热稳定性普鲁兰酶复配及其淀粉原料糖化工艺
阅读说明：本技术 热稳定性普鲁兰酶复配及其淀粉原料糖化工艺 (Heat-stable pullulanase compound and starch raw material saccharification process thereof ) 是由 聂尧 穆晓清 毕家华 于 2021-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了热稳定性普鲁兰酶复配及其淀粉原料糖化工艺,属于酶工程技术领域。本发明提供了一种复合糖化酶制剂,所述制剂含有热稳定性的中性普鲁兰酶和糖化酶。利用该复合糖化酶制剂,本发明进一步提供了一种淀粉料液的糖化方法：质量分数为35％的B淀粉溶液在pH为6.0、温度60℃的糖化条件下,复合酶制剂用量为40U/g的干基B淀粉,普鲁兰酶：糖化酶的复配比例为1：1,糖化时间为120min。DE值提高至91.66％。本发明中公开的复合糖化酶制剂及其淀粉原料糖化工艺将有望克服现有技术存在的工序繁琐、不经济、效率低等问题,促进糖化工艺的发展。(The invention discloses a heat-stable pullulanase compound and a starch raw material saccharification process thereof, belonging to the technical field of enzyme engineering. The invention provides a compound saccharifying enzyme preparation, which contains heat-stable neutral pullulanase and saccharifying enzyme. The invention further provides a saccharification method of starch liquid by using the compound saccharifying enzyme preparation, which comprises the following steps: under the saccharification condition that the pH value of a B starch solution with the mass fraction of 35% is 6.0 and the temperature is 60 ℃, the dosage of a complex enzyme preparation is 40U/g dry-base B starch, pullulanase: the compounding ratio of the saccharifying enzyme is 1:1, the saccharification time is 120 min. The DE value increased to 91.66%. The composite saccharifying enzyme preparation and the starch raw material saccharifying process thereof disclosed by the invention are expected to overcome the problems of complicated working procedures, low economy, low efficiency and the like in the prior art, and promote the development of the saccharifying process.)
技术领域
本发明涉及热稳定性普鲁兰酶复配及其淀粉原料糖化工艺，属于酶工程
技术领域
。背景技术
淀粉糖是以谷物、薯类等富含的淀粉为原料，在酶的催化下，经过液化、糖化等一系列反应，生产的大宗产品。在淀粉液化和糖化过程的中，常常产生一些副产物。其中，B淀粉作为谷朊粉生产中的副产物，因其含有戊聚糖、粗脂肪等而呈现出色泽比较暗，含杂质多，粘性大，难以分离等特点，如果直接作为饲料，其含有的非淀粉多糖不能被内源消化酶分解，不利于被单胃动物吸收，直接排放又会造成环境污染。关于B淀粉的综合利用已经有过一些报道，但到目前为止仍未有比较合理的方法。因此，随着谷朊粉生产的迅速增加，开发其下脚料B淀粉浆的有效利用已成为刻不容缓的问题。
淀粉糖制糖工艺一般均采用双酶法，即包括酶液化与糖化工艺。其中糖化工艺是指在淀粉浆在液化成糊精后，加入糖化酶、普鲁兰酶等，掌握添加酶量和酶浓度，控制反应温度、时间，最终生产葡萄糖糖浆的过程。在这个过程中，将单一酶制剂制成复合酶制剂可明显加快糖化速率，减少糖化副产物的产生，进而大幅度提高葡萄糖的产量和纯度。目前，国内销售的糖化复合酶主要是诺维信和杰能科两家公司所生产的，其所复配的酶均为酸性酶。该种复配酶制剂应用于糖化工艺时，由于其最适pH在4.5-5.5左右的偏酸范围，而液化反应后的原始pH在6.0-6.5的偏中性的范围，故在液化与糖化的过渡中需要先对液化液的pH调节至酸性范围后再加入普鲁兰酶进行糖化，这不可避免地增加了资源的消耗和水解时间。
CN202010180787公开了一种普鲁兰酶突变体G692M，其与已广泛应用于工业生产的酸性普鲁兰酶Prozozyme相比具有低成本，效率高，缩短淀粉水解时间等优点。然而，后期将其与糖化酶复配后糖化效果一般，最高仅为31.67％。因此，亟需一种经济、效率高的糖化方法，从而为B淀粉的综合利用提供参考。
发明内容
[技术问题]
现有技术中，普鲁兰酶突变体G692M与糖化酶复配后淀粉糖化效果仅为31.67％，亟需一种糖化方法提高B淀粉的糖化效率。
[技术方案]
本发明的目的是提供一种复合糖化酶制剂和生产淀粉糖的方法，从而克服现有技术存在工序繁琐、不经济等问题。
为了实现上述目的，本发明的第一个目的是提供一种复合糖化酶制剂，所述制剂含有普鲁兰酶和糖化酶，所述普鲁兰酶为来源于Bacillus thermoleovoran US105的突变酶G692M，所述糖化酶为来源于Aspergillus flavus HBF34的嗜热中性糖化酶。
在一种实施方式中，所述糖化酶制剂中的普鲁兰酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示基因，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述糖化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示基因，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在一种实施方式中，所述普鲁兰酶和糖化酶的添加比例为(1～8)：(1～9)。
在一种实施方式中，普鲁兰酶和糖化酶的添加比例为1：1。
本发明的第二目的是提供一种生产淀粉糖的方法，所述方法包括：
(1)使用B淀粉配制料液；
(2)利用上述复合糖化酶制剂对料液进行糖化。
本发明所述复合糖化酶制剂在糖化过程中可提高产物的DE值，同时大幅缩短糖化周期，提高效率。
在一种实施方式中，步骤(1)中，α-淀粉酶液化的时间为1.5～2.5h。
在一种实施方式中，步骤(1)中，B淀粉选自但不限于玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉中的至少一种所产生的副产物。
在一种实施方式中，步骤(1)中，配制料液的方法为将质量浓度为20％-50％的B淀粉溶液经α-淀粉酶液化得到。更优选地，所述料液通过质量浓度为30-40％的B淀粉溶液经α-淀粉酶液化得到。进一步优选地，所述料液通过质量浓度为35％的淀粉溶液经α-淀粉酶液化得到。
在一种实施方式中，步骤(2)中，所述复合糖化酶制剂的用量为20-50U/g B淀粉；优选为35-45U/g B淀粉；更优选为40U/g B淀粉。
在一种实施方式中，步骤(2)中，所述糖化在pH为5.5-6.5的条件下进行；优选地在pH为6.0的条件下进行。
在一种实施方式中，步骤(2)中，优选地，所述糖化的条件包括：温度为50-70℃，优选为约55-65，更优选为60℃；糖化时间为90-150min，优选为约120min。
本发明还提供了所述复合酶制剂在淀粉糖化中的应用。
本发明还提供了所述淀粉糖化的方法制备得到的淀粉糖在食品、药物制备和保健品领域中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的复合糖化酶制剂可以提高糖化效率。例如，35％的B淀粉溶液在pH为6.0、温度60℃的糖化条件下，经本发明提供的复合糖化酶制剂作用120min后，DE值提高至91.66％。
(2)本发明提供的复合糖化酶制剂可在无需调节料液的pH至酸性范围即可进行糖化，从而可大幅度缩短糖化周期、减少资源的消耗。
附图说明
图1糖化酶添加量对糖化DE值的影响；
图2普鲁兰酶添加量对糖化DE值的影响；
图3糖化温度对糖化DE值的影响；
图4糖化pH对糖化DE值的影响；
图5糖化时间对糖化DE值的影响；
图6B淀粉浓度对糖化DE值的影响。
具体实施方式
下述实施例中涉及到的酶
α-淀粉酶：购买于利可来的耐高温α-淀粉酶Supra。
糖化酶：来源于Aspergillus flavus HBF34的嗜热中性糖化酶。
普鲁兰酶：来源于Bacillus thermoleovoran US105的突变酶G692M。
DE值的测定方法：采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法(Jiahua Bi,Shuhui Chen,Xianghan Zhao,Nie Yao*,Yan Xu.Computation-aided engineering of starch-debranching pullulanase from Bacillus thermoleovorans for enhancedthermostability.Applied Microbiology and Biotechnology,2020,104,7551-7562)测定糖化的DE值。于实验组，将200μL的2％(w/v)普鲁兰多糖溶液与200μL酶液混合后在70℃下反应20min，并立即于冰水浴中静置5min以终止反应。对照组在70℃下温浴20min后再补加200μL 2％(w/v)普鲁兰多糖溶液。冷却后，向实验组和对照组中均加入600μL的DNS试剂，并于沸水浴中煮沸5min。冰水浴冷却后于540nm处测量相应吸光值，并利用标准曲线求得还原糖浓度。
DE(％)＝(C×V)/1000w×100％
式中：C为利用标准曲线求得的还原糖浓度，(mg/mL)；V为稀释后体积，mL；w为B淀粉含量，g。
实施例1：糖化酶添加量对糖化DE值的影响
(1)配制料液：首先将一定量的B淀粉于烘箱中40℃干燥30min，再在105℃干燥至恒重。利用0.2mol/L、pH 6.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液配制质量分数为30％的B淀粉反应体系，搅拌均匀后经α-淀粉酶液化2h。
(2)糖化料液：将步骤(1)中液化后的料液温度降到65℃，分成7组，每组分别加入30U/g干基B淀粉的普鲁兰酶，再分别加入20、25、30、35、40、45、50U/g干基B淀粉的糖化酶。准确计时反应60min取样并灭酶，稀释一定的倍数后采用DNS法测定DE值。
结果如图1所示：当糖化酶的添加量为20～40U/g B淀粉(以干基计)时，随着糖化酶酶量的增加，底物的降解速率加快，DE值逐渐递增；当糖化酶的添加量达到40U/g后，DE值稳定在55％左右，这是因为底物已被所添加的糖化酶饱和。此后，即使继续增加糖化酶的添加量，反应速率也不会增大，DE值也不会增加。
实施例2：普鲁兰酶添加量对糖化DE值的影响
(1)配制料液：同实施例1。
(2)糖化料液：将步骤(1)中液化后的料液温度降到65℃，分成7组，每组分别加入40U/g干基B淀粉的糖化酶，而普鲁兰酶添加量分别为20、25、30、35、40、45、50U/g干基B淀粉，也就是体系中糖化酶和普鲁兰酶的添加比例分别为2:1、8:5、4:3、8:7、1:1、8:9、4:5。准确计时反应60min取样并灭酶，稀释一定的倍数后采用DNS法测定DE值。
结果如图2所示：当普鲁兰酶的添加量为20～40U/g B淀粉(以干基计)时，随着普鲁兰酶酶量的增加，底物的降解速率加快，DE值逐渐递增至76％；当普鲁兰酶添加量达到40U/g后，DE值保持在一个稳定的水平，这是因为底物已被所添加的普鲁兰酶饱和。此后，即使继续增加该酶的添加量，反应速率也不会增大，DE值也不会增加。
实施例3：糖化温度对糖化DE值的影响
(1)配制料液：同实施例1。
(2)糖化料液：将步骤(1)中液化后的料液温度分别降为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，分别加入40U/g干基B淀粉的复合酶，复合酶中糖化酶与普鲁兰酶的比例为1：1。准确计时反应60min取样并灭酶，稀释一定的倍数后采用DNS法测定DE值。
结果如图3所示，当糖化温度在50℃～60℃时，随着糖化温度的增加，DE值逐渐增大；当糖化温度达到60℃时，DE达到最大值为76.24％；之后，随着温度的不断增加，DE值下降速度加快。升温促使糖化液DE值上升的原因可能是伴随着糖化温度的不断升高，酶分子在单位时间内对底物作用的有效碰撞次数随之增多，而且酶活性也在不断升高；当糖化温度超过60℃时，随着糖化的进行，过高的温度可能使酶的活性中心发生改变，从而使酶活性降低，DE值急剧下降。因此，60℃为最佳的糖化温度。
实施例4：糖化pH值对糖化DE值的影响
(1)配制料液：同实施例1。
(2)糖化料液：将步骤(1)中液化后的料液温度降为60℃，并分别调节pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，加入40U/g干基B淀粉的复合酶，复合酶中糖化酶与普鲁兰酶的比例为1：1。准确计时反应60min取样并灭酶，稀释一定的倍数后采用DNS法测定DE值。
结果如图4所示，在其它糖化条件相同的情况下，pH值在5.5-6.5的偏中性范围内时，糖化DE值处于较高水平，并且在pH值为6.0时达到最大值为76.89％。酶的活性与pH值有着十分紧密的联系，低于或高于最适pH值，糖化DE值都会急剧下降，这可能是由于pH值能使酶分子的空间构象发生改变。酶蛋白只有在合适的酸碱度下，才能最大限度地发挥其活性。因此，选择pH值6.0作为复合酶制剂水解B淀粉较适宜的酸碱度。液化反应的pH在6.0-6.5之间，故该复配酶制剂可在不调节液化反应液的pH的情况下发挥良好的糖化效果。
实施例5：糖化时间对复合酶糖化的影响
(1)配制料液：同实施例1。
(2)糖化料液：将步骤(1)中将液化后的料液温度降为60℃，加入40U/g干基B淀粉的复合酶，复合酶中糖化酶与普鲁兰酶的比例为1：1。分别准确计时反应30、60、90、120、150、180min取样并灭酶，稀释一定的倍数后采用DNS法测定DE值。
结果如图5所示，在一定条件下，当糖化时间在30min～120min时，DE值随着反应时间的延长逐渐上升，在120min时，糖化液DE值达到了85.89％；之后，料液被分解的速度减慢，DE值稳定在85％的糖化水平。
实施例6：B淀粉浓度对糖化DE值的影响
(1)配制料液：利用0.2mol/L、pH 6.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液分别配制不同质量分数(20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％)的B淀粉反应体系，搅拌均匀后经α-淀粉酶液化至一定的DE值。
(2)糖化料液：将步骤(1)中液化后的料液温度降到60℃，加入30U/g干基B淀粉的复合酶，复合酶中糖化酶与普鲁兰酶的比例为1：1。准确计时反应60min取样并灭酶，稀释一定的倍数后采用DNS法测定DE值。
结果如图6所示：当B淀粉质量分数为20％～35％时，随着B淀粉含量的增加，加快了底物的降解，DE值递增；35％后，DE值保持在一个稳定的水平，约为91％，这是因为此时酶已被底物饱和，即使增加底物的量，反应速率也不会增大，DE值也不会增加。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 宿迁市江南大学产业技术研究院
<120> 热稳定性普鲁兰酶复配及其淀粉原料糖化工艺
<130> BAA210778A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctgcata ttagtcgcac ctttgccgcc tatttagacg aaatggatca aatcgtggtt 60
ctggccccga agagtctggg ctttgacggc atggccccgt ttacactggt ggcaccgagc 120
ggtgaagaga ttccgctgag cgttcagcac gtggaggatg tgggcgagac agtgaaatat 180
gtgtgccgtt ttgccagcgc cttcgaattc ggtgccacct attgggtgcg tagttgccgc 240
ggcgaagaaa ccgatgttca aatcggcgcc gtggttcgca ccccggcctt tgatgaccgc 300
ttcttttatg acggcccgct gggcgccgaa tatctgaagg agcagacagt ttttcgtgtt 360
tgggcaccga ccgccaccgc agttagcgtg aaactggtgc atccgcactt agacgagatc 420
cgctgtgtgc ctttagtgcg tggtgaacgt ggcgtttgga gtgccgttgt gccgggcgac 480
tgggaacgtg cacgttacac atacatcgct tgtatcaacc gtgtgtggcg tgaagcagtt 540
gatccgtatg ccacagccgt tagcgtgaat ggcgagtttg gcgttgtgat cgattgggag 600
aagaccaagc tggcacctcc gagtctgccg ctgccgccgt tatgtagccc taccgatgca 660
atcatctacg agctgagcat ccgcgatttc accagccatc cggatagcgg tgccgtgcac 720
aagggtaaat atttaggtct ggccgaaacc aacaccagtg gcccgaatgg tacagccacc 780
ggtttaagtt atgtgaagga actgggtgtg acccacgttc agttaatgcc gttcatggac 840
tttgctggtg tggatgagcg cgaccctcaa gctgcataca actggggcta caatccgctg 900
catttatatg ccccggaagg cagctacgcc accgatcccg ctgacccgta cgcacgtatt 960
gtggagctga aacaagctat ccatacttta cacgagaacg gtttacgcgt ggtgatggac 1020
gccgtgtaca accatgtgta cgatcgtgaa caaagcccgc tggagaagct ggttccgggt 1080
tactatttcc gttacgacgc ctacggtcag cccgctaacg gtaccggcgt gggcaatgac 1140
attgccagcg aacgtcgcat ggcccgccgc tggattgtgg atagcgtggt gttctgggcc 1200
aaggagtatg gtattgacgg ctttcgcttc gatttaatgg gtgtgcatga tatcgagacc 1260
atgaaggccg ttcgcgatgc tttagatgcc attgacccga gcattttagt gtatggtgaa 1320
ggctgggatt taccgacccc tctgccgccg gaacagaaag ccactatggc taatgccaag 1380
cagctgccgc gcttcgccta ctttaatgac cgttttcgcg atgccgtgaa aggcagtacc 1440
ttccatttac ccgatcgtgg ctttgcctta ggtaacccgg gcggccgcga acaagttaaa 1500
ctggccattg ctggttcttt acgtgcctta ggcggtctgt tttgccaccc gcgtcagagc 1560
attaactatg tggaatgcca cgataaccac acattctggg acaagatgga agccgccaac 1620
cacgatgaac cggaatggct gcgtcgtaaa cgccagaaac tggccaccgc aatcgtgctg 1680
ctggcccaag gtattccgtt tctgcacagc ggccaagaat tttatcgcac caaaggtggc 1740
gacggtaaca gctatcgcag ccccgatgcc gtgaatcaac tggattggga gcgcaagagt 1800
cgttacgagg acgatgttcg ctacgtgcaa ggtctgattg cattacgtcg cgcacatggt 1860
gcctttcgtc tggcaaccga agccgaagtg ctgcgtcatt tcacattttt agaaccgctg 1920
ccccctagcg ttattgcata tcgtttacat gacgcagccg tgtatggccc gtgggaagac 1980
atcatcgtgg tgcaccataa cgaggagaag gaaaccgcca tcgcattacc ggatgagcgt 2040
gaatgggccg tggtttgtga cggtcagcgc tgcatgacaa caccgtttgg ccaagctcgc 2100
ggtatgctgc gtctggatgg tattggcact tgggttctgg tgcacccggc cggc 2154
<210> 2
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Leu His Ile Ser Arg Thr Phe Ala Ala Tyr Leu Asp Glu Met Asp
1 5 10 15
Gln Ile Val Val Leu Ala Pro Lys Ser Leu Gly Phe Asp Gly Met Ala
20 25 30
Pro Phe Thr Leu Val Ala Pro Ser Gly Glu Glu Ile Pro Leu Ser Val
35 40 45
Gln His Val Glu Asp Val Gly Glu Thr Val Lys Tyr Val Cys Arg Phe
50 55 60
Ala Ser Ala Phe Glu Phe Gly Ala Thr Tyr Trp Val Arg Ser Cys Arg
65 70 75 80
Gly Glu Glu Thr Asp Val Gln Ile Gly Ala Val Val Arg Thr Pro Ala
85 90 95
Phe Asp Asp Arg Phe Phe Tyr Asp Gly Pro Leu Gly Ala Glu Tyr Leu
100 105 110
Lys Glu Gln Thr Val Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val
115 120 125
Ser Val Lys Leu Val His Pro His Leu Asp Glu Ile Arg Cys Val Pro
130 135 140
Leu Val Arg Gly Glu Arg Gly Val Trp Ser Ala Val Val Pro Gly Asp
145 150 155 160
Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Thr Tyr Ile Ala Cys Ile Asn Arg Val Trp
165 170 175
Arg Glu Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Ser Val Asn Gly Glu
180 185 190
Phe Gly Val Val Ile Asp Trp Glu Lys Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ser
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Pro Leu Cys Ser Pro Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Glu
210 215 220
Leu Ser Ile Arg Asp Phe Thr Ser His Pro Asp Ser Gly Ala Val His
225 230 235 240
Lys Gly Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Glu Thr Asn Thr Ser Gly Pro Asn
245 250 255
Gly Thr Ala Thr Gly Leu Ser Tyr Val Lys Glu Leu Gly Val Thr His
260 265 270
Val Gln Leu Met Pro Phe Met Asp Phe Ala Gly Val Asp Glu Arg Asp
275 280 285
Pro Gln Ala Ala Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Leu His Leu Tyr Ala
290 295 300
Pro Glu Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Ala Asp Pro Tyr Ala Arg Ile
305 310 315 320
Val Glu Leu Lys Gln Ala Ile His Thr Leu His Glu Asn Gly Leu Arg
325 330 335
Val Val Met Asp Ala Val Tyr Asn His Val Tyr Asp Arg Glu Gln Ser
340 345 350
Pro Leu Glu Lys Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Phe Arg Tyr Asp Ala Tyr
355 360 365
Gly Gln Pro Ala Asn Gly Thr Gly Val Gly Asn Asp Ile Ala Ser Glu
370 375 380
Arg Arg Met Ala Arg Arg Trp Ile Val Asp Ser Val Val Phe Trp Ala
385 390 395 400
Lys Glu Tyr Gly Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Val His
405 410 415
Asp Ile Glu Thr Met Lys Ala Val Arg Asp Ala Leu Asp Ala Ile Asp
420 425 430
Pro Ser Ile Leu Val Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Leu Pro Thr Pro Leu
435 440 445
Pro Pro Glu Gln Lys Ala Thr Met Ala Asn Ala Lys Gln Leu Pro Arg
450 455 460
Phe Ala Tyr Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr
465 470 475 480
Phe His Leu Pro Asp Arg Gly Phe Ala Leu Gly Asn Pro Gly Gly Arg
485 490 495
Glu Gln Val Lys Leu Ala Ile Ala Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gly Gly
500 505 510
Leu Phe Cys His Pro Arg Gln Ser Ile Asn Tyr Val Glu Cys His Asp
515 520 525
Asn His Thr Phe Trp Asp Lys Met Glu Ala Ala Asn His Asp Glu Pro
530 535 540
Glu Trp Leu Arg Arg Lys Arg Gln Lys Leu Ala Thr Ala Ile Val Leu
545 550 555 560
Leu Ala Gln Gly Ile Pro Phe Leu His Ser Gly Gln Glu Phe Tyr Arg
565 570 575
Thr Lys Gly Gly Asp Gly Asn Ser Tyr Arg Ser Pro Asp Ala Val Asn
580 585 590
Gln Leu Asp Trp Glu Arg Lys Ser Arg Tyr Glu Asp Asp Val Arg Tyr
595 600 605
Val Gln Gly Leu Ile Ala Leu Arg Arg Ala His Gly Ala Phe Arg Leu
610 615 620
Ala Thr Glu Ala Glu Val Leu Arg His Phe Thr Phe Leu Glu Pro Leu
625 630 635 640
Pro Pro Ser Val Ile Ala Tyr Arg Leu His Asp Ala Ala Val Tyr Gly
645 650 655
Pro Trp Glu Asp Ile Ile Val Val His His Asn Glu Glu Lys Glu Thr
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Ala Ile Ala Leu Pro Asp Glu Arg Glu Trp Ala Val Val Cys Asp Gly
675 680 685
Gln Arg Cys Met Thr Thr Pro Phe Gly Gln Ala Arg Gly Met Leu Arg
690 695 700
Leu Asp Gly Ile Gly Thr Trp Val Leu Val His Pro Ala Gly
705 710 715
<210> 3
<211> 1839
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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gcgtttaccg gcgcgtgggg ccgtccgcag cgtgatggcc cggcgctgcg tgcgaccgcg 480
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gcgctggtgg aaggctcctc ctttgcgaaa accgtgggct cctcctgccc gtattgcgat 720
tcccaggcgc cgcaggtgcg ttgctatctg cagtcctttt ggaccggctc ctatattcag 780
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acctttgatc cgcaggcgac ctgcgatgat gcgacctttc agccgtgctc cgcgcgtgcg 900
ctggcgaatc ataaagtggt gaccgattcc tttcgttcca tttatgcgat taattccggc 960
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tccgcggtga aagcgtatgc ggatggctat gtgcagattg tgcagaccta tgcggcgtcc 1260
accggctcca tggcggaaca gtataccaaa accgatggct cccagacctc cgcgcgtgat 1320
ctgacctggt cctatgcggc gctgctgacc gcgaataatc gtcgtgatgc ggtggtgccg 1380
gcgccgtggg gcgaaaccgc ggcgacctcc attccgtccg cgtgctccac cacctccgcg 1440
tccggcacct attcctccgt ggtgattacc tcctggccga ccatttccgg ctatccgggc 1500
gcgccggatt ccccgtgcca ggtgccgacc accgtgtccg tgacctttgc ggtgaaagcg 1560
accaccgtgt atggcgaatc cattaaaatt gtgggctccg tgtcccagct gggctcctgg 1620
aatccgtcct ccgcgaccgc gctgaatgcg gattcctata ccaccgataa tccgctgtgg 1680
accggcacca ttaatctgcc ggcgggccag tcctttgaat ataaatttat tcgtgtgcag 1740
aatggcgcgg tgacctggga atccgatccg aatcgtaaat ataccgtgcc gtccacctgc 1800
ggcgtgaaat ccgcggtgca gtccgatgtg tggcgttaa 1839
<210> 4
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Val Ser Phe Ser Ser Cys Leu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Ser Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Val Gln Pro Val Leu Arg Gln Ala Thr Gly Leu Asp Thr
20 25 30
Trp Leu Ser Thr Glu Ala Asn Phe Ser Arg Gln Ala Ile Leu Asn Asn
35 40 45
Ile Gly Ala Asp Gly Gln Ser Ala Gln Gly Ala Ser Pro Gly Val Val
50 55 60
Ile Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr
65 70 75 80
Arg Asp Ser Gly Leu Val Met Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Ala Asp Leu Leu Pro Ile Ile Glu Glu Phe Ile Ser Ser Gln
100 105 110
Ala Arg Ile Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly
130 135 140
Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala
145 150 155 160
Met Ile Ser Phe Gly Glu Trp Leu Val Glu Asn Gly His Thr Ser Ile
165 170 175
Val Thr Asp Leu Val Trp Pro Val Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val
180 185 190
Ala Gln Tyr Trp Ser Gln Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Gln
195 200 205
Gly Thr Ser Phe Phe Thr Val Ala Val Ser His Arg Ala Leu Val Glu
210 215 220
Gly Ser Ser Phe Ala Lys Thr Val Gly Ser Ser Cys Pro Tyr Cys Asp
225 230 235 240
Ser Gln Ala Pro Gln Val Arg Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly
245 250 255
Ser Tyr Ile Gln Ala Asn Phe Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ile
260 265 270
Asn Thr Val Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Gln Ala Thr Cys
275 280 285
Asp Asp Ala Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His
290 295 300
Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly
305 310 315 320
Arg Ala Glu Asn Gln Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser
325 330 335
Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Thr Thr Leu Ala Ala Ala Glu
340 345 350
Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Ile Gly Ser Leu Ala
355 360 365
Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Ser Ala
370 375 380
Ala Thr Gly Thr Tyr Ala Ser Ser Thr Thr Val Tyr Lys Asp Ile Val
385 390 395 400
Ser Ala Val Lys Ala Tyr Ala Asp Gly Tyr Val Gln Ile Val Gln Thr
405 410 415
Tyr Ala Ala Ser Thr Gly Ser Met Ala Glu Gln Tyr Thr Lys Thr Asp
420 425 430
Gly Ser Gln Thr Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu
435 440 445
Leu Thr Ala Asn Asn Arg Arg Asp Ala Val Val Pro Ala Pro Trp Gly
450 455 460
Glu Thr Ala Ala Thr Ser Ile Pro Ser Ala Cys Ser Thr Thr Ser Ala
465 470 475 480
Ser Gly Thr Tyr Ser Ser Val Val Ile Thr Ser Trp Pro Thr Ile Ser
485 490 495
Gly Tyr Pro Gly Ala Pro Asp Ser Pro Cys Gln Val Pro Thr Thr Val
500 505 510
Ser Val Thr Phe Ala Val Lys Ala Thr Thr Val Tyr Gly Glu Ser Ile
515 520 525
Lys Ile Val Gly Ser Val Ser Gln Leu Gly Ser Trp Asn Pro Ser Ser
530 535 540
Ala Thr Ala Leu Asn Ala Asp Ser Tyr Thr Thr Asp Asn Pro Leu Trp
545 550 555 560
Thr Gly Thr Ile Asn Leu Pro Ala Gly Gln Ser Phe Glu Tyr Lys Phe
565 570 575
Ile Arg Val Gln Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg
580 585 590
Lys Tyr Thr Val Pro Ser Thr Cys Gly Val Lys Ser Ala Val Gln Ser
595 600 605
Asp Val Trp Arg
610