一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶t及应用

文档序号：1638960 发布日期：2020-01-17 浏览：38次 >En<

阅读说明：本技术 一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶t及应用 (Recombinant aminopeptidase T derived from Listeria monocytogenes and application thereof ) 是由程昌勇宋厚辉孙静于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物工程技术领域,旨在提供一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶T及应用。该氨基肽酶T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于编码前述氨基肽酶T的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明获得的重组氨基肽酶T(Lmo1603编码的蛋白)具有氨基肽酶活性,并且对部分金属离子具有较强依赖性。基于此特性,本发明获得的重组氨基肽酶T能够用于蛋白质的深度水解。(The invention relates to the technical field of bioengineering, and aims to provide a recombinant aminopeptidase T derived from Listeria monocytogenes and application thereof. The amino acid sequence of the aminopeptidase T is shown as SEQ ID NO. 1. The nucleotide sequence of the gene for encoding the aforementioned aminopeptidase T is shown in SEQ ID NO. 2. The recombinant aminopeptidase T (protein encoded by Lmo 1603) obtained by the invention has aminopeptidase activity and has strong dependence on partial metal ions. Based on this property, the recombinant aminopeptidase T obtained by the present invention can be used for deep hydrolysis of proteins.)

一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶T及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶T及应用。

背景技术

氨基肽酶(Aminopeptidases，APs)是广泛存在于动物、植物和微生物中的一种金属蛋白水解酶。氨基肽酶识别多肽N端氨基酸残基，并水解产生游离氨基酸。比如最常见的亮氨酸氨基肽酶，可以水解多肽N端亮氨酸残基，生成游离亮氨酸和多肽。在真核细胞当中氨基肽酶有多种功能。如蛋白的加工、成熟、转化，调控多肽类的水解、基因表达等。氨基肽酶除以上功能外，还存在于转运机制中。例如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)中的ABC多肽转运系统(PepTs)，转运蛋白Dpp和Opp可介导转运多肽；同时有氨基肽酶PepA参与效应蛋白的转运，可特异性水解效应蛋白，这对于细菌在宿主细胞内存活和感染至关重要；幽门螺旋杆菌能够在胃液中生存并且致病主要是由于存在抗酸能力，在宿主细胞内主要的能量来源是丙氨酸(L-alanine)、丝氨酸(L-serine)和其它相关的6种D-氨基酸。与此类似的胞内寄生菌，单增李斯特菌同样需要效应因子，有助于黏附侵蚀和胞内增殖，并需要氨基肽酶协助效应因子的加工及成熟，同时需要氨基肽酶作用便于提供细菌胞内存活的营养来源等，但是这一机制目前尚未证实。

在单增李斯特菌EGD-e基因组中注释氨基肽酶的基因有：lmo1780(pepTM20.003)、lmo2338(pepC C01.086)、lmo1709(map M24A)、lmo1578(M24.008)、lmo1354(M24B)、lmo1711(M29.004)和lmo1603(未知)(http://www.uniprot.org/)。虽然注释为氨基肽酶活性，但是具体功能如何，尚未有研究证实。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶T及应用。

与现有技术相比，本发明的解决方案是：

提供一种来源于单增李斯特菌的氨基肽酶T，该氨基肽酶T的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了用于编码前述氨基肽酶T的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述氨基肽酶T的基因通过下述方法制备获得：

根据Genbank中收录的单增李斯特菌(Listeria.monocytogenes)EGD-e NC_003210的lmo1603基因序列设计合成上游引物和下游引物(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)，然后以单增李斯特菌(Listeria.monocytogenes)EGD-e NC_003210的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得目的基因。

扩增过程中所用引物如下：

上游引物：GCGCATATGAGAGATGCAAGAATCGAAAAATTAGCA

下游引物：CCGCTCGAGTACTAAGTTTTCTGGATTAAGTGCTTCTAATTCT

其中，上游引物(SEQ ID NO.3)的下划线部分为Nde I酶切位点，下游引物(SEQ IDNO.4)的下划线部分为Xho I酶切位点。

氨基肽酶T基因的碱基序列如序列SEQ ID NO.2所示，命名为Lmo1603，全长1113bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1113个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ.1所示。

本发明另涉及包含本发明的氨基肽酶T基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的氨基肽酶T基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET30a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的氨基肽酶T基因产物与与表达载体pET30a用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的氨基肽酶T基因的重组表达质粒pSL327。

本发明进一步涉及包含本发明的氨基肽酶T基因或其重组表达载体的重组表达转化体。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的氨基肽酶T基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌E.coli.DH5α和大肠埃希氏E.coli.Rosetta(DE3)。将前述重组表达质粒pSL327转化至大肠埃希氏菌E.coli.Rosetta(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌E.coli.Rosetta(DE3)-pSL327。

本发明还进一步涉及重组氨基肽酶T的制备方法，包括：培养本发明的重组表达转化体，获得重组氨基肽酶T。

其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可本领域任何可使转化体生长并产生本发明的氨基肽酶T的培养基，对于菌株，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生氨基肽酶T即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于菌株，优选下述方法：将表达本发明的氨基肽酶T基因的重组大肠杆菌(优选本发明的大肠埃希氏菌E.coli.Rosetta(DE3)重组表达转化体)接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5-0.8时，在终浓度为0.6mM的IPTG的诱导下，即可高效表达本发明的重组氨基肽酶T。

本发明进一步提供了前述重组氨基肽酶T作为蛋白质水解酶的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明获得的重组氨基肽酶T(Lmo1603编码的蛋白)具有氨基肽酶活性，并且对部分金属离子具有较强依赖性。基于此特性，本发明获得的重组氨基肽酶T能够用于蛋白质的深度水解。

附图说明

图1为lmo1603基因片段电泳图；

图2为克隆质粒pSL327结构示意图；

图3为制备重组表达载体过程中进行PCR筛选阳性克隆；

图4为纯化后氨基肽酶T的电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下列实施例中的材料来源为：

pET30a表达质粒，E.coli.DH5α和E.coli.Rosetta(DE3)感受态细胞购自上海钰博生物科技有限公司。KOD plus Neo(PCR试剂盒)购自上海东洋纺；PCR产物纯化/回收试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公司；限制性核酸内切酶购自NEB公司；T4核酸连接酶购自Takara公司；质粒小提试剂盒购自上海生工生物科技有限公司；蛋白层析结合柱(镍柱)购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司。

实施例1 Lmo1603基因的克隆

根据Genbank中收录的单增李斯特菌(Listeria.monocytogenes)EGD-e NC_003210的lmo1603基因序列为依据，设计PCR引物如下：

引物(用于扩增lmo1603基因)：

上游引物：GCGCATATGAGAGATGCAAGAATCGAAAAATTAGCA

下游引物：CCGCTCGAGTACTAAGTTTTCTGGATTAAGTGCTTCTAATTCT

其中，上游引物(SEQ ID NO.3)的下划线部分为Nde I酶切位点，下游引物(SEQ IDNO.4)的下划线部分为Xho I酶切位点。

单增李斯特菌(Listeria.monocytogenes)EGD-e NC_003210的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：KOD plus buffer 10μl，上游引物和下游引物各2μl(10mM)，DNA模板2μl和ddH₂O 66μl，MgSO₄ 6μl，dNTP 10μl，KOD-plus-Neo 2μl。PCR扩增步骤为：(1)94℃，预变性2min；(2)98℃，变性10s；(3)56℃退火30s；(4)68℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)68℃继续延伸7min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得1125bp的lmo1603基因片段(如图1)。

实施例2重组表达载体(质粒)和重组表达转化体的制备

本实施例主要是利用VectorNTI软件将实施例1所得的氨基肽酶基因与pET30a载体连接，构建克隆质粒pSL327(如图2)。

将实施例1所得的氨基肽酶基因在37℃用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经Nde I Xho I酶切后的质粒pET30a，在16℃下连接4-5h。之后转化至大肠埃希氏菌E.coli.DH5α感受态细胞，通过菌液PCR筛选阳性克隆(如图3)，提取质粒。

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli.Rosetta感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌E.coli.Rosetta-pSL327。

实施例3重组氨基肽酶的表达及体外纯化

将实施例2所得的重组大肠杆菌，挑取单克隆菌落于5mL含有100μg/mL Kana抗性LB液体，37℃震荡过夜培养，取新鲜菌液以1:100转接至无菌500mL LB液体培养基。37℃震荡培养至OD600nm＝0.6-0.8，加入IPTG(终浓度为0.6mM)，37℃继续培养4-5h以诱导大量表达Lmo1603，收集菌体(4℃、3700rpm/min离心15min)。加入10mM PBS(pH＝7.4)重悬菌体洗涤一次，加入20mL 100mM PBS(pH＝7.4)，超声破碎25min(超声8s，间隔10s)，收集蛋白液，在4℃、12000rpm/min离心25min，分别取上清和沉淀各50μL进行SDS-PAGE分析，用考马斯亮蓝进行染色。

Lmo1603蛋白纯化。镍柱的处理：取2mL镍柱加入收集管，待乙醇完全流出，用20mLddH20洗涤镍柱，再用10mL 100mM的PBS(pH＝7.4)平衡柱子。加入40mL 100mM PBS(pH＝7.4)重悬Rosetta菌体，超声破碎25min(超声8s，间隔10s)，收集蛋白液，在4℃、12000rpm/min离心25min，上清移至新的离心管。将上清与平衡过的镍柱在4℃翻转结合3-4h，结合结束后结合液移至收集柱子，待结合液流出，加入30mL50mM咪唑洗除杂蛋白，保持流速0.5-1mL/min；缓慢持续性加入5mL 400mM咪唑洗脱目的蛋白，保持流速0.5-1mL/min。用酶标仪测定蛋白浓度，纯化得到的蛋白加等加入体积100％甘油，保存于-20℃备用，纯化得到的目的蛋白(氨基肽酶T)进行SDS-PAGE电泳分析其纯度并验证蛋白大小(如图4)。

实施例4重组氨基肽酶T酶活力的测定

上述纯化得到的Lmo1603进行氨基肽酶活性试验，本试验所选用的氨基肽酶底物有Leu-pNA、Ala-pNA和Arg-pNA，终浓度均为2mM，蛋白浓度为5μM，所用buffer为25mM Tris-HCl。底物被氨基肽酶水解后产生游离氨基酸和对硝基苯胺，通过对反应体系中对硝基苯胺浓度的检测来反应Lmo1603有无氨基肽酶活性以及活性能力的强弱。对硝基苯胺的吸收峰波长为405nm。

实施例5Lmo1603属于金属离子依赖性氨基肽酶

本发明所得重组氨基肽酶T的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。

试验一，所选用的氨基肽酶底物有Leu-pNA、Ala-pNA和Arg-pNA，终浓度均为2mM，蛋白浓度为5μM，所用buffer为25mM Tris-HCl。底物被氨基肽酶水解后产生游离氨基酸和对硝基苯胺，通过对反应体系中对硝基苯胺浓度的检测来反应Lmo1603有无氨基肽酶活性以及活性能力的强弱；

试验二，为证实Lmo1603酶活性对金属离子的依赖性，本试验选取了6个酶活性辅助常见的金属离子，分别是：Co²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Ni²⁺，在酶活性反应体系中加入金属离子，检测其对酶活性的影响，工作浓度为1mM，预先配置于反应buffer(25mM Tris-HCl)。以上两个试验程序为：将各反应成份加入96孔反应板，震荡混匀后，立即放入酶标仪进行检测(提前设置反应程序和温度)，其反应产物对硝基苯胺的吸收峰波长为405nm。每隔30min检测405nm吸收值，连续读数12h。

为证实Lmo1603酶活性对金属离子的依赖性，本试验选取了6个酶活性辅助常见的金属离子，分别是：Co²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Ni²⁺.，在酶活性反应体系中加入金属离子，检测其对酶活性的影响，工作浓度为1mM，预先配置于反应buffer(25mM Tris-HCl)。

试验结果显示，Lmo1603存在氨基肽酶活性且持续时间长，对不同底物的水解能力各有差异。在底物Leu-pNA、Ala-pNA和Arg-pNA中，Lmo1603对Arg-pNA的水解能力最强，说明Lmo1603不仅有氨基肽酶活性功能，而且对底物有一定的选择性；Lmo1603属于金属离子依赖性氨基肽酶，并且对不同金属离子的依赖性存在差异。试验选取的六种离子中Co²⁺和Lmo1603酶活性中心亲和度最高(高达20倍)，说明Co²⁺离子与Lmo1603活性位点耦合后极大程度地提高Lmo1603氨基肽酶的水解能力。

基于上述特性，本发明获得的重组氨基肽酶T能够用于蛋白质的深度水解，实现体外多肽的快速切割，生成游离型氨基酸。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶T及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagagatg caagaatcga aaaattagca cataatttga ttaactattc cgtcaaactt 60

ggcgctgggg aaaaagtatt aattgaaaac ttcggtgttc aaaaagaatt agtgatggct 120

ttagtggaag aagcttacaa agctggtggt ttcccgttcg tttccttaaa agaaccacaa 180

attgaccgcg cgatgatgct cggagctgat agttctcaat atgcaaaaat tgctgaattc 240

gaaggcaacg taatgaaaga aatggatgct tacataggtt tacgtgctgg cgataatatc 300

aatgaaacat ctgatgttcc agcagataaa ttgaaaatcc acggagaaac agttggcaaa 360

atgcactctg atattcgtgt aaaacaaacg aaatgggttg tacttcgcta tccaagttcc 420

tccatggcgc aacttgccaa aatgagcact gctggttttg aagatttcta ctttgacgta 480

tgtaacttag attacggtaa aatgagtgac gcaatggacg gcttggtaga actaatgaat 540

aaaacagata aagtacactt agttgggcca ggaactgatt taacctttag tattaaagat 600

attccagcaa ttaaatgtgc tggcgaaatg aatattccag acggtgaagt atttactgcg 660

ccagttcgtg attctatcaa cggaacactt acttacaaca caccttcccc ttatcaaggc 720

tttacgtttg aaaatgtatc tttcacattt aaggatggaa aaattatcga agcaactgcg 780

aatgatacag ctcgtattaa caaagtctta gacacagatg aaggcgcgcg cttcgttggt 840

gaattcgcta ttggggttaa cccgttcatc cacgaaccaa tgcaggatat tctgtttgac 900

gaaaaaattg aaggtagttt ccactttacg cctggtcaat gttatgacga agcatttaat 960

ggcaaccaat ctgctattca ctgggattta gttaacattc aacgtgccga ttacggcggt 1020

ggcgaaattt actttgatga tgttctcatt cgtaaagatg gtattttcgt tcttccagaa 1080

ttagaagcac ttaatccaga aaacttagta 1110

<210> 2

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2