一种葡糖淀粉酶的生产方法
阅读说明：本技术 一种葡糖淀粉酶的生产方法 (Production method of glucoamylase ) 是由 冯玉枚 马良 向斌 曾佳 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种葡糖淀粉酶的生产方法,属于微生物发酵工程领域,葡糖淀粉酶的生产过程中采用槐糖补料来补充发酵液中的碳源,其槐糖中三糖的浓度为：总糖47g/100ml-65g/100ml；还原糖40g/100ml-55 g/100ml；葡萄糖38g/100ml-50 g/100ml,采用槐糖补料过程中,控制发酵液中的还原糖浓度0.7-1.2g/100ml,槐糖的补料速率控制在3.5g/L/h-7.0 g/L/h。本发明根据菌种的生长代谢特性流加槐糖,速率控制在3.5-7.0g/L/h(以总糖浓度计),既能促进黑曲霉的生长代谢,又可以诱导菌体提高葡糖淀粉酶产率效率,提升发酵水平。(The invention relates to a production method of glucoamylase, belonging to the field of microbial fermentation engineering, wherein a carbon source in fermentation liquor is supplemented by adopting sophorose supplementary materials in the production process of glucoamylase, and the concentration of trisaccharide in sophorose is as follows: total sugar 47g/100ml-65g/100 ml; reducing sugar 40g/100ml-55g/100 ml; 38g/100ml-50g/100ml of glucose, and in the feeding process of sophorose, the concentration of reducing sugar in the fermentation liquor is controlled to be 0.7-1.2g/100ml, and the feeding rate of sophorose is controlled to be 3.5g/L/h-7.0 g/L/h. The invention adds sophorose according to the growth metabolism characteristic of the strain, the speed is controlled at 3.5-7.0g/L/h (based on the total sugar concentration), the growth metabolism of Aspergillus niger can be promoted, the thallus can be induced to improve the yield efficiency of glucoamylase, and the fermentation level is improved.)
技术领域
本发明涉及建筑材料技术领域，具体涉及一种葡糖淀粉酶的工业生产方法。
背景技术
葡糖淀粉酶是一种由微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶，该酶能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物中非还原末端α-1,4糖苷键，释放β-D-葡萄糖。在发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，需求量巨大，是最重要的工业酶制剂之一。碳源是菌体进行生长和代谢过程重要的营养元素，也是葡糖淀粉酶分子的主要组成元素，黑曲霉是工业生产葡糖淀粉酶的主要菌种之一。黑曲霉产糖化酶的生产过程中，不同的碳源会导致发酵中生物量大，酶活低现象，不合理的补糖速率往往会导致发酵过程中还原糖、溶氧的波动从而引起代谢异常，菌体提前衰老，高效产酶时间提前结束。所以糖能直接影响微生物的生长和代谢，菌体在不同的生理时期对糖耗的需求也不同。因此，探索出优质的碳源基质及过程合理的控糖标准是提升黑曲霉发酵过程中重要的工作。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种黑曲霉高效产葡糖淀粉酶的生产方法，通过选择合适的碳源，改进过程补料补加时间和补加量，使黑曲霉液态发酵产葡糖淀粉酶的产量明显提高。
本发明采取的技术方案是，
一种葡糖淀粉酶的生产方法，其特征在于，葡糖淀粉酶的生产过程中采用槐糖补料来补充发酵液中的碳源，其槐糖中三糖的浓度为：总糖 47g/100ml-65g/100ml；还原糖40g/100ml-55g/100ml；葡萄糖38g/100ml-50 g/100ml。
优选地，采用槐糖补料过程中，控制发酵液中的还原糖浓度0.7-1.2g/100ml，槐糖的补料速率控制在3.5g/L/h-7.0g/L/h。
进一步优选地，葡糖淀粉酶的生产过程中，控制溶氧不低于20％。
更进一步优选地，槐糖补料过程具体操作为：待葡糖淀粉酶发酵培养基中糊精耗尽开始启补糖(槐糖)速率2.0g/L/h，在启补糖后的10-15h内提高补糖速率至7.0g/L/h，此速率根据体积每12h调整一次，过程发酵液中还原糖浓度稳定在0.7-1.2g/100ml，90-120h后发酵液中还原糖的含量高于1.2g/100ml或溶氧低于20％，则梯度减糖至3.5g/L/h，维持发酵液中的还原糖浓度0.7-1.2g/100ml。发酵90h-120h前维持补糖速率至7.0g/L/h快速提高菌体的产酶活力，90-120h 后根据溶氧和发酵液中还原糖的含量高于1.2g/100ml则梯度减糖至3.5g/L/h，稳定菌体的代谢环境，并降低菌体代谢中的糖阻遏效应。
进一步优选地，所述方法包括以下培养基：
活化培养基：为每1L水中含糊精220-330g、玉米浆20-40g、硫酸铵20-40g、 pH4.0-4.5；
种子培养基：为1L水中含糊精190-330g、玉米浆20-40g、硫酸铵20-40g、 pH4.5-5.0；
二级种子培养基：为1L水中含糊精170-360g、玉米浆20-40g、硫酸铵20-40g、pH4.5-5.0；
葡糖淀粉酶发酵培养基：为1L水中含糊精130-300g、玉米浆40-70g、硫酸铵20-40g、豆粕粉5g-20g、pH4.5-5.0；
补料为总糖47g/100ml-65g/100ml；还原糖40g/100ml-55g/100ml；葡萄糖 38g/100ml-50g/100ml的自配槐糖补料。
更进一步优选地，所述方法具体包括以下步骤：
①菌种活化：将葡糖淀粉酶生产菌的菌落接于活化培养基中，培养2.5-3.5d，得到活化培养液；
②种子一级培养：将步骤①所得活化培养液500ml-800ml接入100L种子培养基，培养50h-80h，得到种子培养液；
③种子二级培养：将步骤②所得种子培养液扩大至1500L二级种子培养基，培养30h-45h得到二级种子液；；
④葡糖淀粉酶发酵培养：将步骤③所得二级种子液接于10m3葡糖淀粉酶发酵培养基中，培养140h-170h。
进一步优选地，葡糖淀粉酶生产菌为黑曲霉。葡糖淀粉酶的菌体对糖的需求比较大，为延长葡糖淀粉酶的生长活跃期，补料的选择及过程糖耗的控制对其生长就很重要。所以选择浓缩后的槐糖，结合罐上代谢指标合理控制补糖速率以达到菌体产酶的最大化。在代谢过程中，菌体培养至90-120h会出现明显的生长拐点，90-120h前产酶高峰期，需给予足够的溶氧和补料，保证菌体的活力。90-120h 后即菌体开始快速衰老，代谢过程中残糖积累，溶氧下降，酶活增幅减小。为延长其菌体的生长周期，需及时降低补料和稳定溶氧。
本发明具有以下效果：
1、本发明采用了多级放大生产，达到发酵产值的最高，通过对碳源基质和过程补料工艺的优化，葡糖淀粉酶放大生产的酶活可达到60000IU/ml。
2、通过筛选不同类别的碳源，实验得出槐糖更有利于黑曲霉产葡糖淀粉酶，能更好的促进前期菌体的生长和菌体快速进入代谢产酶期，明显提高过程酶活的增幅。可能是槐糖中三糖(总糖，还原糖，葡萄糖)的比例对菌体过程产酶有促进作用，槐糖中还原糖的比例可以诱导菌体产葡糖淀粉酶，其中大量的葡萄糖也能保证菌体的生长代谢。
3、本发明选择适应菌体生长的补料成份，优化过程补料的精细控制，过程糖耗的控制与代谢参数的协同，过程糖耗的控制速率与还原糖的变化为参照值，稳定发酵液中的还原糖浓度，即控制菌体的最高代谢速率。发酵90h-120h前提高补糖速率至7.0g/L*h快速提高菌体的产酶活力，90h-120h后根据溶氧和发酵液中还原糖的含量适量减糖至3.5g/L/h，稳定菌体的代谢环境，并降低菌体代谢中的糖阻遏效应。所以优化后的过程工艺控制在26m3罐生产葡糖淀粉酶平均放罐酶活可达53458IU/ml。
4、葡糖淀粉酶生产菌为黑曲霉，其菌体对碳源的要求较高，选取合适的碳源物质，特别是碳源中合适的三糖比例能促进生物量与产酶效率能等比例的增长，通过液态发酵水平的验证，自备的高浓度槐糖能高效刺激菌体代谢产酶。
5、利用自备的槐糖作为碳源后，结合过程溶氧参数、发酵液中还原糖的积累量合理控制过程槐糖的补入量，得出较优的过程控糖速率曲线，通过放罐酶活和过程酶活的增幅验证。
附图说明
图1本发明的工艺验证过程；
图2实施例2中试验2过程代谢参数图；
图3实施例3补糖速率与发酵液中还原糖对应图；
图4实施例3补料各成分色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
实施例1
一种葡糖淀粉酶的发酵方法，所述方法包括如下步骤：
①菌种活化：将葡糖淀粉酶生产菌菌落接于活化培养基中，34℃培养，培养3d，300rpm摇瓶机上培养，得到活化培养液；
所述活化培养基为每1L水中含糊精270g、玉米浆30g、硫酸铵30g、pH4.0-4.5。
②种子一级培养：将步骤①所得活化培养液700ml接入100L种子培养基，34℃培养，培养700h，得到一级种子培养液；
所述种子培养基为1L水中含糊精260g、玉米浆30g、硫酸铵30g、pH4.5-5.0。
③种子二级培养：将步骤②所得种子液扩大至1500L种子培养基培养，34℃培养，培养40h得到二级种子液。
所述二级种子培养基为1L水中含糊精250g、玉米浆30g、硫酸铵30g、pH4.5-5.0。
④葡糖淀粉酶发酵培养：将步骤③所得种子液接于10m3发酵培养基中，34℃培养，培养160h，所述葡糖淀粉酶发酵培养基为1L水中含糊精220g、玉米浆60g、硫酸铵30g、豆粕粉15g。
补氨水：发酵过程为产酸过程，补加氨水将pH控制要求范围4.7-4.9。
优化葡糖淀粉酶的生产方法前需进行上述①②③④准备，步骤④葡糖淀粉酶发酵培养过程中，从不同的碳源基质中筛选出最利于菌体生长产酶的碳源来进行补料，控制发酵液中的还原糖浓度0.7-1.2g/100ml，具体补料过程为：启补糖速率2.0g/L/h，每小时补糖速率递增0.5g/L/h，10-15h内提升至设定5.5g/L/h，发酵90h-120h前维持设定的5.5g/L/h，90h-120h后根据菌体代谢情况调整中后期糖耗。所供筛选的碳源如下表1；由表1可知，最合适的碳源为槐糖。
表1
实施例2
在实施例1的基础上，选择槐糖作为产酶较高的碳源后，改变不同的补料速率的上限，具体方案见表2。优化葡糖淀粉酶的生产方法前需进行上述①②③④准备，启补糖速率2.0g/L/h，每小时补糖速率递增0.5g/L/h，10-15h内提升至设定最高速率，发酵90h-120h前维持设定的最高补糖速率，90h-120h后根据菌体代谢情况调整中后期糖耗，补糖速率下限为3.5g/L/h，。结合罐上参数溶氧、还原糖，通过过程酶活增幅及放罐水平优化出最佳的过程补料工艺，并在罐上验证酶活水平。由表2可知，补糖的最高速率在7.0g/L/h，能得到最高酶活水平。
表2
其中，黑曲霉产葡糖淀粉酶过程使用槐糖作为补料，并将补糖上限设定 7.0g/L/h，中后期减糖下限至3.5g/L/h，菌体能充分利用补料用于生长和代谢产酶。试验2具体代谢参数如图2。试验2能在发酵165h，放罐酶活达到 57262IU/ml。
实施例3
一种葡糖淀粉酶的发酵方法，所述方法包括如下步骤：
①菌种活化：将葡糖淀粉酶生产菌菌落接于活化培养基中，34℃培养，培养3d，300rpm摇瓶机上培养，得到活化培养液；
所述活化培养基为每1L水中含糊精270g、玉米浆30g、硫酸铵30g、pH4.0-4.5。
②种子一级培养：将步骤①所得活化培养液700ml接入100L种子培养基，34℃培养，培养700h，得到一级种子培养液；
所述种子培养基为1L水中含糊精260g、玉米浆30g、硫酸铵30g、pH4.5-5.0。
③种子二级培养：将步骤②所得种子液扩大至1500L种子培养基培养，34℃培养，培养40h得到二级种子液。
所述二级种子培养基为1L水中含糊精250g、玉米浆30g、硫酸铵30g、pH4.5-5.0。
④葡糖淀粉酶发酵培养：将步骤③所得种子液接于10m3发酵培养基中，34℃培养，培养160h，所述葡糖淀粉酶发酵培养基为1L水中含含糊精220g、玉米浆 60g、硫酸铵30g、豆粕粉15g。
发酵过程中使用补料槐糖其浓度为总糖61.8g/100ml、还原糖54.1g/100ml、葡萄糖43.2g/100ml。发酵43h时启补槐糖2.0g/L/h(以总糖计)，若溶氧在 20％-40％之间波动，每小时补糖速率递增0.5g/L/h，上限为7.0g/L/h，控制溶氧在20％以上，还原糖0.7-1.2g/100ml，若溶氧下降或还原糖含量上升，则降低补糖速率以维持溶氧和还原糖的含量，此次实验57h达到补糖上限，过程维持补糖上限7.0g/L/h，在94h-100h时，偏离维持的溶氧和还原糖参数，开始减糖，其下限为3.5g/100ml。
补氨水：发酵过程为产酸过程，补加氨水将pH控制要求范围4.7-4.9。葡糖淀粉酶发酵167h所得粗酶液的葡糖淀粉酶活力59192IU/ml。
对比例1
在实施例3的基础上，改变补料参数：发酵过程中使用补料槐糖其浓度为总糖61.8g/100ml、还原糖54.1g/100ml、葡萄糖43.2g/100ml。发酵45h时启补槐糖2.0g/L/h(以总糖计)，若溶氧在20％-40％之间波动，每小时补糖速率递增0.5g/L/h，上限为5.0g/L/h，控制溶氧在20％以上，还原糖0.3-0.6g/100ml，若溶氧下降或还原糖含量上升，则降低补糖速率以维持溶氧和还原糖的含量，此次实验51h达到补糖上限，过程维持补糖上限，在137h时，偏离维持的溶氧和还原糖参数，开始减糖，其下限为3.5g/100ml。
补氨水：发酵过程为产酸过程，补加氨水将pH控制要求范围4.7-4.9。葡糖淀粉酶发酵165h所得粗酶液的葡糖淀粉酶活力46727IU/ml。
对比例2
在实施例3的基础上，改变补料参数：发酵过程中使用补料槐糖其浓度为总糖61.8g/100ml、还原糖54.1g/100ml、葡萄糖43.2g/100ml。发酵45h时启补槐糖2.0g/L/h(以总糖计)，若溶氧在20％-40％之间波动，每小时补糖速率递增0.5g/L/h，上限为7.0g/L/h，控制溶氧在20％以上，还原糖1.3-1.5mg/100ml，若溶氧下降或还原糖含量上升，则降低补糖速率以维持溶氧和还原糖的含量，此次实验55h达到补糖上限，过程维持补糖上限，在93h-99h时，偏离维持的溶氧和还原糖参数，开始减糖，其下限为3.5g/100ml。
补氨水：发酵过程为产酸过程，补加氨水将pH控制要求范围4.7-4.9。葡糖淀粉酶发酵165h所得粗酶液的葡糖淀粉酶活力47692IU/ml。
对比例3
在实施例3的基础上，改变补料参数：发酵过程中使用自配65％葡萄糖溶液，其浓度为总糖68g/100ml、还原糖65g/100ml、葡萄糖64g/100ml。发酵45h时启补葡萄糖2.0g/L/h(以总糖计)，若溶氧在20％-40％之间波动，每小时补糖速率递增0.5g/L/h，上限为g/L/h，控制溶氧在20％以上，还原糖0.7-1.2g/100ml，若溶氧下降或还原糖含量上升，则降低补糖速率以维持溶氧和还原糖的含量，此次实验54h达到补糖上限，过程维持补糖上限，培养过程中偏离维持的溶氧和还原糖参数，开始减糖，其下限为3.5g/100ml。补氨水：发酵过程为产酸过程，补加氨水将pH控制要求范围4.7-4.9。葡糖淀粉酶发酵163h所得粗酶液的葡糖淀粉酶活力38946IU/ml。
对比例4
在实施例4的基础上，不进行补料。
葡糖淀粉酶发酵44h所得粗酶液的葡糖淀粉酶活力18714IU/ml。
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