阅读说明：本技术 热稳定的葡糖淀粉酶及其使用方法 (Thermostable glucoamylases and methods of use thereof ) 是由 J·F·克拉米尔 葛晶 M·A·B·科尔克曼 I·尼古拉耶夫 J·K·舍蒂 唐忠美 W· 于 2017-11-09 设计创作，主要内容包括：公开了具有葡糖淀粉酶活性的多肽、包含此类多肽的组合物、以及应用此类多肽和组合物的方法。(Polypeptides having glucoamylase activity, compositions comprising such polypeptides, and methods of using such polypeptides and compositions are disclosed.)

热稳定的葡糖淀粉酶及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月07日提交的国际专利申请号PCT/CN2013/076419的权益，将该国际申请通过引用以其全文结合在此。

技术领域

本公开涉及具有葡糖淀粉酶活性的多肽和包含此类多肽的组合物。本公开进一步涉及编码此类多肽的多核苷酸，包含编码此类多肽的基因的载体和宿主细胞，所述载体和宿主细胞也能够产生此类多肽。本公开还涉及使用或应用多肽或组合物糖化含淀粉材料的方法，以及通过所述方法产生的糖类。此外，本公开涉及生产发酵产物的方法以及通过所述方法生产的发酵产物。

背景技术

葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由若干种丝状真菌和酵母产生。

葡糖淀粉酶的主要应用是将部分加工的淀粉/糊精糖化成葡萄糖，葡萄糖是许多发酵过程的必需底物。然后可以使用发酵生物将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸类(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，盘尼西林和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程也通常被用于消费醇类(例如，啤酒和白酒)、乳制品(例如，用于生产酸奶和奶酪)、皮革、饮料以及烟草工业中。

终产物还可以是糖浆。例如，终产物可以是葡萄糖，而且还可以例如通过葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎相等地葡萄糖和果糖构成的混合物。这种混合物，或进一步富集果糖的混合物，是在世界范围内商业上最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。

尽管据报道多种微生物产生葡糖淀粉酶(因为它们在细胞外分泌大量的酶)，但用于商业目的的葡糖淀粉酶传统上使用丝状真菌生产。然而，商业上使用的真菌葡糖淀粉酶具有某些限制因素，例如适度的热稳定性、酸性pH要求、和缓慢的催化活性，这增加了工艺成本。因此，需要寻找新的葡糖淀粉酶以改善温度最佳值，从而改善催化效率以缩短糖化时间或获得更高的终产物产率。

本公开的一个目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的某些多肽、编码所述多肽的多核苷酸、可用于产生此类多肽的核酸构建体、包含其的组合物、以及将此类多肽应用于不同工业应用的方法。

发明内容

本发明的多肽、组合物和使用或应用所述多肽或组合物糖化含淀粉材料的方法。所述多肽、组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

1.在一方面，一种具有葡糖淀粉酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

(a)多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:3的多肽具有至少95％，例如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件、更优选地至少中严格条件、甚至更优选地至少中-高严格条件、最优选地至少高严格条件、以及甚至最优选地至少非常高严格条件下与以下项杂交(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，

(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或者

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；

(d)变体，所述变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如，几个)氨基酸的取代、缺失、和/或***；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。

2.在另一方面，一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如段落1所述的多肽的核苷酸序列。

3.在如段落2所述的多核苷酸的一些实施例中，所述多核苷酸有效地连接至控制所述多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。

4.在另一方面，一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如段落2所述的多核苷酸。

5.在如段落4所述的宿主细胞的一些实施例中，所述宿主细胞是产乙醇微生物。

6.在如段落4或5所述的宿主细胞的一些实施例中，所述宿主细胞进一步表达和分泌一种或多种选自下组的另外的酶，该组包含蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶、金属脂肪分解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、马来酸酶(malanase)、β-葡聚糖酶、***糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、转移酶、或其组合。

7.另一方面，一种用于糖化含淀粉材料的方法，所述方法包括以下步骤：i)使所述含淀粉材料与α-淀粉酶接触；和ii)使所述含淀粉材料与葡糖淀粉酶在至少70℃的温度下接触；其中所述方法从所述含淀粉材料(底物)产生至少70％的游离葡萄糖。

8.在如段落7所述方法的一些实施例中，其中步骤(ii)在至少75℃、优选地至少80℃的温度下进行12与96小时之间，优选地进行18至60小时。

9.在如段落7或8所述的方法的一些实施例中，其中所述葡糖淀粉酶在至少70℃的温度，和/或在2.0与7.0之间的pH、优选在pH 4.0与pH 6.0之间、更优选在pH 4.5与pH 5.5之间，保持至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％的相对活性。

10.在如段落7-9中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述方法包括顺序或同时进行步骤(i)和步骤(ii)。

11.在如段落7-10中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述方法进一步包括在糖化步骤ii)之前的预糖化。

12.在如段落7-11中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述葡糖淀粉酶是如权利要求1所述的多肽。

13.在如段落7-12中任一项所述的方法的一些实施例中，其中步骤(i)在所述含淀粉材料的糊化温度或低于糊化温度下进行。

14.在如段落7-13中任一项所述的方法的一些实施例中，其中在步骤(i)和/或步骤(ii)中不存在另外的脱支酶。

15.在如段落14所述的方法的一些实施例中，其中所述脱支酶是支链淀粉酶。

16.另一方面，一种糖，其通过如段落7-15中任一项所述的方法产生。

17.另一方面，一种从段落16所述的糖生产发酵产物的方法，其中所述糖通过发酵生物进行发酵。

18.在如段落17所述的方法的一些实施例中，其中所述发酵过程与步骤(ii)顺序或同时进行。

19.在如段落17或18所述的方法的一些实施例中，其中所述发酵产物包含乙醇。

20.在如段落17或18所述的方法的一些实施例中，其中所述发酵产物包含非乙醇代谢物。

21.在如段落20所述的方法的一些实施例中，其中所述代谢物是柠檬酸、乳酸、丁二酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、有机酸、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、异丁醇、氨基酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、甘氨醇、衣康酸、1,3-丙二醇、维生素类、酶类、激素类、异戊二烯、或者其他生物化学品或生物材料。

22.另一方面，一种在酿造中应用如段落1所述的多肽的方法。

附图说明

图1是pJG580的质粒图谱。

图2是PruGA1经95小时发酵的产物分布图。

图3是72-h孵育后在60℃、65℃和70℃下PruGA1-0.3x、PruGA1-1x、AfuGA-1x、和AnGA-1x的DP1产生比较。

图4是在pH 3.5下PruGA1与TrGA对粗淀粉的活性的比较。

图5是在pH 4.5下PruGA1与TrGA对粗淀粉的活性的比较。

具体实施方式

本公开涉及具有葡糖淀粉酶活性的多肽和包含此类多肽的组合物。本公开进一步涉及编码此类多肽的多核苷酸，包含编码此类多肽的基因的载体和宿主细胞，所述载体和宿主细胞也能够产生此类多肽。本公开还涉及使用或应用多肽或组合物糖化含淀粉材料的方法，以及通过所述方法产生的糖类。此外，本公开涉及生产发酵产物的方法以及通过所述方法生产的发酵产物。

在详细描述组合物和方法之前，定义了如下的术语和缩写。

除非另有定义，所用的所有技术和科学术语具有其在相关科学领域的普通含义。Singleton,等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典],第2版,John Wiley and Sons[约翰·威利父子出版公司],纽约(1994)，以及Hale和Markham,Harper Collins Dictionary of Biology[哈伯科林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)提供了描述本发明的许多术语的普通含义。

定义

术语“葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)活性”在本文被定义为催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶活性。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、最优选地至少95％、以及甚至最优选地至少100％的葡糖淀粉酶活性。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换地使用。当此类氨基酸序列显示出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基端-至-羧基端取向(即N→C)表示氨基酸序列。

术语“成熟多肽”在本文被定义为在翻译和任何翻译后修饰(如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)之后呈其最终形式的多肽。在一方面，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是信号肽的SignalP(Nielsen等人,1997,Protein Engineering[蛋白质工程]10:1-6)程序，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至614。

术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以被化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码具体的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5′-至-3′取向呈现。

术语“编码序列”意指直接指明蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由可读框决定，该可读框通常以ATG起始密码子或替代起始密码子(如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

术语“cDNA”在本文被定义为可以通过从真核细胞中获得的成熟的已剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因此，衍生自mRNA的cDNA缺乏任何内含子序列。

术语“杂交”是指如在印迹杂交技术和PCR技术期间发生的，一条核酸链与互补链形成双链体(即碱基对)的过程。严格杂交条件通过在以下条件下杂交来例证：65℃和0.1XSSC(其中1X SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。杂交的双链核酸的特征在于熔融温度(T_m)，其中一半杂交的核酸与互补链不配对。双链体内错配的核苷酸降低T_m。

“合成的”分子通过体外化学或酶促合成而不是通过生物体产生。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译两者。

术语“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

“表达载体”是指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列与能够在适合的宿主中影响DNA表达的适合控制序列有效地连接。这样的控制序列可以包括影响转录的启动子，控制转录的任选的操纵子序列，编码mRNA上适合的核糖体结合位点的序列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

本文将术语“控制序列”定义为包括表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的所有组分。每个控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每个控制序列对于彼此可以是天然的或外源的。这样的控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

术语“有效地连接”意指指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，调控序列与编码序列有效地连接，使得编码序列的表达受调控序列的控制。

“信号序列”是与蛋白质的N-末端部分附接的氨基酸序列，所述氨基酸序列有利于蛋白质在细胞外的分泌。细胞外的蛋白质的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。

“生物学活性物”是指具有指定生物活性(如酶活性)的序列。

术语“比活度”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活度通常表示为单元(U)/mg蛋白质。

“序列同一性百分比”意指当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，具体序列具有至少一定百分比的与指定参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)Nucleic AcidsRes.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

术语“同源序列”在本文被定义为在用SEQ ID NO:3的拉塞尔青霉菌(Penicilliumrussellii)葡糖淀粉酶的tfasty检索(Pearson,W.R.,1999,在Bioinformatics Methodsand Protocols[生物信息学方法和协议]中，S.Misener和S.A.Krawetz,编辑,185-219页)中具有小于0.001的E值(或期望分数)的预测蛋白。

术语“多肽片段”在本文被定义为具有从SEQ ID NO:3、或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有葡糖淀粉酶活性。

关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、***或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包含人为核苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参考多肽的任何多核苷酸。

关于酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于升高的温度后保持活性的能力。酶(例如淀粉酶)的热稳定性通过以分钟、小时或天给出的其半衰期(t_1/2)来测量，在此期间酶活性的一半在限定条件下丧失。半衰期可以通过测量例如暴露于(即，受挑战于)升高的温度后的残余α-淀粉酶活性来计算。

关于酶的“pH范围”是指在其下酶显示催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定”和“pH稳定性”涉及在一个宽范围内的pH值下，酶保持预定时间段(例如，15min、30min、1h)的活性的能力。

术语“预糖化”在本文被定义为完全糖化或同时糖化和发酵(SSF)之前的过程。预糖化通常在30℃-65℃之间，约60℃的温度下进行40-90分钟。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生物化学品的生产过程，其中微生物，例如产乙醇微生物和至少一种酶，例如淀粉酶在相同的过程步骤中存在。SSF包括在相同的反应容器中同时将淀粉底物(颗粒状、液化的或溶解的)水解为糖类(包括葡萄糖)和将糖类发酵为醇类或其他的生物化学品或生物材料。

“浆料”是水中包含不溶性淀粉颗粒的水性混合物。

术语“总糖含量”是指包括单糖、寡糖和多糖的淀粉组合物中存在的总可溶性糖含量。

术语“干固体”(ds)是指溶解于水的干固体、分散于水中的干固体或二者的组合。因此干固体包括颗粒状淀粉及其水解产物，包括葡萄糖。

“干固体”含量是指相对于其中分散和/或溶解干固体的水的以重量百分比计溶解的和分散的干固体的百分比。淀粉的初始干固体含量为以含水量折算的颗粒状淀粉的重量除以颗粒状淀粉的重量加上水的重量。后续的干固体含量可由针对任何添加或损失的水和化学增益而调节的初始含量确定。后续的溶解干固体含量可由如下所示的折射率测量。8

术语“高DS”是指具有干固体含量大于38％(wt/wt)的水性淀粉浆料。

“干物质淀粉”是指底物例如淀粉浆料的干淀粉含量，并且可通过从底物质量中扣除任何非淀粉组分如蛋白质、纤维和水的贡献来确定。例如，如果颗粒状淀粉浆料具有20％(wt/wt)的水含量和1％(wt/wt)的蛋白质含量，则100kg的颗粒状淀粉具有79kg的干淀粉含量。干物质淀粉可用于确定要使用的酶单位数量。

“聚合度(DP)”是指给定的糖类中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP4+(>DP3)表示聚合度大于3的聚合物。

术语“接触”是指将参考组分(包括但不限于酶、底物和发酵生物)充分靠近放置以影响预期结果，例如所述酶作用于底物上或发酵生物发酵底物。本领域技术人员将认识到混合溶液可以引起“接触”。“产乙醇微生物”是指具有将糖或其他糖类转化为乙醇的能力的微生物。

术语“生物化学品”是指微生物的代谢物，如柠檬酸、乳酸、丁二酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、异丁醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、其他有机酸、1,3-丙二醇、维生素类、或异戊二烯、或者其他生物材料。

术语“支链淀粉酶”也称为脱支酶(E.C.3.2.1.41、支链淀粉6-葡聚糖水解酶)，能够水解支链淀粉分子中的α-1-6-糖苷键。

术语“约”是指参考值的±15％。

术语“包含”及其同源词以其包含在内的含义使用；即相当于术语“包括”及其相应的同源词。

EC 酶委员会

CAZy 碳水化合物活性酶

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt％ 重量百分比

℃ 摄氏度

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

μL和μl 微升

ml和mL 毫升

mm 毫米

μm 微米

mol 摩尔

mmol 毫摩尔

M 摩尔

mM 毫摩尔

μM 微摩尔

nm 纳米

U 单位

ppm 百万分率

hr和h 小时

EtOH 乙醇

ds 干固体

具有葡糖淀粉酶活性的多肽

在第一方面，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽具有优选地至少90％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，如至少96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一些实施例中，本发明的多肽是包含以下氨基酸序列的同源多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差十个氨基酸、优选地相差九个氨基酸、优选地相差八个氨基酸、优选地相差七个氨基酸、优选地相差六个氨基酸、优选地相差五个氨基酸、更优选地相差四个氨基酸、甚至更优选地相差三个氨基酸、最优选地相差两个氨基酸、并且甚至最优选地相差一个氨基酸。

在一些实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:3的多肽的变体、或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。

在一些实施例中，本发明的多肽是热稳定的并且在升高的温度下保持葡糖淀粉酶活性。本发明的多肽在pH值范围为约2.5至约8.0(例如，约3.0至约7.5、约3.0至约7.0、约3.0至约6.5等)时显示出热稳定性。例如，在约3.0至约7.0(例如，约3.5至约6.5等)的pH，本发明的多肽在高温(例如，至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃或更高的温度)下保持大部分葡糖淀粉酶活性持续延长的时间(例如，至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少5小时、或甚至更长的时间)。例如，当在增加的温度下在从约3.5到约6.5的pH，孵育至少1小时、3小时、5个小时、或甚至更长时间时，本发明的多肽保留至少约35％(例如，至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或更高的百分比)的葡糖淀粉酶活性。

在一些实施例中，如通过本文所述的测定法测量的，在50℃的温度下，本发明的多肽在pH约5具有最大活性、在pH约3.5至pH约6.0具有最大活性的90％以上、并且在pH约2.8至pH约7.0具有最大活性的70％以上。使用酶的示例性pH范围是pH 2.5-7.0、3.0-7.0、3.5-7.0、2.5-6.0、3.0-6.0、3.5-6.0。

在一些实施例中，如通过本文所述的测定法测量的，在5.0的pH下，本发明的多肽在约75℃的温度下具有最大活性、在约63℃的温度至约79℃的温度下具有最大活性的70％以上。使用酶的示例性温度范围是50℃-82℃、50℃-80℃、55℃-82℃、55℃-80℃和60℃-80℃。在第二方面，本发明涉及由多核苷酸编码的具有葡糖淀粉酶活性的多肽，所述多核苷酸在优选地非常低严格条件、更优选地低严格条件、更优选地中严格条件、更优选中-高严格条件、甚至更优选高严格条件、以及最优选地非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,MolecularCloning，A Laboratory Manual[分子克隆实验手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港实验室],纽约)。

可以使用SEQ ID NO:1的核苷酸序列；或其片段来设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆针对来自不同属或种的菌株的、编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。具体地说，此类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与目的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。此类探针可以比完整序列短得多，但是长度应当是至少14个、优选至少25个、更优选至少35个、且最优选至少70个核苷酸。然而，优选的是核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，核酸探针的长度可以是至少200个核苷酸、优选地至少300个核苷酸、更优选地至少400个核苷酸、或最优选地至少500个核苷酸。可以使用甚至更长的探针，例如长度优选地是至少600个核苷酸、更优选地至少800个核苷酸、甚至更优选地至少1000个核苷酸、甚至更优选地至少1500个核苷酸、或最优选地至少1800个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明同样涵盖此类探针。

因此，可以筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中与上述探针杂交并编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术分离来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移并且固定在硝酸纤维素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料上。为鉴定与SEQ IDNO:1或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中优选使用载体材料。

在第三方面，本发明涉及由多核苷酸编码的具有葡糖淀粉酶活性的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有优选地至少60％、更优选地至少63％，更优选地至少65％，更优选地至少68％，更优选地至少70％，更优选地至少72％，更优选地至少75％，至少77％，更优选地至少79％，更优选地至少81％，更优选地至少83％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％的序列同一性程度，如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述多核苷酸编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。

在第四方面，本发明的葡糖淀粉酶包含相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的一个或几个氨基酸残基的保守取代。示例性保守氨基酸取代列于表1中。一些保守突变可以通过遗传操作产生，而其他通过用其他方式将合成的氨基酸引入多肽中产生。

表1.保守氨基酸取代

在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶包含相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的一个或几个氨基酸残基的缺失、取代、***或添加。在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶通过保守取代一个或几个氨基酸残基而衍生自SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列通过缺失、取代、***、或添加一个或几个氨基酸残基而衍生自SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在所有情况下，表述“一个或几个氨基酸残基”是指10个或更少，即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。

可替代地，所述氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或***并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochem.[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的、克隆的诱变多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定目的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且可适用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或***可以是至多10个、优选地至多9个、更优选地至多8个、更优选地至多7个、更优选地至多6个、更优选地至多5个、更优选地至多4个、甚至更优选地至多3个、最优选至多2个、以及甚至最优选地至多1个。

葡糖淀粉酶可以是“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包括来自第一葡糖淀粉酶的至少一部分，和来自第二淀粉酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶或其他淀粉降解酶的至少一部分，或甚至其他糖基水解酶，例如但不限于纤维素酶、半纤维素酶等(包括最近被“重新发现”为结构域交换淀粉酶的嵌合淀粉酶)。本发明的葡糖淀粉酶可进一步包括异源信号序列，即允许跟踪或纯化等的表位。

葡糖淀粉酶的生产

本发明的葡糖淀粉酶可以在宿主细胞中产生，例如通过分泌或细胞内表达。在将葡糖淀粉酶分泌到细胞培养基中后，可以获得包含葡糖淀粉酶的培养细胞材料(例如，全细胞培养液)。任选地，葡糖淀粉酶可以从宿主细胞中分离，或甚至从细胞培养液中分离，这取决于最终葡糖淀粉酶所需的纯度。可以根据本领域熟知的方法克隆和表达编码葡糖淀粉酶的基因。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。特别有用的宿主细胞包括黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesi)或嗜热毁丝霉(Myceliopthora Thermophila)。其他宿主细胞包括细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，以及链霉菌属(Streptomyces)。

另外，宿主可以表达一种或多种辅酶、蛋白质、肽。这些可以有益于液化、糖化、发酵、SSF和下游处理。此外，除了用于消化各种原料的酶之外，宿主细胞还可以产生乙醇和其他生物化学物质或生物材料。此类宿主细胞可用于发酵或同时糖化和发酵过程，以减少或消除添加酶的需要。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。在一些实施例中，也可以将包含与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％同一性的多肽用于酶组合物中。优选地，配制这些组合物以提供所希望的特性，例如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性。

这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，所述组合物可包含多重酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氨化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质霉、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、支链淀粉酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或其组合，所述酶可以按本领域技术人员熟知的有效量添加。

可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且这些多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，包含本发明葡糖淀粉酶的组合物可以是水性或非水性配制品、颗粒、粉末、凝胶、浆料、糊剂等，所述组合物可进一步包含本文列出的另外的酶中的任何一种或多种，以及缓冲液、盐、防腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等。此类组合物可与内源酶或已存在于浆料、水浴、洗衣机、食品或饮料产品等中的其他成分(例如，内源植物(包括藻类)酶，来自先前加工步骤的残留酶等)组合起作用。包括在该组合物中的多肽可以根据本领域中已知的方法稳定化。

所述组合物可以是表达多肽的细胞，包括能够从发酵产生产物的细胞。此类细胞能以乳膏或干燥形式与合适的稳定剂一起提供。此类细胞可以进一步表达另外的多肽，例如上面提到的多肽。

下面给出了本发明的多肽或组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用所述组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。

以上组合物适合在液化、糖化、和/或发酵过程中使用，优选地在淀粉转化中使用，尤其是用于产生糖浆和发酵产物(如乙醇)。

用途

本发明还针对本发明的多肽或组合物在液化过程、糖化过程、和/或发酵过程中的用途。可以在单个过程中，例如在液化过程、糖化过程、或发酵过程中使用所述多肽或组合物。也可以在过程的组合中(例如在液化和糖化过程、在液化和发酵过程中、或者在糖化和发酵过程中(优选地与淀粉转化有关))使用所述多肽或组合物。

1.液化

如本文所用，术语“液化(liquefaction或liquefy)”意指将糊化淀粉转化为含有较短链可溶性糊精的较低粘度液体的方法，任选地可添加液化诱导酶和/或糖化酶。在一些实施例中，将制备的淀粉底物用水制成浆。淀粉浆料可以含有淀粉，其干固体的重量百分比为约10％-55％、约20％-45％、约30％-45％、约30％-40％或约30％-35％。例如，可以用计量泵将α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)添加到浆料中。通常用于此应用的α-淀粉酶是热稳定的细菌α-淀粉酶，例如嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)α-淀粉酶，噬细胞菌属(Cytophaga)α-淀粉酶等，例如Spezyme(杜邦公司(DuPont)产品)、Spezyme AA(杜邦公司产品)、Fred(杜邦公司产品)、Clearflow AA(杜邦公司产品)、Spezyme Alpha PF(杜邦公司产品)、Spezyme Powerliq(杜邦公司产品)均可在本文中使用。

淀粉加α-淀粉酶的浆料可以通过喷射式蒸煮锅(将其蒸汽加热至80℃-110℃，取决于含淀粉原料的来源)连续泵送。在这些条件下，糊化快速发生，并且酶活性与显著的剪切力相结合而开始水解淀粉底物。在喷射式蒸煮锅中的停留时间是短暂的。然后部分糊化的淀粉可以进入一系列保持在105℃-110℃的保留管中并保持5-8min，以完成糊化过程(“初次液化”)。在85℃-95℃或更高温度下的保留槽中完成针对所需DE的水解持续约1至2小时(“二次液化”)。然后使浆料冷却至室温。此冷却步骤可以为30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。液化的淀粉通常为浆料形式，其干固体含量(w/w)为约10％-50％；约10％-45％；约15％-40％；约20％-40％；约25％-40％；或约25％-35％。

在常规的酶液化过程中，添加热稳定的α-淀粉酶并且将长链淀粉降解成支链且线性的更短单位(麦芽糊精)，但是没有添加葡糖淀粉酶。本发明的葡糖淀粉酶是高度热稳定的，所以在液化过程中添加该葡糖淀粉酶是有利的。

2.糖化

可以使用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(任选地在另外一种或多种酶的存在下)，将液化淀粉糖化成富含低DP(例如DP1+DP2)糖的糖浆。糖化的产物的确切组成取决于所使用的酶的组合以及所加工的淀粉的类型。有利地，使用所提供的葡糖淀粉酶可获得的糖浆可以含有糖化淀粉中总寡糖的DP2的重量百分比超过30％，例如45％-65％或55％-65％。糖化淀粉中(DP1+DP2)的重量百分比可以超过约70％，例如75％-85％或80％-85％。

液化通常作为连续工艺进行，而糖化通常作为分批工艺进行。糖化条件取决于液化物的性质和可用的酶类型。在一些情况下，糖化过程可涉及约60℃-65℃的温度和约4.0-4.5的pH(例如pH 4.3)。糖化可以在例如约40℃、约50℃、或约55℃至约60℃或约65℃的温度下进行，有必要冷却液化物。可以根据需要调节pH。糖化通常在搅拌槽中进行，这可能需要几个小时来填充或清空。酶通常以固定比率添加到干燥固体中(槽被填充时)，或者以单剂量添加(在填充阶段开始时)。制备糖浆的糖化反应通常进行约24-72小时，例如24-48小时。然而，通常仅在30℃-65℃之间(通常约60℃)的温度下进行通常40-90分钟的预糖化，然后在同时糖化和发酵(SSF)中完全糖化。本发明的葡糖淀粉酶是高度热稳定的，所以可以在高于常规的预糖化和/或糖化温度下进行本发明的预糖化和/或糖化。在一个实施例中，本发明的方法包括在同时糖化和发酵(SSF)方法之前将含淀粉的材料预糖化。在移入SSF之前，可以在高温(例如，50℃-85℃，优选是60℃-75℃)下进行预糖化。优选地，糖化最佳地在约30℃至约75℃的较高温度范围(例如45℃-75℃或50℃-75℃)内进行。通过在更高的温度下进行糖化过程，可以在更短的时段内进行所述过程，或可替代地可以使用更低的酶剂量来进行所述过程。此外，当在更高温度下进行液化和/或糖化过程时，微生物污染的风险减小。

在本发明的优选方面，所述液化和/或糖化包括顺序或同时地进行的液化和糖化过程。

3.发酵

通常在约32℃的温度(例如从30℃至35℃)，可以通过使淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵可溶性淀粉水解产物(特别是富含葡萄糖的糖浆)。“发酵生物”是指适用于发酵过程并且能够产生所需发酵产物的任何生物(包括细菌和真菌生物)。尤其适合的发酵生物能够直接地或间接地将糖(如葡萄糖或麦芽糖)发酵(即，转化)成所需的发酵产物。发酵生物的实例包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))和细菌(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。产乙醇微生物可以表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，上述两种酶将木糖转化为木酮糖。例如，可以承受更高温度的改善的产乙醇微生物菌株是本领域已知的并且可以使用的。参见Liu等人，(2011)ShengWu Gong Cheng Xue Bao[生物工程学报]27:1049-56。可商购的酵母包括例如Red Star(TM)/乐斯福(Lesaffre)乙醇红(从美国红星/乐斯福(Red Star/Lesaffre)公司可获得)、FALI(从美国伯恩斯菲利普食品有限公司(Burns Philp Food Inc.)的分公司弗莱施曼酵母(Fleischmann's Yeast)公司可获得)、SUPERSTART(从阿尔泰克公司(Alltech)可获得)、GERT STRAND(从瑞典的Gert Strand AB公司可获得)、以及FERMIOL(从帝斯曼食品配料部(DSM Specialties)可获得)。发酵的温度和pH将取决于发酵生物。通过发酵产生其他代谢产物如柠檬酸和乳酸的微生物也是本领域已知的。参见，例如Papagianni(2007)Biotechnol.Adv.[生物技术进展]25:244-63；John等人(2009)Biotechnol.Adv.[生物技术进展]27:145-52。

糖化和发酵过程可以作为SSF过程进行。可以用在整个SSF中连续表达和分泌葡糖淀粉酶的真菌细胞进行SSF过程。表达葡糖淀粉酶的真菌细胞也可以是发酵微生物，例如产乙醇微生物。因此，可以使用表达足够葡糖淀粉酶的真菌细胞进行乙醇生产，从而更少地需要或不需要外源地添加酶。真菌宿主细胞可以来自适当工程化的真菌菌株。除了葡糖淀粉酶之外，还可以使用表达和分泌其他酶的真菌宿主细胞。此类细胞可以表达淀粉酶和/或支链淀粉酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、蛋白酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶、或其他酶。发酵后可以回收乙醇。

4.粗淀粉水解

本发明提供了本发明的葡糖淀粉酶用于从粗淀粉或颗粒状淀粉中产生葡萄糖等的用途。通常，本发明的葡糖淀粉酶单独或在α-淀粉酶存在下可用于粗淀粉水解(RSH)或颗粒状淀粉水解(GSH)过程中用于产生所需的糖和发酵产物。所述颗粒状淀粉通过在糊化温度以下酶法水解来溶解。据报道，此类“低温”系统(也称为“无蒸煮”或“冷蒸煮”)能够处理比常规系统更高浓度的干固体(例如，高至45％)。

“粗淀粉水解”过程(RSH)不同于常规淀粉处理过程，包括通常在至少葡糖淀粉酶和/或淀粉酶存在下，在淀粉底物的糊化温度或低于淀粉底物的糊化温度下顺序或同时糖化和发酵颗粒状淀粉。在水中加热的淀粉在50℃与75℃之间开始糊化，糊化的确切温度取决于特定的淀粉。例如，糊化温度可根据植物物种、植物物种的具体变种以及生长条件而不同。在本发明的上下文中，给出的淀粉的糊化温度是应用Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/Starke，第44卷(12)第461-466页(1992)描述的方法使得淀粉颗粒的双折射损失为5％时的温度。

本发明的葡糖淀粉酶还可以结合仅水解在包含至少四个葡糖残基的分子中的α-(1,6)-糖苷键的酶来使用。优选地，本发明的葡糖淀粉酶与支链淀粉酶或异淀粉酶组合使用。在G.M.A.van Beynum等人,Starch Conversion Technology[淀粉转换技术],MarcelDekker[马塞尔·德克尔],纽约,1985,101-142中描述了异淀粉酶和支链淀粉酶用于淀粉脱支的用途、酶的分子性质、以及酶与葡糖淀粉酶一起使用的潜在用途。

在另一方面，本发明涉及本发明的葡糖淀粉酶的用途，包括将淀粉转化成例如糖浆饮料和/或发酵产物(包括乙醇)。

5.发酵产物

术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵过程的过程产生的产品。根据本发明考虑的发酵产物包括醇类(例如，***糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇(glycerol)、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙烯乙二醇]、丁二醇、甘油(glycerin)、山梨醇、以及木糖醇)；有机酸类(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、丁二酸、以及木糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸类(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；烷烃类(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；环烷烃类(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；烯烃类(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；气体类(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、以及一氧化碳(CO))；抗生素类(例如，盘尼西林和四环素)；酶类；维生素类(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)以及激素类。在优选的方面，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒精；或工业乙醇或消费醇类工业(例如啤酒和白酒)、乳制品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选使用的发酵过程包括本领域熟知的醇发酵过程。优选的发酵方法为厌氧发酵方法，所述方法是为本领域熟知的。

6.酿造

本发明的葡糖淀粉酶是高度热稳定的，因此它们可以在高温下用于淀粉水解以制备发酵的麦芽饮料。例如，可以将本发明的葡糖淀粉酶添加到热醪液中，利用升高的温度来增加反应速率并在添加酵母之前增加可发酵糖的产量。与淀粉酶和任选的支链淀粉酶和/或异淀粉酶组合，葡糖淀粉酶有助于将淀粉转化为糊精和可发酵糖，降低最终啤酒中残留的非可发酵碳水化合物。按本领域技术人员可容易确定的有效量来添加本发明的葡糖淀粉酶。

用于制造啤酒的过程在本领域中是熟知的。参见例如Wolfgang Kunze(2004)“Technology Brewing and Malting[技术酿造与制麦芽]”Research and TeachingInstitute of Brewing,Berlin[柏林酿酒研究与教学研究所](VLB),第3版。简而言之，所述过程涉及：(a)制备醪液，(b)过滤醪液以制备麦芽汁，和(c)发酵麦芽汁以获得发酵饮料(如啤酒)。

可以将包含与淀粉酶和任选的支链淀粉酶和/或异淀粉酶组合的葡糖淀粉酶的酿造组合物添加到上述步骤(a)的醪液中，即在醪液的制备期间添加。可替代地或除此之外，可以将酿造组合物添加到上述步骤(b)的醪液中，即在醪液的过滤期间添加。可替代地或除此之外，可以将酿造组合物添加到上述步骤(c)的麦芽汁中，即在麦芽汁的发酵期间添加。

出于所有目的，本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文结合在此。为了进一步说明组合物和方法及其优点，给出以下具体实例，应理解它们是说明性的而不是限制性的。

实例

实例1

拉塞尔青霉菌葡糖淀粉酶(PruGA1)的序列

选择可用于工业应用的拉塞尔青霉菌菌株作为各种酶的潜在来源。对拉塞尔青霉菌菌株的整个基因组进行测序，并通过序列一致性确定推定葡糖淀粉酶(指定为“PruGA1”)的核苷酸序列。编码PruGA1的基因如SEQ ID NO:1所示：

PruGA1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：

通过N末端埃德曼(Edman)降解证实的PruGA1的成熟形式的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示：

实例2

拉塞尔青霉菌葡糖淀粉酶(PruGA1)的表达和纯化

合成的、来自于拉塞尔青霉菌的PruGA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：

PruGA1的DNA序列针对PruGA1在里氏木霉中表达得到优化，且***pTrex3gM表达载体(描述于美国公开申请2011/0136197A1中)，得到pJG580(图1)。

使用原生质体转化(Te’o等人,J.Microbiol.Methods[微生物方法杂志]51:393-99 2002)将质粒pJG580转化到里氏木霉菌株中(描述于WO05/001036中)。通过WO 2016/138315中描述的方法选择并发酵上所述转化体。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析和酶活性测定来确认蛋白质表达。

随后使上述转化的细胞的种子培养物在2.8L发酵罐中在确定成分培养基中生长。在42、65和95小时的发酵时间对发酵液进行取样以进行SDS-PAGE分析，测量干细胞重量、残余葡萄糖和胞外蛋白浓度。图2显示了PruGA1在95小时发酵的产物分布图。在发酵95小时后，随后离心、过滤和浓缩，获得500mL浓缩样品。通过BCA方法确定蛋白质浓度为10.7g/L。

将200mL澄清的培养液装料到20-mLβ-环糊精偶联的Sepharose 6柱(用的20mM乙酸钠(pH 5.0)、150mM NaCl预平衡)上，然后用3柱体积的相同缓冲液洗涤。使用5柱体积的10mMα-环糊精在含有150mM NaCl的20mM乙酸钠(pH 5.0)中进行洗脱。收集级分并测定葡糖淀粉酶活性并进行SDS-PAGE。合并含有靶蛋白的级分，在具有10K MWCO的Amicon Ultra-15装置中，使用含有150mM NaCl的20mM乙酸钠(pH 5.0)进行浓缩。纯化的样品纯度高于99％，并在-80℃下储存在40％的丙三醇中直至使用。

实例3

PruGA1对可溶性淀粉的比活度

使用偶联的葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(GOX/HRP)法(Anal.Biochem.105(1980),389-397)，基于通过葡糖淀粉酶从可溶性淀粉释放葡萄糖来测定葡糖淀粉酶比活度。

通过在15-mL锥形管中混合9mL可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)和1mL 0.5M pH 5.0的乙酸钠缓冲液来制备底物溶液。在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中制备具有ABTS的偶联酶(GOX/HRP)溶液，其中终浓度为2.74mg/mL ABTS、0.1U/mL HRP、和1U/mL GOX。

在纯化水中制备葡糖淀粉酶样品和葡萄糖标准品的连续稀释液。将每份葡糖淀粉酶样品(10μL)转移到新的含有90μL在50℃下以600rpm预孵育5min的底物溶液的微量滴定板(康宁公司(Corning)3641)中。该反应在50℃下进行10min(在热混合器(Eppendorf)中振荡(600rpm))，分别地将10μL反应混合物以及10μL葡萄糖标准品的连续稀释液快速转移至新的微量滴定板(康宁公司(Corning)3641)，然后，添加100μL ABTS/GOX/HRP溶液。立即使用SoftMax Pro酶标仪(分子装置公司(Molecular Device))以11秒间隔持续5min测量405nm处的吸光度。输出是每种酶浓度的反应速率(Vo)。线性回归用于确定Vo相比于酶剂量的曲线的斜率。使用等式1基于葡萄糖标准曲线计算葡糖淀粉酶的比活度：

比活度(单位/mg)＝ 斜率(酶)/斜率(标准)× 1000 (1)，

其中1单位＝1μmol葡萄糖/分钟。

使用上述方法，确定PruGA1的比活度，并与基准AnGA(来自黑曲霉的葡糖淀粉酶)进行比较。结果显示在表2中。PruGA1对可溶性淀粉的比活度为197U/mg，比另一种葡糖淀粉酶AnGA高约2倍。

表2.与AnGA相比，纯化的PruGA1对可溶性淀粉的比活度

实例4

葡糖淀粉酶PruGA1的支链淀粉水解活性

使用与上述测定葡糖淀粉酶PruGA1对可溶性淀粉的比活度相同的方案(不同之处在于将酶以10ppm给药)测定葡糖淀粉酶对支链淀粉的活性。表3总结了PruGA1和基准AnGA的支链淀粉水解活性。PruGA1对支链淀粉的活性比AnGA对支链淀粉的活性高大约6倍。

表3.与AnGA相比，PruGA1的支链淀粉水解活性。

实例5

pH和温度对PruGA1葡糖淀粉酶活性的影响

使用可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)作为底物监测pH(2.0至10.0)对PruGA1活性的影响。缓冲工作溶液由甘氨酸/乙酸钠/HEPES(250mM)的组合组成，pH在2.0至10.0之间变化。通过将可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)与250mM缓冲溶液以9:1的比例混合来制备底物溶液。在水中以某个剂量制备酶工作溶液(显示根据剂量响应曲线在线性范围内的信号)。按照与上述葡糖淀粉酶PruGA1对可溶性淀粉的比活度相同的方案，所有孵育都在50℃下进行10min。将每种pH下的酶活性报告为与最佳pH下的酶活性相比的相对活性。PruGA1的pH曲线显示在表4中。发现PruGA1在约5.0时具有最佳pH并且在pH 2.8与7.0之间保持最大活性的70％以上。

表4.PruGA1的pH曲线

使用可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)作为底物监测温度(从40℃至84℃)对PruGA1活性的影响。通过将9mL可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)和1mL 0.5M的缓冲液(pH 5.0乙酸钠)在15mL锥形管中混合来制备底物溶液。在水中以某个剂量制备酶工作溶液(显示根据剂量响应曲线在线性范围内的信号)。按照与上述葡糖淀粉酶PruGA1对可溶性淀粉的比活度相同的方案，分别在40℃至84℃的温度下进行孵育10min。将每个温度下的活性报告为与最佳温度下的酶活性相比的相对活性。PruGA1的温度曲线显示在表5中。PruGA1在75℃时展示出最佳活性，并且在63℃与79℃之间保持最大活性的70％以上。

表5.PruGA1的温度-活性曲线

温度(℃)	相对活性(％)
		40	24
44.7	34
		49.4	42
55	54
		59.7	63
65	77
		69.2	90
74.6	100
		80	58
85	19

实例6

在不同温度下在pH 4.5，PruGA1的糖化性能

在pH 4.5下以不同的孵育温度在糖化条件下评估PruGA1、AnGA和AfuGA(描述于WO2014092960中)的活性。通过分析具有相等酶剂量的糖组合物来测量DP1的评估。将α-淀粉酶预处理的玉米淀粉液化物(34.9％ds、pH 3.8下制备)用作起始底物。葡糖淀粉酶(以0.121mg/gds作为1×剂量给药)和玉米淀粉液化物(34％ds)的孵育在pH 4.5分别在60℃、65℃和70℃下进行。分别在16、24、40、64和72h时收集样品。通过在100℃加热15min来猝灭所有孵育。转移样品上清液并在5mM H₂SO₄中稀释400倍，使用Agilent 1200系列系统(具有Fast Fruit柱(100mm×7.8mm))，在85℃下运行用于HPLC分析。将10μL样品加载到柱上，并用等梯度的纯化水作为流动相以1.0mL/min的流速分离。使用折射率检测器检测寡糖产物。样品的生糖活性(glucogenic activity)总结在表6中。选择72-h孵育后的DP1％(图3)为例，在所有三个测试温度下，0.3×剂量(40μg/gds)的PruGA1优于AfuGA-1×剂量(121μg/gds)和AnGA-1×剂量(121μg/gds)。即使当孵育温度升高到70℃时，PruGA1在DP1生产方面仍保持其优异的性能。样品的生糖活性总结在表6中。

表6.在不同温度下在pH 4.5用玉米淀粉液化物孵育的PruGA1、AfuGA和AnGA(1x剂量设定为121μg/gds)的DP1产生。

实例7

在pH 5.5和70℃下的PruGA1糖化评估

评估PruGA1在升高的温度下(旨在缩短糖化时间)的生糖活性。玉米淀粉液化物(32％ds，pH 3.9)获得自α-淀粉酶预处理的玉米淀粉液化物。在pH 5.5、70℃下进行具有不同剂量的PruGA1和玉米淀粉液化物(32％ds)的孵育。在18、26、42、50、66和72h收集样品。通过在100℃加热15min来猝灭所有孵育。转移样品的上清液并在5mM H₂SO₄中稀释400倍，使用与实例6中所示相同的条件用于HPLC分析。样品的生糖活性总结在表7中。结果显示，在pH5.5、70℃孵育两天后，PruGA1(以30μg/gds给药)可达到>95％的DP1生产。

表7.在pH 5.5和70℃的糖化条件下，使用玉米淀粉液化物作为底物，

不同剂量的PruGA1(20至50μg/gds)的糖生产

实例8

PruGA1的粗淀粉活性

测量了PruGA1对粗淀粉的活性，并将其与里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的活性进行比较，用于颗粒状淀粉水解酶(GSHE)发酵和直接将淀粉水解至葡萄糖/麦芽糖过程(DSTG/DSTM)。在该测定中，将α-淀粉酶和葡糖淀粉酶以1:6.6的比例混合。使用白曲霉(Aspergillus kawachii)淀粉酶(AkAA，描述于WO 2013169645中)。使用Fast Fruit HPLC柱(沃特斯公司(Waters))进行糖谱分析，并使用葡萄糖(最终产物)确定酶粗淀粉水解能力。

使用宽口吸头将150μL玉米淀粉底物(1％，在50mM pH 3.5/pH 4.5乙酸盐缓冲液中)分配到0.5mL微量滴定板中。每孔添加10μL淀粉酶和10μL葡糖淀粉酶以设定AkAA和葡糖淀粉酶的最终剂量分别为1.5ppm和10ppm。将样品置于设定在32℃、900rpm的iEMS培养箱中培养6、20和28h。添加50μL的0.5M NaOH以猝灭反应，并通过将板置于振荡器上2min来悬浮淀粉塞。之后，将板密封并以2500rpm离心3min。对于HPLC分析，使用0.01N H₂SO₄将上清液稀释10倍。使用配备有折射率检测器的Agilent 1200系列HPLC分析10μL样品。所使用的柱是具有Phenomenex Rezex ROA有机酸保护柱(目录号03B-0138-K0)的Phenomenex Rezex-RFQFast Fruit柱(目录号00D-0223-K0)。流动相为0.01N H₂SO₄，并且在85℃下流速为1.0mL/min。结果显示在图4和图5中。PruGA1在pH 3.5和pH 4.5下对粗淀粉均表现出与基准葡糖淀粉酶TrGA相当的活性。

实例9

低pH发酵中PruGA1的评估

评估了PruGA1在低pH发酵条件下生糖活性。在相同的蛋白质浓度(0.25mg/gds)下测试PruGA1和TrGA的性能。将淀粉酶处理的玉米淀粉液化物(34.9％ds，pH 3.8)用作底物。将玉米淀粉液化物(32％ds、淀粉酶预处理)的pH调节至pH 3.0，并将10g转移至50mL玻璃瓶中。在32℃和55℃下进行孵育。在17、24、41、48、63、72h收集样品。通过在100℃加热15min来猝灭所有孵育。转移样品的上清液并在5mM H₂SO₄中稀释400倍，使用与实例7中所示相同的条件用于HPLC分析。

表7中报告的值反映了每个DPn的峰面积百分比作为总DP1、DP2、DP3和DP3+的小部分。表8中的数据显示，当以相等的蛋白质浓度给料并在32℃、pH 3下孵育时，PruGA1表现出比TrGA更高的生糖活性。当孵育温度升至55℃时，PruGA1非常有效地水解高DP糖，孵育17h后仅剩下5％DP3+，而TrGA剩余为18％。

为了进一步评估PruGA1在低pH下的性能，在甚至更低的pH(pH2.0)下对淀粉液化物进行另一个测试。筛选程序与在pH 3.0时相同(不同之处在于将酶以0.2mg/gds给料)，并且在4、21、29、45、53、70h收集样品。如表9所示，在pH 2和32℃下，在70h后，PruGA1释放的DP1为77.4％、而TrGA释放54％。PruGA1在55℃释放的DP1百分比为26.2％，而TrGA反应仅为3.2％。

表8.在pH 3、32℃或55℃下，PruGA1和TrGA水解淀粉液化物的糖组成分析

表9.在pH 2、32℃或55℃下，PruGA1和TrGA水解淀粉液化物的糖组成分析

实例10

在麦芽汁底物上用葡糖淀粉酶高温浸出糖化

与用于酿造应用麦芽汁底物的其他葡糖淀粉酶基准相比较，评估了PruGA1在高温浸出糖化过程中的生糖活性。

用55％比尔森麦芽(比尔森麦芽(Pilsner malt)；丹麦福格桑(Fuglsang)公司，批次13.01.2016)和45％玉米谷粉(北欧布伦塔格公司(Benntag Nordic)；NordgetreideGmBH Lübec，德国，批次：02.05.2016)，使用4.0:1的水与谷粉的比率进行糖化操作。比尔森麦芽在布勒公司(Buhler Miag)麦芽研磨机(0.5mm设置)上研磨。将粗玉米(1.35g)、麦芽(研磨的比尔森麦芽，1.65g)在Wheaton杯(带盖的Wheaton玻璃容器)中混合，用12.0g自来水预孵育，用2.5M硫酸将pH调节至pH 5.4。然后将所得底物(15％ds，pH 5.4)用于葡糖淀粉酶性能评价。将PruGA1(10μL的1mg/mL原液)添加到90μL分配在PCR微量滴定板(爱思进公司(Axygen))中的底物中。评估的其他葡糖淀粉酶是：TrGA变体A、里氏木霉葡糖淀粉酶变体(具有取代D44R和D539R，10μL的2mg/mL原液)和黑曲霉葡糖淀粉酶(AnGA，10μL的1mg/mL原液)。所有孵育均在64℃下进行4h，或者对于甚至更高的糖化温度，孵育在70℃下进行2h；然后在79℃下进行15min。在95℃下猝灭反应持续10min后，将反应混合物在3700rpm离心10min。转移上清液样品并在5mM H₂SO₄中稀释20倍用于HPLC分析。使用Agilent 1200系列HPLC系统在85℃下用Fast fruit柱(100mm×7.8mm)进行HPLC分离。将样品(10μL)加载到HPLC柱上，并用等梯度的纯化水作为流动相以1.0mL/min的流速分离。使用折射率检测器检测寡糖产物。样品的生糖活性总结在表10中。100ppm PruGA1样品在200ppm下表现出与TrGA变体A(TrGA vA)葡糖淀粉酶相当的性能。当孵育温度升高至70℃并且孵育时间缩短至2h时，PruGA1酶也显示出优于基准的性能。

表10.用麦芽汁底物在pH 5.4下孵育葡糖淀粉酶的糖组成分析

实例11

使用麦芽和玉米用葡糖淀粉酶进行高温浸出糖化

用55％比尔森麦芽(比尔森麦芽；丹麦福格桑公司，批次13.01.2016)和45％玉米谷粉(北欧布伦塔格公司；Nordgetreide GmBH Lübec，德国，批次：02.05.2016)使用4.0:1的水与谷粉的比率在糖化操作中测试葡糖淀粉酶PruGA1。使用布勒公司(Buhler Miag)麦芽研磨机(0.5mm设置)研磨比尔森麦芽。

将粗玉米(1.35g)和麦芽(研磨的比尔森麦芽，1.65g)在Wheaton杯(带盖的Wheaton玻璃容器)中混合，用12.0g自来水预孵育，用2.5M硫酸将pH调节至pH 5.4。基于ppm活性蛋白质(总共1.0ml)添加葡糖淀粉酶，并且添加水作为无酶对照。将Wheaton杯置于Drybath(赛默科技公司主工作台(Thermo Scientific Stem station)中，磁力搅拌并应用以下糖化程序；加热样品到64℃持续30分钟，保持在64℃持续15分钟；通过以1℃/分钟升高温度来加热至79℃持续15分钟；保持在79℃持续15分钟；通过以1℃/分钟升高温度来加热至90℃持续11分钟，保持在90℃持续15分钟；冷却至79℃保持15分钟，并且最后加热至79℃持续15分钟并洗出(mashed off)。将10ml样品转移至福尔肯管中并在100℃下煮沸20分钟以确保酶完全失活。在10℃下，通过在Heraeus Multifuge X3R中以4500rpm离心20分钟，将谷物与麦芽汁分离。使用标准方法收集上清液进行HPLC糖分析。结果显示在表11中。

表11.通过HPLC确定麦芽汁中糖(DP1至DP5+)的相对分布

很明显，PruGA1以剂量依赖性方式促进DP1的高产量。在750ppm酶的剂量下产生高达83.44％的DP1。

实例12

100％玉米在高温下用葡糖淀粉酶浸出糖化

此实验的目的是评估与工业基准相比，在使用玉米和麦芽的高温糖化过程中PruGA1的生糖活性。用100％玉米粉(北欧布伦塔格公司；Nordgetreide GmBH Lübec，德国，批次：02.05.2016)，使用4.0:1的水与谷粉的比率进行糖化操作。

将粗玉米(3.0g)添加到Wheaton杯(带盖的Wheaton玻璃容器)，用12.0g自来水预孵育，用2.5M硫酸将pH调节至pH 5.4。基于ppm活性蛋白质(总共1.0ml)添加葡糖淀粉酶，或添加水作为无酶对照。在所有样品中应用固定浓度的5.0ppm的α-淀粉酶(来自杜邦公司的5T)和0.21ppm的β-葡聚糖酶(来自杜邦公司的750)以促进液化和过滤性(filterbility)。将Wheaton杯置于Drybath(赛默科技公司主工作台)中，磁力搅拌并应用三种不同的糖化程序。根据曲线1，将样品加热至64℃；保持在64℃下持续80分钟；通过以1.6℃/分钟升高温度来加热至80℃保持10分钟；保持在80℃持续30分钟，然后洗出。根据曲线2，将样品加热至70℃；保持在70℃下持续80分钟；通过以1.0℃/分钟升高温度来加热至80℃持续10分钟；保持在80℃持续30分钟，然后洗出；根据曲线3，将样品加热至75℃；保持在75℃下持续80分钟；通过以0.5℃/分钟升高温度来加热至80℃保持10分钟；保持在80℃持续30分钟，然后洗出。将10ml样品转移至福尔肯管中并在100℃下煮沸20分钟以确保酶完全失活。在10℃下，通过在Heraeus Multifuge X3R中以4500rpm离心20分钟，将谷物与麦芽汁分离。收集上清液用于HPLC糖分析。样品的生糖活性总结在表12中。

表12.使用100％玉米使用各种温度在pH 5.4下浸出糖化后葡糖淀粉酶的糖组成分析。

与TrGA(来自里氏木霉葡糖淀粉酶的野生型)(终浓度：18ppm)相比，PruGA1在70℃和75℃糖化曲线下表现出增强的性能(终浓度：18ppm)。