一种l-核糖异构酶及其在生物法制备l-核糖中的应用
阅读说明：本技术 一种l-核糖异构酶及其在生物法制备l-核糖中的应用 (L-ribose isomerase and application thereof in preparation of L-ribose by biological method ) 是由 徐虹 刘超 徐铮 王笑 李莎 冯小海 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种L-核糖异构酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该L-核糖异构酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,对L-核酮糖的催化效率能达到85％以上。本发明还公开了包含上述L-核糖异构酶的重组菌以及该重组菌的构建方法,该重组菌对L-核酮糖的催化效率能达到81％以上。本发明描述的L-核糖异构酶对于L-核糖的工业化生产具有很好的应用前景与经济价值。(The invention discloses L-ribose isomerase, wherein the amino acid sequence of the L-ribose isomerase is shown as SEQ ID NO.1, and the nucleotide sequence of the L-ribose isomerase is shown as SEQ ID NO. 2. The L-ribose isomerase has good thermal stability and pH stability, and the catalytic efficiency of the L-ribose isomerase on L-ribulose can reach more than 85%. The invention also discloses a recombinant strain containing the L-ribose isomerase and a construction method of the recombinant strain, and the catalytic efficiency of the recombinant strain on L-ribulose can reach more than 81%. The L-ribose isomerase described by the invention has good application prospect and economic value for industrial production of L-ribose.)
技术领域
本发明属于一种技术领域，具体涉及来自发酵放线纤维菌(Actinotaleafermentans NX-1)的L-核糖异构酶及其应用。
背景技术
L-核糖属于极其稀有的单糖，是一种重要的医药中间体，具有重要的医学价值，由L-核糖合成的各种L-核糖衍生物，广泛应用于抗病毒与抗肿瘤领域。
目前L-核糖的制备主要采用化学法，需要经历至少7步的复杂反应，而且面临副产物多，产率低下等问题。L-核糖异构酶(L-RI)能够以L-核酮糖为原料制备L-核糖，具备反应温和、产率高等特点，而L-核酮糖能够通过生物法从L-***糖催化得到。目前文献仅报道了三种L-核糖异构酶，分别来源于Acinetobacter sp.DL-28，Geodermatophilus obscurusDSM43160和Cellulomonas parahominis MB426。然而已发现的L-RI对L-核酮糖的催化效率均不高，因此挖掘对L-核酮糖具有高催化能力的L-RI对于生产L-核糖有着极其重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种对L-核酮糖具有高催化能力的L-核糖异构酶。
本发明还要解决的技术问题是，提供一株包含上述L-核糖异构酶的基因工程菌及其构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是，提供上述L-核糖异构酶和上述基因工程菌在制备L-核糖中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种L-核糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该L-核糖异构酶来自发酵放线纤维菌(Actinotalea fermentans NX-1)。所述L-核糖异构酶的氨基酸序列如下：
Met Thr Arg Thr Tyr Val Thr Arg Arg Glu Tyr Asp Glu Trp Leu Gln
Glu Ala Ala Ser Leu Ala Arg Ala Leu Arg Tyr Pro Ile Thr Pro Asp
Met Val Asn Asp Ser Ala Gly Ile Val Trp Gly Asp Asp Gln Tyr Ala
Ala Phe Glu Asn Gly Leu Trp Ser Arg Glu Pro Tyr Glu Leu Met Val
Ile Phe Glu Ala Leu Asn Glu Pro Ala Val Asp Gly Leu Pro Val Ser
Ala Ala His Gly Ser Glu Tyr Ser Gly Leu Cys Asp Asp Leu Met Ile
Val His Pro Gly Lys Phe Cys Pro Pro His Tyr His Asn Arg Lys Thr
Glu Ser Tyr Glu Val Val Leu Gly Glu Met Asp Val Phe Tyr Gly Pro
Glu Pro Val Arg Val Glu Asp Glu Glu Thr Val Thr Trp Ser Pro Met
Pro Ala Gly Ser Pro Trp Pro Asp Gly Val Ala Leu Pro Ala Gly Arg
Glu Asp Thr Tyr Ala Ala Leu Thr Ser Tyr Val Arg Leu Ser Ala Gly
Asp Pro Lys Phe Val Met His Arg Lys His Leu His Thr Phe Arg Cys
Pro Ala Glu Ala Thr Thr Pro Leu Val Val Arg Glu Val Ser Thr Tyr
Ser His Glu Pro Thr Glu His Ala Ala Asp Asp Pro Ala Pro Leu Pro
Thr Trp Ala Gly Leu His Asp Asn Ala Trp Leu Ser Pro Ala Ala Gln
Thr Gly Arg Leu Val Thr His Ile Arg。
编码权利要求1所述L-核糖异构酶的基因，其核苷酸序列如下：
atgacccgta cgtatgtgac ccgtcgcgaa tacgatgaat ggctgcagga agcagcaagt
ctggcacgtg cactgcgcta tccgattacg ccggatatgg tcaacgactc cgcgggcatc
gtgtggggtg atgaccagta tgcagctttc gaaaatggtc tgtggtcacg cgaaccgtac
gaactgatgg ttatttttga agcactgaat gaaccggctg tggatggtct gccggtttcg
gcagcacatg gtagcgaata ttctggtctg tgcgacgatc tgatgatcgt gcacccgggt
aaattctgtc cgccgcatta tcacaatcgt aaaaccgaaa gttacgaagt ggttctgggt
gaaatggatg tgttttacgg cccggaaccg gttcgcgtcg aagacgaaga aaccgttacg
tggagcccga tgccggcagg ttctccgtgg ccggatggtg tcgcgctgcc ggccggccgt
gaagacacct atgcagctct gacgtcatac gttcgcctgt cggcgggcga tccgaaattt
gtcatgcatc gtaaacatct gcacaccttc cgttgcccgg cagaagctac cacgccgctg
gtcgtgcgtg aagttagtac ctattcccat gaaccgacgg aacacgcagc agatgatccg
gcaccgctgc cgacctgggc aggtctgcat gacaacgcgt ggctgtctcc ggcagctcag
accggccgtc tggtgacgca cattcgctaa。
一种重组质粒，该重组质粒含有上述L-核糖异构酶基因。
一种重组菌，该重组菌含有上述L-核糖异构酶基因。
上述重组菌的构建方法，该方法包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到质粒上，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化至宿主菌，即得到重组菌。
其中，所述的质粒为pET-28a(+)，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
具体的质粒构建方法与重组菌构建方法如下：
(1)构建表达质粒：利用如下引物序列扩增SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：
引物1：5’-CGGGATCC(BamH I)ATGACCCGTACGTATGTGACCCGTC-3’；
引物2：5’-CCCAAGCTT(Hind III)TTAGCGAATGTGCGTCACCAGACGG-3’；
PCR扩增体系为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各1μL，dNTP2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，ExTag聚合酶0.5μL，ddH2O14μL；
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；然后54℃退火2min，72℃延伸5min，循环30次,4℃保存；
回收PCR扩增产物，经限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a-afri；
(2)构建重组菌：将重组质粒pET-28a-afri转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养18～24h得到初步阳性克隆；经抗性培养基筛选得到阳性克隆：分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶BamH I和Hind III酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-28a-afri，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为重组菌。
对重组质粒pET-28a-afri进行测序，结果表明***片段为一个含有747bp，编码249个氨基酸组成的蛋白质。
上述L-核糖异构酶在制备L-核糖中的应用。
其中，以1～100g/L的L-核酮糖为底物，L-核酮糖浓度优选为100g/L，加入L-核糖异构酶进行酶转化反应，酶的用量为10～500U，L-核糖异构酶的添加量优选为20U；反应温度30～70℃，反应温度优选为37℃；转化时间1～12h，转化时间优选为3h。
其中，L-核糖异构酶的酶活定义方法为：以L-核酮糖为底物，单位时间内催化生成1μmol L-核糖所需的L-核糖异构酶的酶量定义为1U。
上述L-核糖异构酶的制备方法：
将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组菌接种于添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃发酵培养2～3h，至OD600为0.6时加入0.2～1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或0.5～20g/L的乳糖，继续诱导表达6～20h后，离心收集菌体。
将得到的菌体悬于pH7.0磷酸钾缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心，收集上清液(粗酶液)，粗酶液经0.22μm滤膜过滤后，使用Ni-NTA亲和树脂进行纯化，得到L-核糖异构酶纯酶。本发明可以利用纯化后的酶或者粗酶液添加到反应体系中。
上述重组菌在制备L-核糖中的应用。
其中，以1～100g/L的L-核酮糖为底物，L-核酮糖的添加量为100g/L；加入重组菌进行转化反应，重组菌的加入量为10～100g/L(以菌体湿重计算)，重组菌的添加量为50g/L湿菌体；反应温度30～70℃，反应温度优选为37℃；转化时间1～48h，转化时间优选为3h。
上述重组菌的制备方法：
将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组菌接种于添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃发酵培养2～3h，至OD600为0.6时加入0.2～1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或0.5～20g/L的乳糖，继续诱导表达6～20h后，离心收集菌体。
有益效果：本发明提供了一种L-核糖异构酶，该酶具有较好的稳定性，反应温度为30～70℃，反应pH为5.5～10，该L-核糖异构酶显示出对L-核酮糖极高的催化效率。该对L-核酮糖具有高催化能力的L-核糖异构酶在最适催化条件下，对L-核酮糖的转化率可达75％以上，对于L-核糖的工业化生产具有广泛的应用前景和经济价值。
附图说明
图1为重组质粒pET-28-afri的构建示意图。
图2 L-核糖异构酶制备L-核糖的反应曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：来源于发酵放线纤维菌(Actinotalea fermentans NX-1)的基因组提取。
发酵放线纤维菌(Actinotalea fermentans NX-1)为本实验室保藏，用GenomicDNA Purification Kit(Takara，大连)抽提处于对数生长期的发酵放线纤维菌(Actinotalea fermentans NX-1)的基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。
实施例2：L-核糖异构酶编码基因(afri)的克隆和重组菌构建。
2.1afri基因的PCR扩增。
根据GeneBank上已有的功能未知序列(Genbank登录号No.WP_034244055)，运用VectorNTI软件设计引物Primer1和Primer2，引物序列为：
引物1：5’-CGGGATCC(BamH I)ATGACCCGTACGTATGTGACCCGTC-3’；
引物2：5’-CCCAAGCTT(Hind III)TTAGCGAATGTGCGTCACCAGACGG-3’；
以实施例1获得的基因组为模板，扩增发酵放线纤维菌基因片段。
PCR扩增体系为：基因组DNA 2μL，引物Primer1和Primer2各1μL，dNTP2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，Ex-Tag聚合酶0.5μL，ddH2O 14μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；然后54℃退火2min，72℃延伸5min，循环30次,4℃保存。
将扩增条带切胶后用Axygen公司柱式割胶回收试剂盒回收，连接于Takara公司pMD18-T载体上并转化大肠杆菌JM109。通过在氨苄青霉素LB平板上结合质粒单双酶切验证，鉴定出阳性克隆，并在南京金斯瑞生物科技公司进行序列测定。将测得全长序列在GenBank数据库中进行分析，并借助Vector NTI软件确定其中的完整阅读框。
得到的核苷酸序列如下：
将该基因序列翻译为蛋白序列：
2.2afri基因的表达
利用pET-28a(+)质粒(Novagen)，构建表达载体，表达目的基因，进一步确认基因克隆的正确性。
2.2.1限制性酶切反应，纯化及连接反应
经纯化后的PCR产物，用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的酶进行酶切反应。本实验中，所用的酶是BamH I和Hind III。酶切体系为：PCR产物或质粒溶液12.5μL，BamH I 1μL，Hind III 1μL，10×缓冲液2.5μL，ddH2O 8μL，总体积25μL。
由于所选用的两个酶切位点在pET-28a(+)空质粒上相距很近(约30bp)，因此，酶切之后的PCR产物和质粒载体只需要经过PCR清洁试剂盒即可达到纯化的目的。
经酶切纯化后的PCR产物和质粒载体，可以用于连接反应。连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物4μL，酶切纯化的质粒4μL，T4连接酶1μL，10×连接酶缓冲液1μL。连接后获得重组质粒pET-28-afri，其主要结构如图1所示。
2.2.2质粒制备与转化
质粒抽提采用质粒提取试剂盒，参照生产商的说明书进行操作。质粒转化细胞使用氯化钙法。
2.2.3重组质粒pET-28-afri的转化
(1)取0.1-1μg重组质粒pET-afri DNA于200μL感受态细胞中，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上1-3min。
(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min。
(4)取200μL菌体涂布于选择性LB固体培养基表面。37℃培养12-16h至单菌落出现。
2.2.4重组子的鉴定
将阳性菌落接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中进行培养并提取质粒，按照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件分别用BamH I和HindIII对重组质粒进行单-双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
经电泳结果证实，该阳性克隆菌落含有DNA片段***质粒pET-28-afri，含此重组质粒pET-28-afri的重组大肠杆菌，即为转化的重组大肠杆菌BL21-AFRI。测序结果显示***片段含有一个长747bp的开放阅读框架。
实施例3：L-核糖异构酶的诱导表达。
将重组大肠杆菌BL21-AFRI接种于5mL添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％的接种量转接到装有100mL LB培养基(含25μg/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37℃摇床培养2～3h，至OD600约为0.6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度1mmol/L)，或者添加1g/L乳糖进行诱导，然后继续诱导表达6h后，离心收集菌体。
实施例4：重组L-核糖异构酶的纯化。
获得的重组菌E.coli BL21-AFRI的菌体悬于磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，用生理盐水清洗两次，使用超声波破碎仪破碎细胞(400W，30min)，12000rpm离心10min，所得上清液为可溶性目标蛋白(粗酶液)。粗酶液经0.2μm滤膜过滤后，将样品加至Ni-NTA亲和树脂中，控制流速在15mL/h左右，用10倍柱床体积Wash-Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑)冲洗，最后用10倍柱床体积Elution-Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑)洗脱并收集目标蛋白，将目的蛋白溶液4℃下于磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中过夜透析。纯化后的目的蛋白酶活力达到12.3U/mg，经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组L-核糖异构酶蛋白的分子量为35kDa。
酶的酶活定义方法：以L-核酮糖为底物，单位时间内催化生成1μmolL-核糖所需的L-核糖异构酶的酶量定义为1U。
实施例5：重组L-核糖异构酶热稳定性实验。
取纯化后的重组L-核糖异构酶50μL(20mg/mL)于40℃、50℃、60℃、65℃、70℃和75℃不同温度水浴中处理1～3h，然后加入到50μL含有50mM Tris-盐酸冲液(pH 7.5)的反应体系中，添加L-核酮糖至终浓度100mM，在最适反应温度下水浴反应30min，通过液相色谱测定L-核糖生成量。测得结果见表1。
表1温度对L-核糖异构酶的影响
实施例6：重组L-核糖异构酶pH稳定性实验。
取纯化后的重组L-核糖异构酶50μL(20mg/mL)于90μL pH分别为5.5、6.0、6.5、7.5、8.0、9.0和10.0条件下中室温处理0～12h，然后加入到50μL含有50mM Tris-盐酸冲液(pH 7.5)的反应体系中，添加L-核酮糖至终浓度100mM，最适温度下水浴反应30min，通过液相色谱测定L-核糖生成量。测得结果见表2。
表2pH对L-核糖异构酶稳定性的影响
实施例7：重组L-核糖异构酶的应用。
酶转化反应的总体积为10mL，以10g/L L-核酮糖作为转化底物，溶解于50mMTris-盐酸冲液的反应体系中(pH 7.5)，取2mg实施例4纯化后的重组L-核糖异构酶于体系中，最适温度下反应12h，通过液相色谱测定L-核糖生成量。经测定，转化液中L-核糖浓度为8.5g/L，重组L-核糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到85％，见图2。
实施例8：产重组L-核糖异构酶的基因工程菌的应用。
转化反应的总体积为100mL，以100g/L L-核酮糖作为转化底物，悬浮于50mMTris-盐酸冲液的反应体系中(pH 7.5)，取5g(湿菌体)实施例3得到的产重组L-核糖异构酶的基因工程菌于反应体系中，最适温度下反应36h，通过液相色谱测定L-核糖生成量。经测定，转化液中L-核酮糖浓度为81g/L，重组L-核糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到81％。
实施例9：来源于Actinotalea fermentans NX-1L-核糖异构酶与蛋白WP_034244055催化性能对比。
酶转化反应的总体积为10mL，以10g/L L-核酮糖作为转化底物，溶解于50mMTris-盐酸缓冲液的反应体系中(pH 7.5)，取2mg实施例4纯化后的重组L-核糖异构酶和蛋白WP_034244055(该基因由南京金斯瑞生物科技公司全基因合成并按实施例4进行蛋白纯化)于体系中，最适温度下反应12h，通过液相色谱测定L-核糖生成量。经测定，Actinotaleafermentans NX-1L-核糖异构酶转化液中L-核糖浓度为8.5g/L，重组L-核糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到85％；蛋白WP_034244055转化液中L-核糖浓度为7.0g/L，重组L-核糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到70％。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种L-核糖异构酶及其在生物法制备L-核糖中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Arg Thr Tyr Val Thr Arg Arg Glu Tyr Asp Glu Trp Leu Gln
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Leu Ala Arg Ala Leu Arg Tyr Pro Ile Thr Pro Asp
20 25 30
Met Val Asn Asp Ser Ala Gly Ile Val Trp Gly Asp Asp Gln Tyr Ala
35 40 45
Ala Phe Glu Asn Gly Leu Trp Ser Arg Glu Pro Tyr Glu Leu Met Val
50 55 60
Ile Phe Glu Ala Leu Asn Glu Pro Ala Val Asp Gly Leu Pro Val Ser
65 70 75 80
Ala Ala His Gly Ser Glu Tyr Ser Gly Leu Cys Asp Asp Leu Met Ile
85 90 95
Val His Pro Gly Lys Phe Cys Pro Pro His Tyr His Asn Arg Lys Thr
100 105 110
Glu Ser Tyr Glu Val Val Leu Gly Glu Met Asp Val Phe Tyr Gly Pro
115 120 125
Glu Pro Val Arg Val Glu Asp Glu Glu Thr Val Thr Trp Ser Pro Met
130 135 140
Pro Ala Gly Ser Pro Trp Pro Asp Gly Val Ala Leu Pro Ala Gly Arg
145 150 155 160
Glu Asp Thr Tyr Ala Ala Leu Thr Ser Tyr Val Arg Leu Ser Ala Gly
165 170 175
Asp Pro Lys Phe Val Met His Arg Lys His Leu His Thr Phe Arg Cys
180 185 190
Pro Ala Glu Ala Thr Thr Pro Leu Val Val Arg Glu Val Ser Thr Tyr
195 200 205
Ser His Glu Pro Thr Glu His Ala Ala Asp Asp Pro Ala Pro Leu Pro
210 215 220
Thr Trp Ala Gly Leu His Asp Asn Ala Trp Leu Ser Pro Ala Ala Gln
225 230 235 240
Thr Gly Arg Leu Val Thr His Ile Arg
245
<210> 2
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgacccgta cgtatgtgac ccgtcgcgaa tacgatgaat ggctgcagga agcagcaagt 60
ctggcacgtg cactgcgcta tccgattacg ccggatatgg tcaacgactc cgcgggcatc 120
gtgtggggtg atgaccagta tgcagctttc gaaaatggtc tgtggtcacg cgaaccgtac 180
gaactgatgg ttatttttga agcactgaat gaaccggctg tggatggtct gccggtttcg 240
gcagcacatg gtagcgaata ttctggtctg tgcgacgatc tgatgatcgt gcacccgggt 300
aaattctgtc cgccgcatta tcacaatcgt aaaaccgaaa gttacgaagt ggttctgggt 360
gaaatggatg tgttttacgg cccggaaccg gttcgcgtcg aagacgaaga aaccgttacg 420
tggagcccga tgccggcagg ttctccgtgg ccggatggtg tcgcgctgcc ggccggccgt 480
gaagacacct atgcagctct gacgtcatac gttcgcctgt cggcgggcga tccgaaattt 540
gtcatgcatc gtaaacatct gcacaccttc cgttgcccgg cagaagctac cacgccgctg 600
gtcgtgcgtg aagttagtac ctattcccat gaaccgacgg aacacgcagc agatgatccg 660
gcaccgctgc cgacctgggc aggtctgcat gacaacgcgt ggctgtctcc ggcagctcag 720
accggccgtc tggtgacgca cattcgctaa 750
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggatccat gacccgtacg tatgtgaccc gtc 33
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagcttt tagcgaatgt gcgtcaccag acgg 34