一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用

文档序号：1624382 发布日期：2020-01-14 浏览：41次 >En<

阅读说明：本技术 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用 (D-psicose-3-epimerase mutant and encoding gene, recombinant vector, recombinant strain and application thereof ) 是由徐虹黄月园徐铮李莎于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体,将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶AtDPEase的氨基酸发生如下任意一种的突变：H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C。本发明还公开了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体编码基因、重组载体、重组菌株及其在生产D-阿洛酮糖中的应用。突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C在55℃的半衰期t1/2分别是96min、259min、113min、316min；T5020分别比AtDPEase提高了1.5℃、2.1℃、1.7℃和2.6℃。(The invention discloses a D-psicose-3-epimerase mutant, wherein the amino acid of D-psicose-3-epimerase AtDPEase is mutated as follows: H39N, H39N/I33L, H39N/S213C and H39N/I33L/S213C. The invention also discloses a D-psicose-3-epimerase mutantA coding gene, a recombinant vector, a recombinant strain and application thereof in producing D-psicose. Mutants H39N, H39N/I33L, H39N/S213C and H39N/I33L/S213C have half-lives t at 55 ℃ 1/2 Respectively 96min, 259min, 113min and 316 min; t is 50 20 Respectively increased by 1.5 ℃, 2.1 ℃, 1.7 ℃ and 2.6 ℃ compared with AtDPEase.)

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用

技术领域

本发明涉及酶的定点突变突变技术，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用。

背景技术

糖尿病是目前全球最严重的健康问题之一，根据国际糖尿病联盟2017年数据显示，全球成人糖尿病患病人数已达4.25亿，预计2045年可能达到6.29亿，我国以1.14亿成为糖尿病患者绝对数量最多的国家。然而，当前医学研究针对糖尿病的治疗方案都会给患者的生活带来一定程度的不便与痛苦，近年来，稀少糖的研究成为了糖尿病膳食治疗方向的研究热点。D-阿洛酮糖(D-allulose/D-psicose)是稀少糖D-阿洛糖的醛酮糖异构体，也是果糖C-3位的差向异构体。作为一种功能性稀少糖，D-阿洛酮糖的热量可忽略不计(0.007kcal/g)，且具有减脂，保护胰岛β-细胞，稳定血糖，提高葡萄糖耐受性等有益于人体的保健功能。未来对于糖尿病治疗策略的研究需采纳多个学科的方法，将临床治疗、药物研究、以及食品科学综合起来，才能在最大程度上降低糖尿病的患病风险，为人类健康增添保障。

生物法合成D-阿洛酮糖一般使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPEase)或D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase，DTEase)催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中提取的DPEase基因在大肠杆菌中表达后获得的催化转化效率是目前所有菌株中最高的(～33％)。然而，A.tumefaciens DPEase(AtDPEase)在50℃下半衰期短(63min)、稳定性差。因此，提高AtDPEase的热稳定性和酶活力对推动D-阿洛酮糖的后续开发至关重要。

为了使D-阿洛酮糖能够工业化生产，学者们利用分子生物学技术对D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行了基因工程改造，使其具有工业化运用的潜力。Kim等在2006年利用X-射线衍射技术对AtDPEase的蛋白晶体结构进行分析，从而进一步探索AtDPEase的催化机理。通过分子建模手段发现AtDPEase是一个四聚体结构的异构酶。该酶是严格的金属离子依赖型，Glu150、Asp183、His209、Glu244能够与金属离子结合，从而构成该酶的活性中心，而Trp112、Glu156、Arg215是酶底物结合的关键位点。

随机突变技术，如易错PCR和DNA改组，是提高酶热稳定性的常见策略。Choi等于2011年通过易错PCR的方法，对AtDPEase进行随机突变，筛选出S213C和I33L两株稳定性较高的突变菌株，并对S213和I33位点分别进行定点突变，发现第213位的丝氨酸和第33位的亮氨酸是最适合增强酶热稳定性的氨基酸突变位点。在此基础上，构建得到的双位点变异菌株I33L/S213C的55℃下的活性半衰期分别为野生型、S213C和I33L的26倍，9倍和4倍。Park等人在后续研究中发现，在最适反应条件下，I33L/S213C全细胞催化700g/L果糖得到230g/L的D-阿洛酮糖。

现有关于AtDPEase热稳定性改造的研究已经得到一定发展，但采用理性设计的研究并不多，缺乏普适性的理论依据，且操作繁琐，成本高，在这些方面都存在较大的改进空间。

发明内容

发明目的：为了解决野生型AtDPEase热稳定性低、催化效率低的问题，本发明第一方面提供了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体，第二方面提供了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体编码基因、重组载体、重组菌株，第三方面提供了酶突变体、编码基因、重组载体、重组菌株在生产D-阿洛酮糖中的应用。

本发明中AtDPEase突变体的设计原理如下：通过计算机辅助设计和体外定点饱和突变技术对AtDPEase进行改造。发生定点饱和突变的氨基酸位点是通过YARASA软件对野生型AtDPEase的氨基酸预测计算得到的高B-factor值的氨基酸位点，并通过Pymol分析排除了距离活性中心较接近的位点；B-factor(又称Debye-Waller factor，也称为温度因子)是用来描述X-射线衍射蛋白晶体结构时由于原子热运动造成的射线衰减或散射现象，B-factor所体现的数值(B值)可用于识别蛋白结构中的原子、氨基酸侧链及loop区域的运动性及柔性，B-factor越高，相应部位的构象就越不稳定或柔性越强。体外单位点饱和突变技术是蛋白质工程中的一种重要技术，通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它任意19种氨基酸替代的突变体；此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构-功能关系研究的重要手段。

本发明的技术方案：本发明所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶AtDPEase发生如下任意一种情况的突变得到：

(1)AtDPEase的氨基酸序列中第39位组氨酸突变为天冬酰胺，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N；

(2)AtDPEase的氨基酸序列中第39位组氨酸突变为天冬酰胺，且第33位异亮氨酸突变为亮氨酸，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N/I33L；

(3)AtDPEase的氨基酸序列中第39位组氨酸突变为天冬酰胺，且第213位丝氨酸突变为半胱氨酸，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N/S213C；

(4)AtDPEase的氨基酸序列中第39位组氨酸突变为天冬酰胺，且第33位异亮氨酸突变为亮氨酸，且第213位丝氨酸突变为半胱氨酸，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N/I33L/S213C。

本发明所述AtDPEase突变体，由来自根癌农杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(AtDPEase)出发运用定点饱和突变和定点而获得，AtDPEase由289个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；该AtDPEase是野生型根癌农杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(WT-AtDPEase)经南京金斯瑞生物科技有限公司经密码子优化而获得。

其中，WT-AtDPEase，Genebank登录号为ANH56792.1，由289个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。

优选地，AtDPEase的氨基酸序列中第39位组氨酸突变为天冬酰胺，且第33位异亮氨酸突变为亮氨酸，且第213位丝氨酸突变为半胱氨酸，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N/I33L/S213C。

本发明进一步提供编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C或H39N/I33L/S213C的AtDPEase突变基因。

优选地，(1)当为编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N的突变基因时，突变体H39N的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示；

(2)当为编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N/I33L的突变基因时，突变体H39N/I33L的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:8所示；

(3)当为编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N/S213C的突变基因时，突变体H39N/S213C的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示，突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:10所示；

(4)当为编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体H39N/I33L/S213C的突变基因时，突变体H39N/I33L/S213C的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，突变基因的核苷酸序列如SEQID No:12所示。

本发明进一步提供包含上述AtDPEase突变基因的重组载体。

优选地，起始载体为pET-28a(+)或ptrc99a。

本发明进一步提供包含上述重组载体的重组菌株。

优选地，原始菌株为E.coli BL21(DE3)或E.coli MG1655。

其中，重组菌株突变体H39N的构建步骤如下：

1)将AtDPEase片段克隆至起始载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组载体；

2)以步骤1)构建的重组载体为模板，设计简并S/A引物，进行PCR扩增得到定点饱和突变的重组载体，即将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶第39位组氨酸突变为天冬酰胺；所述简并引物的核苷酸序列如下：

His39-S：GAAGTTGCGGCGCACNNNATCAACGAATACTCT

His39-A：AGAGTATTCGTTGATNNNGTGCGCCGCAACTTC

3)将步骤2)得到的定点突变的重组载体转化至原始菌株中，得到重组菌株突变体H39N。

其中，重组菌株突变体H39N/I33L的构建步骤如下：

1)将AtDPEase片段克隆至起始载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组载体；

2)以步骤1)构建的重组载体为模板，设计简并S/A引物，进行PCR扩增得到定点饱和突变的重组载体H39N，即将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶第39位组氨酸突变为天冬酰胺；所述简并引物的核苷酸序列如下：

His39-S：GAAGTTGCGGCGCACNNNATCAACGAATACTCT

His39-A：AGAGTATTCGTTGATNNNGTGCGCCGCAACTTC

3)将步骤2)得到的定点突变的重组载体转化至原始菌株中，得到重组菌株突变体H39N；

4)以步骤3)得到的突变体H39N的基因为模板设计定点突变引物，进行PCR扩增得到定点突变的重组载体H39N/I33L，即将突变体H39N的第33位异亮氨酸突变为亮氨酸；

所述定点突变引物的核苷酸序列如下：

I33L-S：5’-AAATTAGGTTTCGATATCTTAGAAGTTGCGGCG-3’

I33L-A：5’-CGCCGCAACTTCGATATCTAAGAAACCTAATTT-3’

其中，所述突变体H39N氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；

5)将步骤4)得到的定点突变的重组载体转化至原始菌株中，得到重组菌株突变体H39N/I33L，其氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。

其中，重组菌株突变体H39N/S213C的构建步骤如下：

1)将AtDPEase片段克隆至起始载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组载体；

His39-S：GAAGTTGCGGCGCACNNNATCAACGAATACTCT

His39-A：AGAGTATTCGTTGATNNNGTGCGCCGCAACTTC

3)将步骤2)得到的定点突变的重组载体转化至原始菌株中，得到重组菌株突变体H39N；

4)以步骤3)得到的突变体H39N的基因为模板设计定点突变引物，进行PCR扩增得到定点突变的重组载体H39N/S213C，即将突变体H39N的第213位丝氨酸突变为半胱氨酸；

所述简并引物的核苷酸序列如下：

S213C-S：5’-TTCCACACCGGTGAATGTAACCGTCGCGTTCCG-3’

S213C-A：5’-CGGAACGCGACGGTTACATTCACCGGTGTGGAA-3’

其中，所述H39N氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；

5)将步骤4)得到的定点突变的重组载体转化至原始菌株中，得到重组菌株突变体H39N/S213C，其氨基酸序列如SEQ ID No:9所示。

其中，重组菌株突变体H39N/I33L/S213C的构建步骤如下：

1)将AtDPEase片段克隆至起始载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组载体；

His39-S：GAAGTTGCGGCGCACNNNATCAACGAATACTCT

His39-A：AGAGTATTCGTTGATNNNGTGCGCCGCAACTTC

3)将步骤2)得到的定点突变的重组载体转化至原始菌株中，得到重组菌株突变体H39N；

所述简并引物的核苷酸序列如下：

I33L-S：5’-AAATTAGGTTTCGATATCTTAGAAGTTGCGGCG-3’

I33L-A：5’-CGCCGCAACTTCGATATCTAAGAAACCTAATTT-3’

其中，所述H39N氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；

5)将步骤4)得到的定点突变的重组载体转化至原始菌株中，得到重组菌株突变体H39N/I33L，其氨基酸序列如SEQ ID No:7所示；

6)以步骤5)得到的突变体H39N/I33L的基因为模板设计定点突变引物，进行PCR扩增得到定点突变的重组载体，即将突变体H39N/I33L的第213位丝氨酸突变为半胱氨酸：

所述简并引物的核苷酸序列如下：

S213C-S：5’-TTCCACACCGGTGAATGTAACCGTCGCGTTCCG-3’

S213C-A：5’-CGGAACGCGACGGTTACATTCACCGGTGTGGAA-3’

其中，所述H39N/I33L氨基酸序列如SEQ ID No:7所示；

7)将步骤6)得到的定点突变的重组载体转化至原始菌株中，即得突变体H39N/I33L/S213C，其氨基酸序列如SEQ ID No:11所示。

本发明进一步提供所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体、所述AtDPEase基因、所述重组载体、所述重组菌株在生产D-阿洛酮糖中的应用。

优选地，该D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体作为固定化酶在生产D-阿洛酮糖中的应用。

有益效果：本发明基于蛋白质的氨基酸结构的柔性和运动性的理性分析，并借助计算机辅助设计软件对突变位点进行计算和预测，与传统突变方法相比，靶向性高，显著避免了筛选的盲目性。本发明结合筛选得到的DPEase突变体H39N(His39Asn)与当前筛选到的AtDPEase稳定性最好的突变体I33L/S213C(Ile33Leu/Ser213Cys)设计多位点突变，将定点饱和突变与定点突变结合得到热稳定性大幅度提高的AtDPEase突变体，最终得到了4株热稳定性高得突变体。突变体H39N/I33L/S213C是稳定性最好的的菌株，与AtDPEase和突变体I33L/S213C相比，55℃下的半衰期t_1/2分别增加了306min和51min。在固定化酶的效果研究中，使用Alg(Ti)PDA材料制备而成的固定化酶具有良好的使用稳定性。批次使用实验表明，Alg(Ti)PDA-H39N/I33L/S213C在使用10次后仍保留初始酶活力的63％，而Alg(Ti)PDA-AtDPEase仅有21％的残余酶活力。且当果糖浓度为500g/L时，H39N/I33L/S213C催化得到的D-阿洛酮糖的产量可以达到164g/L，催化转化效率并未受到影响，具有较高得市场应用前景。工业应用中，常使用固定化酶用于催化生产，突变体H39N/I33L/S213C的热稳定性提高，对环境的耐受性好，可以使得固定化酶长期储存或者使用批次大大提升，大大减少了工业生产的成本。

附图说明

图1为实施例2中对AtDPEase的氨基酸进行B-factor值的计算分析；

图2为实施例2中对AtDPEase的蛋白结构进行模拟分析；

图3为实施例3中AtDPEase及突变体E42K、E42N、H39N、Q188G、H38Q在55℃下孵化15min后的相对剩余酶活；

图4为实施例4中AtDPEase及突变体H39N、H39N/S213C、H39N/I33L、H39N/S213C/I33L在55℃下孵化15min后的相对剩余酶活；

图5为实施例5中对AtDPEase及突变体H39N表达并纯化结果的SDS-PAGE分析；

图6为实施例7中AtDPEase及突变体H39N，H39N/S213C，H39N/I33L、H39N/S213C/I33L的T₅₀ ²⁰；

图7为实施例7中AtDPEase及突变体H39N，H39N/S213C，H39N/I33L、H39N/S213C/I33L的常温储存稳定性分析；

图8为实施例7中AtDPEase及突变体H39N，H39N/S213C，H39N/I33L、H39N/S213C/I33L的55℃下的活性半衰期t_1/2测定结果；

图9为3种不同的固定化酶；

图10为AtDPEase固定化酶批次使用的稳定性；

图11为突变体H39N/S213C/I33L固定化酶批次使用的稳定性。

具体实施方式

实施例1重组菌株E.coli BL21(DE3)pET-28a-AtDPEase构建

(1)AtDPEase片段的获取：

以AtDPEase为模板，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，通过S/A引物扩增目的基因，引入酶切位点。

构建表达载体所用的引物加设酶切位点引物序列如下：

DPE-S：5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAACACGGTATCTACTATAGCTATTGGG-3’；(下划线为Nde I酶切位点)

DPE-A：5’-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAACCGCCCAGAACGAAAC-3’；(下划线为Bam HI酶切位点)。

上述引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成；AtDPEase片段PCR体系及反应条件见表1。产物消化处理后回收，纯化该目的片段。

表1 AtDPEase片段PCR体系及反应条件

(2)重组载体的构建及转化

活化E.coli DH5α/pET-28a(+)菌株[E.coli DH5α购于诺维赞生物科技有限公司，质粒pET-28a(+)购于淼灵生物]，次日按照DNA提取试剂盒(购于Axygen爱思进生物技术有限公司)提取pET-28a(+)载体。用限制性内切酶Nde I和BamH I进行双酶切pET-28a(+)载体，双酶切体系见表2。通过核酸凝胶电泳验证双酶切pET-28a(+)载体和目的片段(AtDPEase片段)的实验结果，分别胶回收目的片段和已双酶切的表达载体。

表2 pET-28a(+)双酶切体系

将已双酶切的pET-28a(+)载体与目的基因通过连接酶ClonExpress MultiS OneStep(购于诺维赞生物科技有限公司)连接，37℃，水浴30min，连接体系见表3。将连接产物加入100μL的E.coli BL21(DE3)感受态细胞(购于诺维赞生物科技有限公司)中，冰上放置20min，42℃进行热激，持续90sec，迅速放回冰中冰浴5min，加入800μL无抗性LB培养液，37℃，200rpm，培养1h后涂布在含有卡纳抗性的LB琼脂平板培养基上，37℃过夜培养12h，得到含有pET-28a-AtDPEase的重组菌E.coli BL21(DE3)。

无抗性LB培养液配方如下：酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L；

含有卡纳抗性的LB琼脂平板培养基配方如下：酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉20g/L，卡纳25μg/mL。

表3 pET-28a(+)与AtDPEase片段连接体系

实施例2 AtDPEase氨基酸突变体的筛选

1、高B因子氨基酸残基位点的筛选

采用YASARA软件对已知的AtDPEase片段的氨基酸序列进行B-factor值的计算，参见附图1AtDPEase的氨基酸B-factor值的计算分析；其中，5个B值最高的氨基酸位点分别为：自N端起第38位组氨酸(His38)，第39位组氨酸(His39)，第42位谷氨酸(Glu42)，第112位色氨酸(Trp112)，第118位谷氨酰胺(Gln118)。根据Pymol对AtDPEase的结构进行模拟分析，Trp112位于AtDPEase的活性中心，突变后可能会造成大概率的酶活下降情况；因此，选择远离活性中心的氨基酸位点作为定点饱和突变的靶点氨基酸(His38、His39、Glu42、Gln118)作为定点饱和突变的靶点氨基酸，参见附图2AtDPEase的蛋白结构模拟分析。

2、定点饱和突变

以重组载体pET28a-AtDPEase为模板，针对上述确定的靶点氨基酸，分别在与第38位组氨酸(His38)、第39位组氨酸(His39)、第42位谷氨酸(Glu42)和第118位谷氨酰胺(Gln118)相对应的核苷酸处利用NNN代替原有密码子，设计S/A引物，进行全质粒PCR扩增，构建4个定饱和突变PCR产物，其设计引物核苷酸序列如下(下划线代表任意19种氨基酸突变位点)：

His38-S：5’-ATCGAAGTTGCGGCGNNNCACATCAACGAATAC-3’

His38-A：5’-GTATTCGTTGATGTGNNNCGCCGCAACTTCGAT-3’

His39-S：5’-GAAGTTGCGGCGCACNNNATCAACGAATACTCT-3’

His39-A：5’-AGAGTATTCGTTGATNNNGTGCGCCGCAACTTC-3’

Glu42-S：5’-GCGCACCACATCAACNNNTACTCTGATGCGGAA-3’

Glu42-A：5’-TTCCGCATCAGAGTANNNGTTGATGTGGTGCGC-3’

Gln118-S：5’-CCGATTGATTACTCTNNNCCGGTTGATAAAGCG-3’

Gln118-A：5’-CGCTTTATCAACCGGNNNAGAGTAATCAATCGG-3’

PCR反应体系和反应条件见表4。

表4 PCR反应体系和反应条件

PCR反应结束后，加入1μL DpnI消化酶(Takara,宝日医生物技术(北京)有限公司)，37℃反应3h消化模板，回收，纯化后的PCR产物转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。

转化方法：20μL PCR产物与100μL的E.coli BL21(DE3)感受态混匀冰浴20min后，42℃热激90sec后迅速拿出，冰浴5min，加入800μL的LB液体培养基，37℃，200rpm，复苏45min，4500rpm离心5min，弃850μL上清液，菌泥重悬混匀涂布于含有25μg/mL卡纳抗性的固体LB平板上，得到含有pET28a-AtDPEase的重组菌E.coli BL21(DE3)和含有pET28a-AtDPEase突变体的重组菌株E.coli BL21(DE3)。

3、AtDPEase及其突变体库的构建与表达

转化后的含有pET28a-AtDPEase的重组菌E.coli BL21(DE3)和含有pET28a-AtDPEase突变体的重组菌E.coli BL21(DE3)，直接涂布于含有25μg/mL卡纳抗性的固体LB平板上，在37℃下培养12-14h，得到针对4个靶点氨基酸的单点饱和突变体库。从卡纳平板上挑取含有AtDPEase及其突变体基因的重组载体的E.coli BL21(DE3)的单菌落，接种于含有25μg/mL卡纳抗性的1mL液体LB培养基中，37℃振荡培养12h。然后按2％(v/v)接种量分别接种到新鲜含有25μg/mL卡纳抗性的1mL液体LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入IPTG(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)至终浓度为1.0mmol/L，200rpm，25℃诱导表达20h后，离心(4℃，12000rpm，20min)去上清，得到的菌泥用50mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)重悬待用。

实施例3热稳定性突变体的筛选

1、取0.5mL实施例2得到的重悬菌液置于50℃水浴锅中孵育1h，孵化结束后，离心(4℃，12000rpm，1min)，弃上清，加入0.5mL果糖溶液(终浓度500g/L，含1mmol/L Mn²⁺)混匀，置于50℃水浴锅反应1h后，将反应液置于100℃高温灭活10min，离心(4℃，12000rpm，1min)，弃沉淀；

2、检测剩余酶活力：催化得到的反应液离心并稀释一定倍数后，通过联用高效液相色谱仪(HPLC)和示差折光检测器(购于安捷伦科技有限公司)检测剩余酶活(D-阿洛酮糖的浓度)。其中，HPLC检测条件：85％乙腈为流动相，温度40℃，流速1mL/min，色谱柱为SepaxHP-Amino(购于苏州赛芬科技有限公司)；

以AtDPEase剩余酶活力为100％，对比AtDPEase突变体和AtDPEase，选择剩余酶活比AtDPEase高的突阳性突变体，进行测序。得到剩余活性较高的5个突变体，E42K(Glu42Lys)、E42N(Glu42Asn)、H39N(His39N)、Q188G(Gln118Gly)、H38Q(His38Gln)，第一轮筛选结束。

3、检测55℃下的剩余酶活：将E42K(Glu42Lys)、E42N(Glu42Asn)、H39N(His39N)、Q188G(Gln118Gly)、H38Q(His38Gln)以及0.5mLAtDPEase重悬菌液置于55℃水浴锅中孵育15min，菌液离心(4℃，12000rpm，1min)，弃上清，加入0.5mL果糖溶液(终浓度500g/L，含1mmol/L Mn²⁺)混匀，置于50℃水浴锅反应1h后，将反应液置于100℃高温灭活10min，离心(4℃，12000rpm，1min)，弃沉淀；重复实施例3.2的步骤检测剩余酶活力(阿洛酮糖的浓度)，以AtDPEase剩余酶活力为100％，检测结果参见附图3。

对比AtDPEase和其他突变体，H39N在55℃下，孵化15min后的剩余酶活比AtDPEase高约20％，酶活力稳定性效果最好，因此选择突变体H39N进行下一步突变。

突变体H39N对应的氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。

实施例4构建H39N/S213C、H39N/I33L以及H39N/S213C/I33L多点突变

1、基于H39N的双点突变：突变体H39N为模板，针对第33位异亮氨酸(Ile),第213位丝氨酸(Ser)设计简并S/A引物，进行全质粒PCR扩增，反应结束后DpnⅠ酶消化模板，回收，纯化后得到的突变质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于25μg/mL卡纳的LB抗性平板上，37℃培养12-14h，得到突变体H39N/I33L(His39Asn/Ile33Leu)和H39N/S213C(His39Asn/Ser213Cys)，参照实施例2的方法突变、表达H39N/I33L、H39N/S213C、H39N和AtDPEase。

其中所述简并引物的核苷酸序列如下：

I33L-S：5’-AAATTAGGTTTCGATATCTTAGAAGTTGCGGCG-3’

I33L-A：5’-CGCCGCAACTTCGATATCTAAGAAACCTAATTT-3’

S213C-S：5’-TTCCACACCGGTGAATGTAACCGTCGCGTTCCG-3’

S213C-A：5’-CGGAACGCGACGGTTACATTCACCGGTGTGGAA-3’

2、基于H39N的多点突变：以H39N/I33L为模板，针对第213位丝氨酸(Ser)进行突变，突变步骤重复实施例4(步骤1)所述的方法，得到AtDPEase的多点突变体H39N/I33L/S213C(His39Asn/Ile33Leu/Ser213Cys)，参照实施例2(步骤3)中的方法诱导表达H39N/I33L/S213C。

3、检测55℃孵育15min后的剩余酶活力：取1mL收集到的AtDPEase及其突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C、H39N/I33L/S213C菌液，置于55℃水浴锅中，孵育15min，菌液离心(4℃，12000rpm，1min)，弃上清，加入0.5mL果糖溶液(终浓度500g/L，含1mmol/L Mn²⁺)混匀，置于50℃水浴锅反应1h后，将反应液置于100℃高温灭活10min，离心(4℃，12000rpm，1min)，弃沉淀；参照实施例3(步骤3)的方法，以AtDPEase剩余酶活力为100％检测突变体剩余酶活力，检测结果参见附图4。

55℃孵育15min后，H39N，H39N/I33L，H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的剩余酶活均高于AtDPEase；特别地，H39N/I33L/S213C的剩余活性最高，是AtDPEase剩余酶活力的1.47倍。

最终得到的突变体H39N，H39N/I33L，H39N/S213C和H39N/I33L/S213C对应的氨基酸序列分别如SEQ ID No:5、SEQ ID No:7、SEQ ID No:9、SEQ ID No:11所示；对应的核苷酸序列分别如SEQ ID No:6、SEQ ID No:8、SEQ ID No:10、SEQ ID No:12所示。

实施例5AtDPEase及突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的酶纯化

1、粗酶液的制备：取诱导后的LB培养液9000rpm，离心，20min。收集菌体，用无菌水洗涤两次后，将菌体重悬于50mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，冰浴中超声破碎细胞。将超声破碎后的样品12000rpm，4℃离心20min，取上清液即为粗酶液。

2、Ni²⁺柱纯化：

(1)Ni²⁺柱平衡：向柱中加入Ni²⁺填料，并且加入10倍柱体积的结合缓冲液平衡亲和柱；

(2)上样：加入超声破碎后的蛋白上清液100mL，对破碎后上清液及穿透液留样进行SDS-PAGE检测；

(3)洗脱杂蛋白：蛋白样品上柱后用结合缓冲液洗脱未结合的杂蛋白；

(4)洗脱目的蛋白：向柱中加入10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；

(5)透析：将收集的活性蛋白装入透析袋在透析缓冲液中透析24h。透析后蛋白样品在12，000rpm离心5min，收集上清测定蛋白浓度和活性。

结合缓冲液：10％(v/v)甘油，50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，pH8.0。

洗脱缓冲液：10％(v/v)甘油，50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH8.0。

透析缓冲液：10％(v/v)甘油，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。

3、SDS-PAGE垂直电泳仪检测收集到的蛋白样品，SDS-PAGE的分离胶浓度为12％(即12g/100mL)，结果表明，构建并表达纯化得到的AtDPEase及其突变体蛋白为可溶性表达，且大小均在33kDa左右，参见附图5。12％的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳检测AtDPEase及其突变体H39N蛋白纯化的结果：泳道1：AtDPEase的粗酶液；泳道2：AtDPEase经Ni²⁺柱回收后的穿透液；泳道3：AtDPEase经Ni²⁺柱回收后的洗杂液；泳道4：经Ni²⁺柱回收后的AtDPEase洗脱液，经过透析处理得到纯化蛋白；泳道5：H39N的粗酶液；泳道6：H39N经Ni²⁺柱回收后的穿透液；泳道7：50mmol/L经Ni²⁺柱回收后的洗杂液；泳道8：经Ni²⁺柱回收后的50mmol/L洗脱液，经过透析处理得到纯化蛋白。

4、突变体H39N/I33L、H39N/S213C、H39N/I33L/S213C的纯化步骤及方法同实施例5(步骤3)。

实施例6构建ptrc99a-H39N、ptrc99a-H39N/I33L、ptrc99a-H39N/S213C、ptrc99a-H39N/I33L/S213C的重组菌E.coli MG1655

构建方法同实施例1至实施例4；不同的是起始载体为ptrc99a，原始菌株为E.coliMG1655。

实施例7 AtDPEase及突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的稳定性测定

1、AtDPEase及突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的T₅₀ ³⁰测定

取实施例5得到的AtDPEase及突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的纯化蛋白液，分别置于不同温度(0-70℃)下孵育20min后，冰浴10min，12000rpm离心1min，取0.5mL上清液加入终浓度为500g/L的0.5mL果糖溶液(含1mmol/LMn²⁺)，50℃，反应1h后，100℃灭活10min。12000rpm，离心1min，取上清液，稀释一定倍数后通过HPLC检测剩余酶活力(D-阿洛酮糖的浓度)。以剩余活力百分比的ln值对孵育温度T(℃)做图，得到斜率k，由T₅₀ ³⁰＝ln2/k计算得到AtDPEase及突变酶的T₅₀ ²⁰。不同菌株的T₅₀ ²⁰，参见附图6和表5。

对比AtDPEase和几株突变体的T₅₀ ²⁰，H39N/I33L/S213C(56.2℃)>H39N/I33L(55.7℃)>H39N/S213C(55.3℃)>H39N(55.1℃)>AtDPEase(53.6℃)。

2、AtDPEase及突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的储存稳定性测定

将实施例5得到的AtDPEase及突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的纯化蛋白液，置于常温下，每隔一段时间(天)取样，12000rpm离心1min，取0.5mL上清液，加入终浓度为500g/L的0.5mL果糖溶液(含1mmol/L Mn²⁺)，50℃，反应1h后，100℃灭活10min。12000rpm离心1min，取上清液，稀释一定倍数后通过HPLC检测剩余酶活力(D-阿洛酮糖的浓度)。参见附图7和表5，以第一天反应的酶活为100％。

AtDPEase和突变体酶活随储存时间的增加均呈下降趋势，突变体H39N/I33L/S213C的酶活与AtDPEase以及其他突变体相比，酶的储存稳定性更好，且在第10天时仍保留有83.7％的酶活。其他菌株在第十天的剩余酶活分别为20.1％(AtDPEase)、55.9％(H39N)、70.3％(H39N/I33L)、68％(H39N/S213C)。

3、AtDPEase及突变体H39N，H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的55℃下的半衰期t_1/2测定

将纯化后AtDPEase及突变体H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C的酶液置于55℃下，每隔一段时间(min)取样，12000rpm离心1min，取上清液250μL与250μL果糖(终浓度500g/L，含1mmol/L Mn²⁺)，50℃，反应1h后，100℃灭活10min。12000rpm离心1min，取上清液，稀释一定倍数后通过HPLC检测剩余酶活力(D-阿洛酮糖的浓度)。以第0min的酶活力为100％，计算剩余酶活力的百分比，以剩余酶活力百分比的ln对时间t(min)作图，直线的斜率为失活常数k，由t_1/2＝ln2/k得到AtDPEase及及突变体H39N,H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C在55℃的半衰期。

检测结果参见附图8和表5，几株突变体及AtDPEase在55℃下的t_1/2分别为：10min(AtDPEase)<96min(H39N)<113min(H39N/S213C)<259min(H39N/I33L)<316min(H39N/I33L/S213C)；H39N、H39N/I33L、H39N/S213C和H39N/I33L/S213C在55℃的半衰期分别是AtDPEase的9.6、25.9、11.3、31.6倍。

表5 AtDPEase及其突变体在55℃下的半衰期t_1/2

备注：*数据来源于Choi J G,Ju Y H,Yeom S J,et al.Improvement in theThermostability of D-Psicose3-Epimerase from Agrobacterium tumefaciens byRandom and Site-Directed Mutagenesis[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology,2011,77(20):7316-7320.

实施例8突变体H39N/I33L/S213C催化果糖生产D-阿洛酮糖

分别取0.5mL实施例5得到的H39N/I33L/S213C的纯化蛋白液，加入终浓度为500g/L的0.5mL果糖溶液(含1mmol/L Mn²⁺)，50℃，反应3h后，100℃灭活10min。12000rpm，离心1min，取上清液，稀释一定倍数后通过HPLC测定D-阿洛酮糖的浓度(g/L)。结果表明，反应3h后，H39N/I33L/S213C催化500g/L果糖生成164g/L的D-阿洛酮糖，其催化转化效率为32.7％。与AtDPEase和I33L/S213C相比，突变后的催化转化效率并未受到影响，具有工业应用价值。

实施例9突变体H39N/I33L/S213C及AtDPEase固定化酶的制备及应用

1、多巴胺改性海藻酸钠的合成

以海藻酸钠、多巴胺、EDC·HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)等为原料，在海藻酸钠上接枝多巴胺，合成设计了多巴胺改性海藻酸钠。合成方式如下：

浓度0.2M pH5.7的PBS缓冲液的的配制：先配置浓度为0.2mol/L的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的母液各100mL。0.2mol/L Na₂HPO₄：称取5.64gNa₂HPO₄溶于200mL水；0.2mol/LNaH₂PO₄：称取4.8gNaH₂PO₄溶于200mL水。量取0.2mol/L NaH₂PO₄溶液187mL、0.2mol/LNa₂HPO₄溶液13mL混合。

将200mLPBS缓冲液倒入250mL三口烧瓶中，加入2g海藻酸钠，搅拌直至海藻酸钠完全溶解。待海藻酸钠完全溶解后，加入1.94gEDC·HCl和1.16gNHS使海藻酸钠活化，搅拌45min。加入3.84g多巴胺搅拌12h。因海藻酸钠不溶于有机溶剂，使用无水乙醇将溶液醇析3次，除去剩余的反应物。将析出的多巴胺改性海藻酸钠用Christ Alpha 1-2LDplus冷冻干燥机冻干(购于Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen有限公司)。

2、凝胶球的制备

(1)海藻酸钙凝胶球的制备：将225mg海藻酸钠溶解于10mL 50mmol/L pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，待海藻酸钠完全溶解后，得到透明溶液。将10mL纯酶液(20g/L)与10mL上述凝胶溶液1：1混合，得到20mL混合溶液，使用一次性注射器吸取上述溶液，滴加到50mL0.3mol/L的CaCl₂溶液中，静置45min，等待凝胶球完全成形，得到的Alg固定化酶如图9所示。使用RO水将过滤后的凝胶球清洗3次，放置在700g/L果糖溶液中，4℃保存。

(2)聚多巴胺海藻酸钙凝胶球：将225mg多巴胺改性海藻酸钠溶于50mmol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，搅拌24h，得到黑色溶液。将10mL纯酶液(20g/L)与10mL上述凝胶溶液1：1混合，得到20mL混合溶液，使用一次性注射器吸取上述溶液，滴加到50mL 0.3mol/L的CaCl₂溶液中，静置45min，等待凝胶球完全成形，得到的AlgPDA固定化酶如图9所示。使用RO水将过滤后的凝胶球清洗3次，放置在700g/L果糖溶液中，4℃保存。

(3)钛离子配位的改性海藻酸钙凝胶球的制备；将225mg多巴胺改性海藻酸钠溶于10mL RO水中，待海藻酸钠完全溶解后，根据加入10μL的乳酸钛，震荡均匀，溶液颜色变为橘黄色。将10mL纯酶液(20g/L)与10mL上述凝胶溶液1:1混合，得到20mL混合溶液，使用一次性注射器吸取上述溶液，滴加到50mL0.3mol/L的CaCl₂溶液中，静置45min，等待凝胶球完全成形，得到的Alg(Ti)PDA固定化酶如图9所示。使用RO水将过滤后的凝胶球清洗3次，放置在700g/L果糖溶液中，4℃保存。

3、三种材料制备的固定化酶的循环使用稳定性

取相同数量的固定化酶凝胶球，使用RO水将反应后的凝胶球清洗3次后，加入终浓度为500g/L的1mL果糖溶液(含1mmol/L Mn²⁺)，50℃反应，每隔24h，分离固定化酶与反应上清液。使用RO水将反应后的固定化酶清洗3次后加入终浓度为500g/L的1mL果糖溶液(含1mmol/L Mn²⁺)于50℃下继续反应，上清液通过HPLC检测剩余酶活力(D-阿洛酮糖的浓度)。以第1次反应的酶活为100％。三种材料制备的固定化酶中，Alg(Ti)PDA包埋的固定化酶的批次使用稳定性最好，参见图10，11。其中，Alg(Ti)PDA-H39N/I33L/S213C固定化酶在循环使用10次后酶活仍保留初始活力的63％，而Alg(Ti)PDA-AtDPEase固定化酶在循环使用第10次时酶活仅有初始活力的21％。Alg-H39N/I33L/S213C和AlgPDA-H39N/I33L/S213C固定化酶在循环使用5次后残余活力仅有53％和66％。Alg-AtDPEase和AlgPDA-AtDPEase固定化酶在循环使用5次后残余活力仅有13％和34％。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Gly

<210> 2

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaacacg gtatctacta tagctattgg gaacatgaat ggtctgctaa attcggcccg 60

tacatcgaaa aagtagctaa attaggtttc gatatcatcg aagttgcggc gcaccacatc 120

aacgaatact ctgatgcgga actggcgacc atccgtaaat ctgcgaaaga taacggcatc 180

atcctgaccg ctggcattgg tccgtctaaa accaaaaacc tgtcctctga agatgcggcg 240

gttcgtgctg caggtaaagc atttttcgaa cgtaccctgt ctaacgttgc aaaactggat 300

attcacacca tcggtggtgc actgcatagc tattggccga ttgattactc tcagccggtt 360

gataaagcgg gtgattatgc gcgtggtgtt gaaggtatta acggtatcgc agatttcgct 420

aacgatctgg gtatcaacct gtgtattgaa gttctgaacc gtttcgaaaa ccacgttctg 480

aacaccgcgg cggaaggtgt tgcattcgtt aaagatgttg gtaaaaacaa cgttaaagtt 540

atgctggata ccttccacat gaacatcgaa gaagatagct tcggtgatgc gatccgcacc 600

gcgggcccgc tgctgggtca cttccacacc ggtgaatcta accgtcgcgt tccgggtaaa 660

ggccgtatgc cgtggcacga aatcggcctg gcgctgcgtg atatcaacta caccggtgcg 720

gttatcatgg aaccgttcgt taaaaccggt ggtaccatcg gtagcgatat caaagtttgg 780

cgtgatctga gcggtggcgc ggatatcgcg aaaatggatg aagatgcgcg taacgcgctg 840

gcgttctctc gtttcgttct gggcggt 867

<210> 3

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Val Ile Arg Gln Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Thr Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile His Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Glu Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Val Val Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Leu Ala Thr Met

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Gly

<210> 4

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaacacg gcatctatta ttcctactgg gaacatgagt ggagcgccaa gttcggcccc 60

tatatcgaga aggtcgccaa gctcggtttc gatatcatcg aagtcgccgc ccaccacatc 120

aatgaataca gcgacgccga actcgccgtc atcaggcaga gcgcaaagga taacggcatc 180

atcctcaccg ccggcatcgg cccttcgaaa acgaagaacc tgtcgtcaga ggatgccgcg 240

gttcgtgcag ccggcaaggc gttctttgaa cgcaccctta ccaatgtcgc caagctagac 300

atccacacca tcggcggcgc gttgcattcc tattggccaa tcgattattc gcagccggtc 360

gacaaggcgg gcgattatgc gcgcggcgtc gagggcattc acggcattgc cgatttcgcc 420

aatgatctcg gcatcaacct gtgcatcgaa gtcctcaacc gcttcgaaaa ccacgttctc 480

aacacggcgg ccgagggcgt cgcttttgtg aaggatgtcg gcaagaacaa cgtgaaagtc 540

atgctggaca ccttccacat gaacatcgag gaagacagct ttggtgaggc catccgcacg 600

gccggcccgt tgctggggca tttccatacc ggcgagagca atcgccgcgt accgggcaag 660

ggcaggatgc cctggcacga aatcggcctc gcccttcgcg atatcaatta caccggcgcg 720

gtcgtcatgg agcctttcgt caagaccggc ggcacgatcg gctccgacat caaggtgtgg 780

cgcgatctca gcggcggtgc cgacctcgcg acaatggacg aggatgcccg caatgccctg 840

gcattttccc gtttcgtgct tggcggc 867

<210> 5

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Ile Glu Val Ala Ala His Asn Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Gly

<210> 6

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaaacacg gtatctacta tagctattgg gaacatgaat ggtctgctaa attcggcccg 60

tacatcgaaa aagtagctaa attaggtttc gatatcatcg aagttgcggc gcacaatatc 120