(五)

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例：

本发明中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；质粒等购自上海生工；DNA marker、Fast Pfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序以及基因合成工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。蔗糖和异麦芽酮糖等常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1：蔗糖异构酶基因在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的克隆和表达。

构建表达载体：以下所述的蔗糖异构酶基因合成工作均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。将来源于欧文氏菌(Erwiniasp.Ejp617)的蔗糖异构酶基因(GenBank:G37835)通过PCR无缝克隆到pET28b(+)载体的Nco I和Xho I之间，获得带有蔗糖异构酶的表达载体pET28b(+)-SI(图4)。PCR程序的操作如下：95℃预变性3分钟；95℃变性15s，53-58℃退火15s，72℃延伸1.5分钟，共25个循环；然后以72℃延伸10分钟。

感受态细胞的制备方法为：从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coli BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5mL的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养9h；从试管中取200μL菌液，接种到50mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD ₆₀₀至0.4-0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm离心10min；将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，取100μL重悬细胞分装至灭菌的1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱，需要时取出。

构建工程菌文库：将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内分别加入5μL的带有蔗糖异构酶基因表达载体pET28b(+)-SI，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴4min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI工程菌。

实施例2：蔗糖异构酶重组菌的诱导表达及纯化

含蔗糖异构酶的湿菌体：分别将实施例2获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃下诱导培养10h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.0、50mM Tris HCl缓冲液洗涤两次，即获得含蔗糖异构酶的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI的湿菌体；将湿菌体加入pH 7.0、50mM Tris HCl缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎20min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

蔗糖异构酶的纯化：由于有6个组氨酸标签和蔗糖异构酶基因一起表达，所以可以通过此组氨酸标签表达的肽段和二价Ni²⁺的螯合作用，用Ni亲和柱(40×12.6mm,Bio-Rad,USA)进行亲和层析纯化蛋白。该纯化过程主要使用和进行纯化。具体操作如下：①用5倍柱体积的Ni柱平衡缓冲液A(50mM NaH₂PO₄·2H₂O+300mM NaCl+50mM咪唑)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用洗脱液B(50mM NaH₂PO₄·2H₂O+300mM NaCl+500mM咪唑)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，获得纯化酶，SDS-PAGE电泳图如图2所示。

实施例3:蔗糖异构酶基因文库的构建和筛选。

(一)通过易错PCR引入有益突变

用MiniBEST质粒纯化试剂盒(TaKaRa，大连，中国)从E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI重组大肠杆菌中分离质粒DNA。在含有60ng质粒(pET28b-SI)作为模板，60pmol每种诱变引物(E2-F，E2-R，表S1)，0.4mM MnCl₂、2x的50μL反应混合物中进行DNA片段的扩增TaqPCR StarMix和Loding Dye(TaKaRa，中国大连)。编码SIase的基因的扩增过程为：94℃2min，然后依次进行30个循环，分别是94℃30s，60℃30s和72℃2分钟，最后在72℃下放置10分钟。该方案导致平均突变频率为每1000bp个碱基取代。使用QuickCut Dpn I在37℃下消化PCR产物3小时，以除去模板。然后，使用MiniBEST DNA片段纯化试剂盒(TaKaRa，大连，中国)纯化文库基因片段。然后将纯化的基因片段连接到Nco I和Xho I位点之间的pET28b中，以形成重组质粒pET28b-SI。然后将pET28b-SI转化到大肠杆菌中，并使所有转化的细胞生长过夜。筛选最佳变体并测序。

易错PCR引物序列

(二)高通量筛选方法的建立以及详细步骤

1、96深孔板培养制备种子液：往96深孔板中每个孔加入500μL含0.1％(v/v)100g/L Kana的LB液体培养基，然后用无菌牙签挑取单菌落于对应孔中，并在每块96深孔板中选取剩下的4个孔，挑取加入WT单菌落，作为阳性对照。然后用盖子密封，于37℃，180rpm振荡培养5h。

2、种子液转接及诱导：取上一步培养好的50μL转化子种子液于另一块96深孔板中，并加入900μL含0.1％(v/v)100g/L Kan的LB液体培养基，然后用盖子密封，于37℃，180rpm振荡培养2h，然后每个孔加入50μL含0.8％(v/v)120g/L IPTG和0.1％(v/v)100g/LKana的LB液体培养基，用盖子密封后于25℃，180rpm振荡培养10h以上。剩余的转化子种子液于4℃冰箱中保存备用。

3、DNS法酶活检测：取50μL诱导液于96孔板中，并加入50μL 50g/L蔗糖(用50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)配制)，于40℃恒温反应15min。然后加入50μL DNS试剂，于微波炉中中火加热25s左右显色，观察实验结果，用酶标仪检测显色液在540nm处的吸光度。

4、高酶活突变体菌液保藏及序列测定：根据DNS法测定结果，标记吸光度高于阳性对照且较高的样品，取其对应的种子液200μL于甘油管中，加入200μL 50％甘油并混匀，然后保存于-20℃冰箱中。再取10μL种子液于10mL含0.1％(v/v)100g/L Kan的LB液体培养基，于37℃，180rpm振荡培养7h以上，取200μL以上菌液送测，根据测序结果保留合适的突变体。

(三)高效液相检测方法(HPLC)进行复筛

高效液相色谱法测定酶活力：将200μL粗酶液(100g/L湿菌体超声破碎后上清)加入到800μL含有蔗糖的50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中(pH 6.0)(蔗糖终浓度为50g/L)。40℃反应30min后，沸水浴处理10min灭活。取离心后的上清液，用流动相稀释5倍，然后滤膜过滤，并用高效液相色谱仪测定稀释液中的异麦芽酮糖量。所用的液相色谱仪为waters2414；流动相为体积比4:1的乙腈和水混合液，流速为1.5mL/min；色谱柱为安捷伦ZORBAX糖分析专用色谱柱(规格4.6×250mm，载碳量3.5％，孔径70埃，粒径5μm，比表面积300m²/g，pH范围2.0～8.0)；检测器为示差折光检测器；外部温度和柱温分别为35℃和30℃；进样量为10μL。高效液相色谱法标准曲线的标定：制备不同浓度(1mM、10mM、20mM、40mM、80mM和120mM)的蔗糖溶液和异麦芽酮糖溶液，分别用HPLC法测定其峰面积，以蔗糖溶液(或异麦芽酮糖溶液)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制相关标准曲线。

酶活力的定义：在pH 6.0和40℃条件下，1min内催化蔗糖异构化生成1μmol异麦芽酮糖所需的酶量，即为1个酶活力单位(U)。

纯酶比活力计算公式如下：

在筛选了4500个突变体之后，获得了两个最优的突变体Q209N，R456K，E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-SI-Q209N和E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI R456K酶活分别达到59U/mg，165U/mg，而野生型E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI酶活为39U/mg protein，突变体Q209N和R456K比活性分别提高了1.5倍和4.2倍。

实施例4：蔗糖异构酶定点饱和突变

为了进一步筛选潜在活力提升菌株，先将实施例3中得到的蔗糖异构酶的Q209和R456两个有益突变位点进行定点饱和突变，做进一步的筛选，PCR引物设计如表1所示，PCR体系(50μL)为：2*Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板(出发菌株)1μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，补ddH₂O至50μL。PCR条件为：95℃预变性3min：95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸7min 20s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经过DNA琼脂糖凝胶电泳验证，并通过DpnI消化模板后，将PCR产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化后的产物涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，对获得的突变体进行优势突变体的筛选，将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司进行测序确认，并保存。

表1：蔗糖异构酶定点饱和突变引物设计

液相检测计算酶活方法同上实施例3。

对蔗糖异构酶的Q209和R456两个有益突变位点进行定点饱和突变之后，发现除了Q209N和R456K作为有益突变点之外，突变体Q209S和R456H酶活分别提高7.3倍和11.5倍，比突变体Q209N和R456K提高的酶活幅度更大。然后，我们Q209N和R456K突变体进行组合得到双重突变体E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI-Q209S/R456H，酶活达到最高为684U/mg，催化效率也达到最高为22.67s^-1mM^-1，是WT的16倍以上。

表2：野生型和不同突变体蔗糖异构酶酶学表征

实施例5：利用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI-Q209S/R456H蔗糖异构酶突变体催化底物蔗糖合成异麦芽酮糖。

首先将原始菌体和突变体E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI-Q209S/R456H的温度和pH值进行优化。在不同的pH(从4.6到10.0)条件下进行反应以确定其最优pH值，不同pH条件下所用缓冲液分别为：100mM磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.6-7.5)、100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5-8.6)和100mM Gly中-NaOH缓冲液(pH 8.6–10.0)。同时通过在不同温度(20–55℃)条件下测酶活性来研究ErSIase的最适温度。

结果表明，ErSIase_WT和ErSIase_Q209S-R456H的最适pH分别为6.5和6.0(图3b和3d)。如图3a和3c所示，纯化的ErSIase_WT和ErSIase_Q209S-R456H在40℃左右都具有最高的酶活性。

最后在最适温度和pH反应条件下，利用全细胞进行催化反应。反应体系为600g/L蔗糖，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI-Q209S/R456H(高表达量)(0.1g/L干细胞)。反应条件：恒温水浴40℃，转速600rpm。在整个反应过程中，每隔30min间隔取样品(100μL)，加入5μL 6M浓盐酸终止反应，然后处理样品，通过使用HPLC测量蔗糖或者异麦芽酮糖浓度来确定转化率，反应进程曲线如图4所示。

当底物蔗糖浓度为600g/L时，使用0.1g/L催化剂可在60min时转化率达到80.0％，最终3小时反应完，转化率达到93.6％。在相同的反应条件下，使用初始菌体(蔗糖异构酶WT)，反应3小时完成后，转化率只能达到74.3％。相对于野生型蔗糖异构酶，E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-SI-Q209S/R456H蔗糖异构酶突变体在催化600g/L蔗糖底物时转化率提高了19.3％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 蔗糖异构酶突变体、编码基因及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 599

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Ser Arg Phe Thr Leu Ser Thr Val Met Ala Leu Leu Val Ala Pro

1 5 10 15

Val Leu Ser Val Leu Pro Gly Gln Val Met Ala Gly Lys Met Asp Met

20 25 30

Ala Thr Thr Gln Leu Ala Gln Lys Ser Asp Asp Phe Pro Ala Trp Trp

35 40 45

Lys Gln Ala Val Phe Tyr Gln Val Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Thr

50 55 60

Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu Lys Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Arg Leu Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr

85 90 95

Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Arg Asp Tyr Arg Lys

100 105 110

Ile Met Lys Glu Tyr Gly Thr Met Glu Asp Phe Asp Arg Leu Ile Ala

115 120 125

Glu Met Asn Lys Arg Asn Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn

130 135 140

His Thr Ser Asp Gln His Ser Trp Phe Val Gln Ser Lys Gly Ser Lys

145 150 155 160

Asp Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Asn Gly

165 170 175

Gln Pro Pro Asn Asn Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Lys

180 185 190

Lys Glu Asp Asn Ser Gly Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Thr Gln

195 200 205

Ser Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Asp Leu Tyr

210 215 220

Ala Met Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lys Gly Val Ala Gly Leu Arg Phe

225 230 235 240

Asp Thr Val Ala Thr Tyr Ala Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Thr

245 250 255

Pro Gln Gln Arg Lys Asn Phe Ala Arg Thr Tyr Thr Glu Gly Pro Ser

260 265 270

Ile His Arg Tyr Ile Lys Glu Met His Gln Gln Val Phe Ser His Tyr

275 280 285

Asn Ile Ala Thr Ala Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Leu Glu Lys Ser

290 295 300

Ile Asp Tyr Phe Asp Arg Arg Arg Gly Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr

305 310 315 320

Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg Gly Val Glu Glu Arg Trp Arg Gln

325 330 335

Lys Ala Trp Ser Leu Thr Asp Phe Arg Gln Thr Ile Asp Lys Val Asp

340 345 350

Arg Val Ala Gly Lys Tyr Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His

355 360 365

Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His Phe Gly Asp Asp Arg Pro Gln Trp

370 375 380

Arg Gln Ala Ser Ala Lys Ala Leu Ala Thr Leu Met Ile Thr Gln Arg

385 390 395 400

Ala Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly Ser Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr

405 410 415

Pro Phe Lys Ser Ile Ala Asp Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe

420 425 430

Trp Gln Asp Tyr Val Ser Ser Gly Lys Val Asp Pro Glu Glu Phe Met

435 440 445

Arg Asn Val Arg Leu Thr Ser His Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln

450 455 460

Trp Asp Glu Ser Ala Asn Ala Gly Phe Thr Ser Gly Thr Pro Trp Phe

465 470 475 480

Asn Val Asn Pro Asn Tyr Lys Leu Ile Asn Ala Ala Asp Gln Thr Arg

485 490 495

Asp Pro Asp Ser Val Phe Asn Tyr Tyr Arg Lys Leu Ile Gly Leu Arg

500 505 510

His Ala Ile Pro Ala Leu Thr Tyr Gly Glu Tyr Lys Asp Leu Asp Pro

515 520 525

Asn Asn Asp Thr Val Tyr Ala Phe Thr Arg Thr His Gly Asp Lys Arg

530 535 540

Tyr Leu Val Val Ile Asn Phe Lys Glu Asn Val Val Asn Tyr Arg Leu

545 550 555 560

Pro Asp Gln Leu Thr Ile Arg Gln Thr Leu Ser Glu Ser Ser Ala Ile

565 570 575

Gln Pro Val Ala Glu Asn Ala Arg Glu Leu Leu Leu Gln Pro Trp Gln

580 585 590

Ser Gly Ile Tyr Gln Leu Asn

595

<210> 2

<211> 1797

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgtctcgtt tcaccctgtc taccgttatg gctctgctgg ttgctccggt tctgtctgtt 60

ctgccgggtc aggttatggc tggtaaaatg gacatggcta ccacccagct ggctcagaaa 120

tctgacgact tcccggcgtg gtggaaacag gcggtcttct accaggtgta cccgcgctct 180

ttcaaagaca ccaacggtga cggtatcggt gacctgaaag gtatcatcga aaaactggac 240

tacctgaaac gtctgggtgt tgacgctatc tggatcaacc cgcactacga ctctccgaac 300

accgacaacg gttacgacat ccgtgactac cgtaaaatca tgaaagaata cggtaccatg 360

gaagacttcg accgtctgat cgctgaaatg aacaaacgta acatgcgtct gatgatcgac 420

atcgttatca accacacctc tgaccagcac tcttggttcg ttcagtctaa aggttctaaa 480

gacaacccgt accgtgacta ctacttctgg cgtgacggta aaaacggtca gccgccgaac 540

aactacccgt ctttcttcgg tggttctgct tggaaaaaag aagacaactc tggtcagtac 600

tacctgcact acttcgctac ccagagtccg gacctgaact gggacaaccc gaaagttcgt 660

gaagacctgt acgctatgct gcgtttctgg ctggacaaag gtgttgctgg tctgcgtttc 720

gacaccgttg ctacctacgc taaaatcccg ggtttcccgg acctgacccc gcagcagcgt 780

aaaaacttcg ctcgtaccta caccgaaggt ccgtctatcc accgttacat caaagaaatg 840

caccagcagg ttttctctca ctacaacatc gctaccgctg gtgaaatctt cggtgttccg 900

ctggaaaaat ctatcgacta cttcgaccgt cgtcgtggtg aactgaacat cgctttcacc 960

ttcgacctga tccgtctgga ccgtggtgtt gaagaacgtt ggcgtcagaa agcttggtct 1020

ctgaccgact tccgtcagac catcgacaaa gttgaccgtg ttgctggtaa atacggttgg 1080

aacgctttct tcctggacaa ccacgacaac ccgcgtgctg tttctcactt cggtgacgac 1140

cgtccgcagt ggcgtcaggc ttctgctaaa gctctggcta ccctgatgat cacccagcgt 1200

gctaccccgt tcatctacca gggttctgaa ctgggtatga ccaactaccc gttcaaatct 1260

atcgctgact tcgacgacat cgaggttaaa ggcttctggc aggactacgt ttcttctggt 1320

aaagttgacc cggaagaatt catgcgtaac gttcgtctga cctctcatga caactctcgt 1380

accccgttcc agtgggacga atctgctaac gctggtttca cctctggtac cccgtggttc 1440

aacgttaacc cgaactacaa actgatcaac gctgctgacc agacccgtga cccggactct 1500

gttttcaact actaccgtaa actgatcggt ctgcgtcacg ctatcccggc tctgacctac 1560

ggtgaataca aagacctgga cccgaacaac gacaccgttt acgctttcac ccgtacccac 1620

ggtgacaaac gttacctggt tgttatcaac ttcaaagaaa acgttgttaa ctaccgtctg 1680

ccggaccagc tgaccatccg tcagaccctg tctgaatctt ctgctatcca gccggttgct 1740

gaaaacgctc gtgaactgct gctgcagccg tggcagtctg gtatctacca gctgaac 1797

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gaaggagata taccatgtct cgtttcaccc tgtctaccg 39

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

tggtgctcga gttggttcag ctggtagata ccaga 35

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

tacttcgcta cccagnnkcc ggacctgaac tgg 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

ccagttcagg tccggmnnct gggtagcgaa gta 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

gttcgtctga cctctnnkga caactctcgt acc 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

ggtacgagag ttgtcmnnag aggtcagacg aac 33