阅读说明：本技术 黑曲霉lccc30112在生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵中的应用 (Application of aspergillus niger LCCC30112 in production of glucoamylase and fermentation of tobacco leaves ) 是由 纪旭东 钟丽娟 王胜利 赵新海 温源 张庆华 赵赛月 王伟华 张宝 *** 李力 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵中的应用,黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112能够产生高酶活性的葡萄糖淀粉酶,利用黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112生产葡萄糖淀粉酶,为葡萄糖淀粉酶的生产来源提供了一个新的途径,可以实现葡萄糖淀粉酶的规模化生产；将具有产高酶活力的葡萄糖淀粉酶的黑曲霉应用到烟叶发酵中,能加速烟叶中淀粉的降解,明显缩短烟叶的发酵周期,提升烟叶的品质。(The invention provides an application of Aspergillus niger (Aspergillus niger) LCCC30112 in production of glucoamylase and fermentation of tobacco leaves, wherein the Aspergillus niger (Aspergillus niger) LCCC30112 can produce glucoamylase with high enzyme activity, and the Aspergillus niger (Aspergillus niger) LCCC30112 is used for producing glucoamylase, so that a new way is provided for a production source of the glucoamylase, and large-scale production of the glucoamylase can be realized; the Aspergillus niger with glucoamylase producing high enzyme activity is applied to the fermentation of the tobacco leaves, so that the degradation of starch in the tobacco leaves can be accelerated, the fermentation period of the tobacco leaves is obviously shortened, and the quality of the tobacco leaves is improved.)

黑曲霉LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵中的应用

技术领域

本发明涉及黑曲霉LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶烟叶发酵中的应用，属于微生物应用的技术领域。

背景技术

葡萄糖淀粉酶能水解淀粉中的α-1.4糖苷键和α-1.6糖苷键，在水解过程中，由底物分子中的非还原端开始，逐步水解出葡萄糖，可以用于烟叶中淀粉的降解。烟叶发酵是在一定的温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化的过程，是卷烟工业提高产品质量的一种初加工方法。

对于烟叶的发酵，目前多数采用自然发酵与人工发酵。自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵的，它的主要特点是在烟叶贮藏期间，利用一年一度的春季温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的。人工发酵是利用人为的适合烟叶内在品质变化的条件(即适宜的温度和湿度)，促使烟叶加快变化的方法。但两种方法均存在发酵进展缓慢的缺陷。

黑曲霉(Aspergillus niger)属于曲霉属丝状真菌，由于其强大的蛋白分泌能力被广泛应用于发酵工业中，该菌种所产酶类最多，可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、乳糖酶、植酸酶、单宁酶、青霉素、纳他霉素和万古霉素等。FAO/WHO/JECFA等粮食安全专家委员会裁定的食品工业用酶使用菌种有20多种，其中黑曲霉高居第一，是允许使用的安全性生产菌株。现有技术中未见在已有菌株中筛选得到高酶活力的黑曲霉及其应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵中的应用，黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112能够高产葡萄糖淀粉酶，十分适用于生产葡萄糖淀粉酶和烟叶发酵。

一方面，本发明提供了黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112在生产葡萄糖淀粉酶中的应用，黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112能够产生高酶活性的葡萄糖淀粉酶，为葡萄糖淀粉酶的生产来源提供了一个新的来源。

另一方面，本发明还提供了一种利用黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112生产葡萄糖淀粉酶的方法，该方法包括将活化的黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112接种于液体培养基中进行发酵培养，发酵液经离心得上清液的步骤。

优选的，黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112的接种量为10⁵～10⁷cfu/ml，所述培养为通风培养，通风量为1：0.5～1.5V/V·min，温度为20～40℃，时间为2～4d；

优选的，接种量为10⁶cfu/ml，通风量为1：1.0V/V·min，温度为30℃，时间为3d；

优选的，所述液体培养基含有：蔗糖2g/L、玉米淀粉4g/L、黄豆粉1g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾0.05g/L、pH为5.0～6.0，液体培养基的装量为60～80％；

优选的，pH为5.5，液体培养基的装量为75％；

优选的，所述离心的温度为0～4℃，转速为5000～7000r/min，时间为10～20min；

优选的，将黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112在PDA培养基中活化培养2～5d后进行接种；

优选的，PDA培养基含有：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L。

进一步的，所述方法还包括在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，透析脱盐后，得粗酶的步骤。

优选的，硫酸铵的饱和度为75～85％；

优选的，硫酸铵的饱和度为80％；

优选的，在上清液加入硫酸铵溶解后，7000～9000r/min离心20min～40min,沉淀用去离子水透析；

优选的，8000r/min离心30min。

进一步的，所述方法还包括将粗酶使用Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和Sephadex G-50凝胶过滤层析柱纯化的步骤。

优选的，所述纯化的具体步骤为：

(1)将粗酶上样到Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，使用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速1.5～2.5mL/min，收集活性组分，经去离子水透析，冷冻干燥后，得酶粉；

(2)将酶粉用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后，上样到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱，使用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速1.5～2.5mL/min，收集活性组分，经去离子水透析、冷冻干燥后，得纯化后的酶粉。

另一方面，本发明还提供了黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112或所述的方法在烟叶发酵中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种烟叶发酵方法，在烟叶中接种黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112进行发酵。

优选的，黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵的温度为20～40℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。

本发明的有益效果为：

本发明公开了黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112能够产生高酶活性的葡萄糖淀粉酶，为葡萄糖淀粉酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现葡萄糖淀粉酶的规模化生产；将具有产高酶活力的葡萄糖淀粉酶的黑曲霉应用到烟叶发酵中，能加速烟叶中淀粉的降解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。

本发明中，如未指定，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。本发明使用的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株购于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号为：LCCC30112。

实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1黑曲霉LCCC30112发酵生产葡萄糖淀粉酶

黑曲霉LCCC30112发酵工艺研究

经过单因素多水平、多因素多水平等配方试验，确定黑曲霉LCCC30112的液体产酶工艺：

将保存菌株转接至活化培养基上，30℃培养3d，备用。

活化培养基采用PDA培养基：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L，pH自然，121℃灭菌30min备用。

种子液制备：

将黑曲霉LCCC30112菌株转接至活化培养基，培养4d至大量产孢，用1％的生理盐水反复洗下孢子，收集孢子悬浮液，接种到种子液培养基中，接种量1％(浓度10⁸cfu/mL)，温度30℃、转速180r/min的条件下培养3d，然后接种到发酵液培养基，接种量为10⁶cfu/mL。

发酵液培养基同种子液培养基：蔗糖2g/L、玉米淀粉4g/L、黄豆粉1g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾0.05g/L，pH5.5。发酵罐培养基灭菌：121℃，60min。

接种：利用火焰圈无菌接种，接种量为1％。

培养条件：培养温度30℃，接种于装量为75％液体培养基的发酵罐中，通风培养72h，通风量为1：1(V/V.min)。

采用单因素多水平、多因素多水平正交等配方试验，确定黑曲霉LCCC30112的液体产酶工艺：培养基配方蔗糖2g/L、玉米淀粉4g/L、黄豆粉1g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾0.05g/L，pH5.5，培养72h。优化后的工艺将产葡萄糖淀粉酶的酶活提高到986.7U/mL。

实施例2葡萄糖淀粉酶分离纯化：

(1)硫酸铵沉淀

将发酵液于4℃、6000r/min离心15min去除菌丝体，得到上清液；

上清液中缓慢加入80％饱和度的硫酸铵盐析沉淀，8000r/min离心30min，沉淀经去离子水透析后，得到粗酶液。

(2)DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

将粗酶液上样到DEAE阴离子交换柱(16mm*100mm)进行酶蛋白纯化。采用10mmol的Tris-HCl缓冲液(pH 8.4，含2mmol氯化钙)进行平衡，使用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速2mL/min，收集合并有酶活峰的组分，经去离子水透析，进行冷冻干燥，得到酶粉。

(3)Superdex-50凝胶过滤层析

将冷冻干燥的酶粉再溶解于3mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)中，用Superdex-50层析柱进行洗脱，洗脱速度2mL/min，收集活性部分，经去离子水透析，冷冻干燥后，得到纯化后的酶。

黑曲霉LCCC30112液体发酵的粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换柱和Superdex-50层析柱分离纯化后，酶蛋白得到明显纯化，将酶活由发酵上清液的986.7U/mL提高到21000U/mL，纯化倍数为21.2倍。

实施例3黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112在烟叶发酵中的应用

将黑曲霉LCCC30112接种于烟叶，黑曲霉LCCC30112的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵的温度为20～40℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。

或将实施例2得到的黑曲霉LCCC30112的发酵上清液液，或其粗酶，或其最终制得的纯化后的葡萄糖淀粉酶添加到烟叶中，用于发酵，加入的葡萄糖淀粉酶在烟叶中的酶活力为10-20U/mg，发酵条件为：温度20～40℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。

本发明以2018重庆B4F原烟作为对照组，以加入10⁶cfu/g的黑曲霉(Aspergillusniger)LCCC30112作为处理组1，加入15U/mg制得的葡萄糖淀粉酶酶粉作为处理组2，来发酵烟叶，发酵的温度为50℃，湿度为55％，时间为8d，发酵后烟叶中各化学成分的变化如表1所示。

由表1可知，加入黑曲霉(Aspergillus niger)LCCC30112或葡萄糖淀粉酶后，烟叶中总糖含量升高，淀粉含量明显降低。总糖产生酸性反应，抑制烟气中碱性物质的碱性，使得烟气的酸碱平衡适度，减低刺激性，糖类是形成香气物质的前体物质。经过处理的烟叶烟气柔顺，提高烟气的细腻感和舒适度，同时丰富烟草香气。

表1各处理中烟叶的化学成分

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。