质合成基因或其蛋白的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

所述编码GmGK1蛋白的核酸分子包括编码GmGK1蛋白的基因组DNA、cDNA、重组DNA或mRNA、hnRNA；或者与上述DNA、cDNA、重组DNA或mRNA呈反向互补的核酸分子。

上述核酸分子可根据实际需要进行修饰或优化，从而使基因表达更高效；例如，①可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmGK1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合受体植物的偏爱性。②或修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。③与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；④引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

本发明中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述的宿主可为真菌、细菌、藻类或细胞。

对于不含有GmGK1的植物，可采用化学法、鸟枪法、微注射，电穿孔等方法，将GmGK1的基因片段导入植物细胞，也可通过同源重组、锌指核酸酶、TALEN、CRISPR等方法将GmGK1的基因片段导入植物细胞。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1.大豆中GmGK1基因的分离和结构分析

(1)基因的分离

从大豆品种——菏豆12幼嫩叶片中,分离mRNA，以此mRNA为模板，以Oligo(T)17为引物合成cDNA第一条链。接着以该cDNA第一条链为模板，引物(5’-ATGTCGAAAGAGGATGTGTTTG-3’)和引物(5’-TCAAAGAGCAAGATCAGCTAAGTC-3’)进行PCR扩增，获得了1个GmGK1基因的长为1560bp的cDNA片段，克隆到pGEM T Easy载体(TaKaRa公司)中并命名为pGEM T Easy-GmGK1。

pGEM T Easy-GmGK1中所包含GmGK1CDS序列如SEQ ID NO:1所示，共1560bp，它编码一个519个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO:2)。

(2)基因的结构分析

以Williams82幼嫩叶片为材料，提取其中的DNA，接着以该基因组DNA为模板，扩增获得了GmGK1基因组的片段，GmGK1DNA序列如SEQ ID NO:3所示，共3186bp，它含有2个内含子和3个外显子(如图1)。

实施例2.大豆GmGK1基因正义表达载体的构建

将GmGK1的CDS和绿色荧光蛋白GFP的CDS融合正向连到植物表达载体pCAMBIA3301H(CAMBIA研究中心)中，得到带有GFP标签的GmGK1正义的表达载体，该载体全长为11.2Kbp(如图2)，在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性，在植物体中的抗性为草铵膦抗性。

实施例3.农杆菌介导法转化豆科植

在本实施例中，通过农杆菌介导法转化大豆胚尖的方法，得到含有GmGK1调控基因的正义表达载体的gmgk1突变体的外植体。

(A)大豆外植体的获得

通过250Gy伽马射线对黄淮海地区广泛种植大豆栽培品种菏豆12诱变了10000粒，M2突变体共鉴定出900多个株系的1298个突变体，从中筛选获得了叶片皱缩的突变体材料，种植4代后获得表型稳定的gmgk1突变体。将gmgk1突变体于远源品种Williams82杂交构建图位克隆群体，利用图位克隆成功鉴定了控制gmgk1突变体表型的Glyma.07G028600基因，该基因在外显子处缺失TCTTTTATCC十个碱基并且***一个A碱基。后文所述突变体皆是由菏豆12诱变而来，所述野生型均为未经诱变的菏豆12。

大豆gmgk1突变体与野生型菏豆12在种植44天后，R1期(始花期)第一三出复叶离体叶片表性差异。由图可知，突变体较野生型叶面积明显变小，叶柄较野生型更短。小叶在远轴端无法伸长，叶细胞在叶片发育过程中不断堆积，形成皱叶的表型(图3)。

对皱叶突变体与野生型种植17天后的下午17:00离体大豆的第一对真叶进行TB染色，突变体的叶边缘渗透性增强，表明其叶边缘已经坏死(图4)。

选取表面光滑、无破损、无病斑、无裂痕的gmgk1突变体成熟大豆种子，以氯气方法灭菌14h。将灭菌后的种子在超净台上通风，使氯气完全挥发，在萌发培养基萌发处理6h。去掉大豆1/2胚轴，将大豆沿胚轴纵向切开，将剩余下胚轴作为农杆菌介导转化的受体材料。

(B)大豆转化

农杆菌介导法采用二次农杆菌侵染，在共培养基上于22℃暗培养5d；SI-I培养基中，于强光下培养7d；切去外植体(gmgk1突变体)大芽，在SI-II培养基中，于强光下培养14d；切去外植体子叶和胚轴，于SE培养基中，每14d继代一次；将约3cm丛生芽剪下，放入生根培养基中生根；将RM生根培养基中，根部生长发达的植株转入土中栽植。最终筛选得到了3个抗性植株，Bar检测这3株植物均为阳性。在温室中培养5个月后果荚开始成熟，6个月后收种完毕。

(C)可以遗传的转基因植株

将收获的T1代种子在温室中每个株系种植4株，可以观察到过量表达GmGK1基因的gmgk1突变体植株叶片皱缩恢复正常(如图5)，与菏豆12一致。

实施例4.大豆GmGK1基因的生物学意义

(A)透射电镜检测发现gmgk1突变体较野生型菏豆12表皮层变薄，密度变低，叶表面蜡质晶体堆积变得稀疏(图6)。通过气-质联用对野生型和gmgk1突变体角质层蜡质进行分析，结果表明，野生型和gmgk1突变体蜡质总量无明显差异，与野生型比较，gmgk1突变体蜡质中的烷烃类显著升高、三萜类物质显著降低(图7)。

(B)通过测定野生型菏豆12和gmgk1突变体离体叶片失水速率，发现gmgk1突变体叶片失水速率均明显快于野生型，表明gmgk1突变体角质层的缺陷导致非气孔性失水加剧(图8)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120> 大豆角质层蜡质合成基因或其蛋白的应用

<130> MP1926532

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 519

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

Met Ser Lys Glu Asp Val Phe Val Gly Ala Ile Asp Gln Gly Thr Ser

1 5 10 15

Ser Ser Arg Phe Ile Ile Tyr Asp Ala Lys Thr Gly Val Val Gly Cys

20 25 30

His His Val Glu Phe Thr Gln Phe Tyr Pro Gln Ala Gly Trp Val Glu

35 40 45

His Asp Pro Met Glu Ile Leu Glu Ser Val Lys Val Cys Val Ala Lys

50 55 60

Ala Val Asp Lys Ala Thr Ala Asp Gly Phe Asn Val Asp Lys Gly Leu

65 70 75 80

Lys Ala Ile Gly Leu Thr Asn Gln Arg Glu Thr Thr Leu Leu Trp Ser

85 90 95

Lys Ser Thr Gly Leu Pro Leu His Asn Ala Ile Val Trp Met Asp Ala

100 105 110

Arg Thr Ser Ser Ile Cys Arg Arg Leu Glu Lys Glu Leu Ser Gly Gly

115 120 125

Arg Asn His Phe Val Glu Ser Cys Gly Leu Pro Ile Ser Thr Tyr Phe

130 135 140

Ser Ala Leu Lys Leu Leu Trp Leu Met Glu Asn Val Asp Ala Val Lys

145 150 155 160

Glu Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ala Leu Phe Gly Thr Ile Asp Thr Trp

165 170 175

Leu Ile Trp Asn Leu Thr Gly Gly Val Asn Gly Gly Leu His Val Thr

180 185 190

Asp Val Ser Asn Ala Ser Arg Thr Met Leu Met Asn Leu Lys Thr Leu

195 200 205

Asp Trp Asp Ala Ser Thr Leu Lys Thr Leu Asn Ile Pro Ala Glu Ile

210 215 220

Leu Pro Asn Ile Val Ser Asn Ala Glu Ile Ile Gly Glu Val Gly Ser

225 230 235 240

Gly Trp Pro Ile Ala Gly Val Pro Ile Ala Gly Cys Leu Gly Asp Gln

245 250 255

His Ala Ala Met Leu Gly Gln Ser Cys Arg Lys Gly Glu Ala Lys Ser

260 265 270

Thr Tyr Gly Thr Gly Ala Phe Ile Leu Leu Asn Thr Gly Glu Gly Ile

275 280 285

Ile Gln Ser Lys His Gly Leu Leu Ser Thr Ile Ala Phe Lys Leu Gly

290 295 300

Pro Lys Ala Pro Thr Asn Tyr Ala Leu Glu Gly Ser Val Ala Ile Ala

305 310 315 320

Gly Ala Ala Val Gln Trp Leu Arg Asp Gly Leu Gly Ile Ile Ser Ser

325 330 335

Ala Ala Glu Ile Glu Glu Met Ala Leu Gln Val Glu Ser Thr Gly Gly

340 345 350

Val Tyr Phe Val Pro Ala Phe Asn Gly Leu Phe Ala Pro Trp Trp Arg

355 360 365

Glu Asp Ala Arg Gly Val Cys Ile Gly Ile Thr Arg Phe Thr Ser Lys

370 375 380

Gly His Ile Ala Arg Ala Val Leu Glu Ser Met Cys Phe Gln Val Lys

385 390 395 400

Asp Val Leu Asp Ser Met His Lys Asp Ser Gly Glu Ser Glu Ser Gln

405 410 415

Lys Thr Glu Phe Leu Leu Arg Val Asp Gly Gly Ala Thr Val Asn Asn

420 425 430

Leu Leu Met Gln Ile Gln Ala Asp Leu Val Gly Cys Pro Val Ile Arg

435 440 445

Pro Ala Asp Ile Glu Thr Thr Ala Leu Gly Ala Ala Tyr Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Ala Thr Gly Ile Trp Lys Glu Asp Phe Ile Phe Asn Thr Glu Glu

465 470 475 480

Lys Leu Lys Asn Ala Arg Val Phe Arg Pro Val Met Thr Glu Glu Val

485 490 495

Arg Lys Lys Lys Val Asp Ser Trp Cys Lys Ala Val Ser Lys Thr Phe

500 505 510

Asp Leu Ala Asp Leu Ala Leu

515

<210> 2

<211> 1560

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

atgtcgaaag aggatgtgtt tgttggcgcg atcgaccaag gaacgagcag cagcaggttc 60

ataatatacg acgcgaagac tggagtagta ggatgccacc acgtggagtt cacccagttc 120

tacccgcaag ccgggtgggt ggagcatgac cccatggaga tcttggagag tgtgaaggtg 180

tgcgtggcca aggccgtcga taaggccacc gctgatggct tcaacgtcga taaaggcttg 240

aaggccattg gtctcaccaa tcagagagag accactctcc tctggagcaa atccaccggc 300

ctccctcttc acaacgccat tgtttggatg gatgctcgca cttcttccat ttgcaggaga 360

ttggaaaagg agttatctgg cggtagaaac cattttgtgg agagttgtgg cttgcctatt 420

agcacatact tcagtgcttt gaagctgctg tggttgatgg aaaatgtaga tgccgtaaag 480

gaggccataa agaaaaagga tgcgctgttt ggaactattg acacttggtt gatatggaat 540

ctaactggtg gggtgaatgg gggattgcat gttaccgatg tttcaaatgc atctcgtaca 600

atgctcatga atctaaaaac ccttgactgg gatgcatcta ccttaaaaac ccttaatatt 660

cctgctgaaa ttttgcctaa tattgttagt aatgccgaaa ttataggaga ggttgggtct 720

ggatggccaa ttgctggtgt ccctattgct ggatgtttag gggatcaaca tgctgcaatg 780

ttaggacaat catgccgtaa aggggaggct aagagcactt atggcacagg tgctttcata 840

ctactaaata ctggtgaagg gataattcaa tcgaagcacg gtcttttatc cactatagct 900

ttcaagcttg gcccaaaagc tccaaccaat tatgcattgg aaggatcagt tgctattgct 960

ggagctgcag tgcagtggct tagagacggt cttggcatca tttctagtgc tgcagagata 1020

gaggagatgg cattacaggt tgaatccact ggtggggttt actttgttcc tgcttttaat 1080

ggattgtttg ccccatggtg gcgtgaggat gctcgcgggg tttgtattgg aataacaagg 1140

tttacaagca agggtcacat tgcccgagct gtgcttgaga gcatgtgttt ccaagtgaaa 1200

gatgtcttgg attcaatgca taaagattca ggagaaagtg aatcccaaaa aacagagttt 1260

ttgcttagag tggatggtgg ggcaactgta aacaacctgc tgatgcagat tcaggcagat 1320

ttggtgggat gtccagtaat tagacctgct gacatagaga caacagcact tggagcagcc 1380

tatgctgccg gattagctac tgggatttgg aaagaagatt ttattttcaa tactgaggag 1440

aagttgaaga atgctagagt tttccgtcct gtaatgactg aggaagtaag gaaaaagaaa 1500

gttgactctt ggtgcaaagc tgttagtaaa actttcgact tagctgatct tgctctttga 1560

<210> 3

<211> 3126

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 3

aaagggttag catcggcatt tccgaggagt gcgcgtgcgt ttggtgtggt caacggaagc 60

gagataaata aacagagaga gagagagaga gagagagagg tgtgtttgtt ctctgagtag 120

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tggcttcaac gtcgataaag gcttgaaggc cattggtctc accaatcaga gagagaccac 420

tctcctctgg agcaaatcca ccggcctccc tcttcacaac gccattgttt ggatggatgc 480

tcgcacttct tccatttgca ggtcaactat tcattttctc aactttgcat caatgttttt 540

tacttttgtt agaaatctct atcccagaat tcaaacccca acatctccct tctccttcac 600

cctttcccta ccatcggacc taccttatat ctctaatgtt tagagaattc attttgaatt 660

taattgattt tcgatcaaat tttctctgaa gcaatgtgat ttatgcttat attttatttt 720

ttaaaaaaag caaataagta gtaaaaccta ttataatata ttttattatc taagtatgtg 780

tatgtgcttt gatgagtata aagttgattt taaagttttc tgatttatgt ttgaattttt 840

ttatttactt tttgatacat agagttttta ttctaaaggc aggttcatag taaaatttaa 900

tataaaattt gttacccaac tcacaaaagc taatgtttca acttaaaatc aattatgggc 960

cgggatcact tttcccgtat ggaactaaac atgtaaacct aaaattatct aaaacatctt 1020

aatcaaaatc attttttttt taaagtggaa ccaacatgtt agtatttacc tcaatttacc 1080

ttcattgaaa acaacatgag ttttgtatga tccaacatga atccaaacac atatggatgt 1140

gtatacttgt ataaactgtt taaggcttca attcacttac taatcatttt gtgggtgagt 1200

atttcatcat ggatccgttt gtatattttt atggacctat cgaatgctat gtttgtgtgt 1260

ccaacttatg ttccgtgttt ggaattggtc actatttcct tcctgtgttg ttgttgttta 1320

ttttttttgc tagaactgtc atggtctcat agatcagatg ttattgaatc gttttgaaac 1380

aggagattgg aaaaggagtt atctggcggt agaaaccatt ttgtggagag ttgtggcttg 1440

cctattagca catacttcag tgctttgaag ctgctgtggt tgatggaaaa tgtagatgcc 1500

gtaaaggagg ccataaagaa aaaggatgcg ctgtttggaa ctattgacac ttggttgata 1560

tggaatctaa ctggtggggt gaatggggga ttgcatgtta ccgatgtttc aaatgcatct 1620

cgtacaatgc tcatgaatct aaaaaccctt gactgggatg catctacctt aaaaaccctt 1680

aatattcctg ctgaaatttt gcctaatatt gttagtaatg ccgaaattat aggagaggtt 1740

gggtctggat ggccaattgc tggtgtccct attgctggat gtttagggga tcaacatgct 1800

gcaatgttag gacaatcatg ccgtaaaggg gaggctaaga gcacttatgg cacaggtgct 1860

ttcatactac taaatactgg tgaagggata attcaatcga agcacggtct tttatccact 1920

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