阅读说明：本技术 一种微生物源氨基肽酶及其制备与应用 (Microbial aminopeptidase and preparation and application thereof ) 是由 程昌勇 宋厚辉 孙静 杭奕 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因工程和生物酶技术,旨在提供一种微生物源氨基肽酶及其制备与应用。该氨基肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,在食品工业和生物制药行业作为蛋白质或多肽的水解酶应用。本发明采用基因工程表达进行实现,克服了天然菌中氨基肽酶含量少的缺点,可以批量发酵；可溶性表达形式避免了其他微生物源蛋白酶为包涵体的缺点。该蛋白酶广泛存在于不同物种的生物体中；具有食品风味改善,生物活性肽制备和神经性化学毒剂特异性清除等功能。其物理特征特征为可溶性形式,且保留天然活性,因而具备广泛应用场景。(The invention relates to genetic engineering and biological enzyme technology, and aims to provide a microbial aminopeptidase and preparation and application thereof. The amino acid sequence of the aminopeptidase is shown as SEQ ID NO.1, and the aminopeptidase can be used as a hydrolase of protein or polypeptide in the food industry and the biopharmaceutical industry. The invention is realized by adopting gene engineering expression, overcomes the defect of low aminopeptidase content in natural bacteria, and can be fermented in batch; the soluble expression form avoids the disadvantage that other proteases of microbial origin are inclusion bodies. The protease is widely present in organisms of different species; has the functions of improving the flavor of food, preparing bioactive peptide, specifically eliminating nerve chemical toxic agent, etc. The physical characteristics of the protein are soluble forms, and the natural activity is retained, so that the protein has a wide application scene.)

一种微生物源氨基肽酶及其制备与应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物酶技术，具体涉及一种微生物源氨基肽酶的制备和应用。

背景技术

氨基肽酶(Aminopeptidases，简称APs，EC 3.4.11)是一类能从蛋白质和多肽N端选择性切除氨基酸残基产生游离氨基酸的外切蛋白酶，广泛存在于不同物种的生物体中，包括哺乳动物、植物、微生物等。由于氨基肽酶种类多样，可对多种蛋白质N端残基进行修饰，因此该蛋白酶在食品工业和生物制药中具有广泛的应用。比如，可用于脱除蛋白水解液的苦味，用蛋白酶水解后的蛋白质水解液通常都呈现苦味，利用氨基肽酶进一步水解蛋白质的酶解液，可以脱除其苦味；蛋白质的深度水解，氨基肽酶与蛋白酶复合使用，可以大幅度提高蛋白质的水解度，在酱油酿造、干酪生产及其它蛋白水解产品的制备过程中，可以提高蛋白质的利用率，节省成本；通过控制蛋白质的酶解可进行生物活性多肽的制备，生物活性多肽大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极低，但生物活性极高，具有保健和美容的功能。由于其很高的生产应用价值，对氨基肽酶的研究越来越受到重视。

目前，商业化的氨基肽酶主要通过从动植物中提取和微生物法来生产。前者提取氨基肽酶步骤较复杂、成本较高，因此从动植物中提取相关氨基肽酶一般主要用于酶学性质的表征和相关疾病的诊断；而后者，虽然产氨基肽酶的微生物种类较多，但大多数菌种由于产酶能力低或者存在安全隐患等原因并不适合大规模生产氨基肽酶，比如曲霉菌、芽孢杆菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的不足，提供一种微生物源氨基肽酶及其制备与应用。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种微生物源氨基肽酶，该氨基肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提供了所述氨基肽酶在食品工业和生物制药行业作为蛋白质或多肽的水解酶的应用。

本发明还提供了所述蛋白酶的制备方法，是以单核细胞增多性李斯特菌野生株的基因组DNA为模版进行PCR扩增反应，获得含有氨基肽酶目的基因且该基因含有酶切位点的目的片段；将目的基因与载体以限制性内切酶Kpn I和BamH I进行双酶切，然后将目的基因连接入表达载体pET30a(+)；连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α感受态细胞中，在Kana/LB固态琼脂培养基上进行培养；将阳性克隆重组菌质粒入感受态细胞E.coliRosetta中，取单克隆菌落进行扩大培养，经超声破碎、咪唑洗脱和镍离子树脂柱亲和层析，分离纯化得到重组蛋白，即所述微生物源氨基肽酶。

本发明中，所述制备方法具体包括以下步骤：

(1)采用特异性引物对李斯特菌野生株的基因组DNA进行扩增，扩增同时在引物上设计Kpn I和BamH I的酶切位点，所述特异性引物的序列分别为：

上游引物：5’-CGGGGTACCATGACAGTATTTAGTGAAAAGTTAGAAAAGTATGC-3’；

下游引物：5’-CGCGGATCCTTAGAACGCCCAGTCGCCTTTA-3’；

所用PCR扩增体系为：KOD-plus-Neo 1μL，10×PCR Buffer for KOD-plus-Neo 5μL，MgSO₄ 3μL，dNTPs 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板2μL，加ddH₂O至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性30s，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min 30s，循环25～35次，最后68℃延伸8～12min；

(2)以限制性内切酶Kpn I和BamH I分别双酶切pET30a(+)质粒和扩增产物，电泳后回收目的产物，然后用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，将目的基因与载体连接；将连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，涂布在Kana/LB琼脂固态培养基上，37℃过夜培养，获得重组菌株；在Kana/LB琼脂固态培养基中进行培养，卡那霉素浓度为50mg/L，琼脂浓度为1.5％；

(3)挑取重组菌株单克隆至5mL Kana/LB琼脂液体培养基中，37℃过夜；培养后抽提质粒，测序；

(4)将测序正确的质粒转化至E.coli Rosetta中，过夜培养；然后挑取重组菌株单克隆至500mL Kana/LB培养基中，在37℃、150r/min下培养；待培养至OD_{600 nm}＝0.6时，加入终浓度为0.6mM的IPTG，在30℃、100～300r/min诱导8h，得到蛋白诱导表达菌液；将菌液3700r/min离心15min，弃上清，收集沉淀；然后加入30mL、50mM的PBS，用细胞超声破碎仪将细胞裂解；离心3700r/min离心15min收集上清，上清液与镍柱结合4℃、4h，然后过柱纯化；使用30mL、50mM咪唑洗脱杂蛋白，再以6-8mL、400mM咪唑洗脱目的蛋白，最终得到纯化的活性蛋白，即所述微生物源氨基肽酶。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明中的氨基肽酶选择了成熟的商业化的工程菌大肠杆菌Rosetta进行表达，该菌具有安全，表达稳定和易培养的特点；本发明中的微生物源氨基肽酶制备技术采用基因工程表达进行实现，克服了天然菌中氨基肽酶含量少的缺点，可以批量发酵；同时本发明中的氨基肽酶为可溶性表达形式避免了其他微生物源蛋白酶为包涵体的缺点。本发明中的氨基肽酶经多次重复试验测试，确认具有氨基肽酶活性。

2、本发明中的微生物源氨基肽酶属氨基肽酶M29家族II型，来源于单核细胞增多性李斯特菌。该蛋白酶是一类能从蛋白质和多肽N端选择性切除氨基酸残基产生游离氨基酸的外切蛋白酶，广泛存在于不同物种的生物体中，包括哺乳动物、植物、微生物等。氨基肽酶种类多样，可对多种蛋白质N端残基进行修饰。一方面，在细菌和细胞中，该蛋白酶发挥了参与了靶蛋白的修饰成熟，免疫细胞抗原呈递和肝肾损伤检测指标的作用；另一方面，在工业应用中，该氨基肽酶具有食品风味改善，生物活性肽制备和神经性化学毒剂特异性清除等功能。

3、该方法构建的重组菌并能高效且迅速地表达出具有活性的蛋白，目的蛋白产量高且该蛋白具有很高的氨基肽酶酶活性，为该蛋白酶在工业化生产、食品加工、医药保健提供了更好的技术支撑，具有较高的研究及潜在的应用价值。

4、该微生物源氨基肽酶的物理特征特征为可溶性形式，且保留天然活性，因而具备广泛应用场景。

附图说明

图1为重组蛋白在大肠杆菌E.coli Rosetta的诱导表达及纯化。

图示中M为蛋白Marker，1、2、3、4、5为纯化的重组蛋白。

具体实施方式

本发明所述单核细胞增多(单増)李斯特菌野生株系指EGD-e菌株，该菌株是购自ATCC的标准菌株。

主要试剂：LB培养基、琼脂糖H、琼脂、咪唑、氨苄霉素、卡那霉素、IPTG均购于上海生工生物工程公司，BHI培养基购自英国Oxoid公司，KOD-plus-Neo(PCR试剂盒)购自TOYOBO公司、PCR产物纯化/回收试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公司，限制性核酸内切酶购自NEB公司，T4连接酶购自Takara公司，质粒提取试剂盒购自天根生化有限公司。

主要仪器：摇床(HZ-9211K)、涡旋振荡器(ZEALWAY GI541)、多功能酶标仪(BioTekSynergyTM H1)、梯度PCR仪(Eppendorf)、凝胶成像系统(UVP)、金属浴(Thermo)、生物安全柜(BSC-II)、蛋白电泳仪(BIORAD)

下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

1、重组表达菌的构建

(1)采用特异的引物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)对李斯特菌野生株(如：ATCC的EGDe标准菌种或其他李斯特菌标准菌株)的基因组DNA进行扩增，扩增的同时在引物上设计Kpn I和BamH I的酶切位点，扩增引物为：

SEQ ID NO.2：

上游引物5’-CGGGGTACCATGACAGTATTTAGTGAAAAGTTAGAAAAGTATGC-3’

SEQ ID NO.3：

下游引物5’-CGCGGATCCTTAGAACGCCCAGTCGCCTTTA-3’

PCR扩增体系为：KOD-plus-Neo 1μL，10×PCR Buffer for KOD-plus-Neo 5μL，MgSO₄ 3μL，dNTPs 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板2μL，加ddH₂O至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性30s，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min 30s，循环25～35次，最后68℃延伸8～12min。

(2)以限制性内切酶Kpn I和BamH I分别双酶切pET30a(+)质粒和扩增产物，1％电泳后回收目的产物。然后用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，将目的基因与载体连接。最后将连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，涂布在Kana/LB琼脂固态培养基上，37℃静置，过夜培养，获得重组菌株；在Kana/LB琼脂固态培养基中进行培养，卡那霉素浓度为50mg/L，琼脂浓度为1.5％。

(3)挑取重组菌株单克隆至5mL Kana/LB液体培养基中，37℃，150r/min培养过夜后，用PCR、双酶切质粒和测序等方法对重组菌株进行鉴定。

2、重组蛋白的表达及纯化

将测序正确的阳性质粒转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli Rosetta中，获得重组蛋白表达菌株。挑取重组菌株单克隆至5mL液体Kana/LB培养基中过夜培养，然后取1mL菌液转接入500mL Kana/LB培养基中，在37℃，150r/min下发酵培养。待培养至OD_600nm＝0.6时，加入终浓度为0.6mM的IPTG，30℃，100～300r/min诱导8h，得到蛋白诱导表达菌液。将菌液3700r/min离心15min，弃上清，收集沉淀后加入30mL、50mM的PBS，用细胞超声破碎仪将细胞裂解，离心3700r/min离心15min收集上清，上清液与镍柱结合4℃，4h，然后过柱纯化。使用30mL，50mM咪唑洗脱杂蛋白，6-8mL，400mM咪唑洗脱目的蛋白，最终得到纯化的活性蛋白(即本发明所述微生物源氨基肽酶)。

初始LB培养基以质量分数计，包括0.9～1.6％的胰蛋白胨，0.8～1.4％的氯化钠，0.5～0.7％的酵母提取物，余量为去离子水。

活性蛋白的纯度用SDS-PAGE方法检测。

经测序，氨基肽酶的氨基酸序列如下：(1-410aa)

该氨基酸序列的三联密码子格式如SEQ ID NO.1所示。

3、蛋白酶活性测定

氨基肽酶的外切酶活性采用水解氨基酸对硝基苯胺的方法进行。

具体方法是：在96孔板中，采用200μl反应体系，分别加入终浓度为25mM Tris-HCl缓冲液，0.5μM纯化的氨基肽酶，1mM氨基酸对硝基苯胺，利用酶标仪在OD_405nm处检测吸光度值，每个反应设置3个平行实验，酶标仪读数间隔为1h，连续读12h。经反复测定获知，发明中的氨基肽酶分别以Leu-pNA、Arg-pNA和Lys-pNA为底物，利用米氏方程获得的酶活反应效率参数k_cat/K_m值分别为3.149×10⁵min^-1M^-1、1.536×10⁵min^-1M^-1和1.035×10⁴min^-1M^-1。这说明本发明中的氨基肽酶具有较强氨基肽酶活性，且具有较宽泛的底物选择性，可以对蛋白质或多肽N端多种残基进行识别切割，从而达到水解和修饰蛋白质的目的，对亮氨酸残基的水解效率最高。

在实际用于食品工业和生物制药工业的水解蛋白质或多肽的生产过程中，本发明所述微生物源氨基肽酶应以液体形式呈现。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 一种微生物源氨基肽酶及其制备与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Val Phe Ser Glu Lys Leu Glu Lys Tyr Ala Glu Leu Ile Val

1 5 10 15

Lys Val Gly Val Asn Val Gln Pro Glu Gln Lys Val Val Ile Met Ala

20 25 30

Pro Val Asp Ala Ala Pro Leu Val Arg Leu Ile Ser Lys Tyr Ala Phe

35 40 45

Glu Val Gly Ala Glu Asp Val Ile Met Asp Trp Arg Asp Glu Glu Leu

50 55 60

Gly Ala Leu Arg Tyr Lys Asn Ala Pro Leu Arg Val Phe Glu Ser Ala

65 70 75 80

Pro Val His Arg Val Ala Glu Lys Thr Glu Leu Ala Lys Glu Gly Ala

85 90 95

Cys Phe Ile Ser Ile Thr Ser Glu Asp Pro Asp Leu Leu Asn Gly Val

100 105 110

Asp Ser Asn Lys Ile Ala Thr Phe Gln Lys Thr Met Gly Gly Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Arg Glu Leu Met Gln Ala Asn Val Val Ser Trp Thr Val

130 135 140

Val Ala Ala Ala Ser Gln Gly Trp Ala Ala Lys Val Phe Pro Asp Leu

145 150 155 160

Thr Pro Ala Glu Gln Met Glu Thr Leu Trp Glu Ala Ile Phe Glu Thr

165 170 175

Thr Arg Ile Asn Thr Glu Asn Pro Val Glu Thr Trp Lys Asn His Asp

180 185 190

Gln Thr Leu Ala Ala Lys Ala Glu Ser Leu Asn Glu Lys Gln Phe Thr

195 200 205

Ser Leu His Tyr Thr Ala Pro Gly Thr Asp Leu Thr Ile Gly Leu Pro

210 215 220

Lys Asn His Leu Trp Val Gly Ala Gly Ser Lys Asn Lys Lys Gly His

225 230 235 240

Glu Phe Met Ala Asn Met Pro Thr Glu Glu Val Phe Cys Cys Ala Asp

245 250 255

Lys Leu Lys Val Glu Gly Tyr Val Ser Ser Thr Lys Pro Leu Ser Tyr

260 265 270

Ala Gly Asn Ile Ile Asp Asp Phe Lys Ile Thr Phe Glu Lys Gly Arg

275 280 285

Ile Val Gly Val Glu Ala Ala Ser Gly Glu Glu Ile Leu Lys Asp Leu

290 295 300

Ile Ala Thr Asp Glu Gly Ser His Tyr Leu Gly Glu Val Ala Leu Val

305 310 315 320

Pro Asp Pro Ser Pro Ile Ser Gln Ser Gly Ile Leu Phe Tyr Asn Thr

325 330 335

Leu Phe Asp Glu Asn Ala Ser Asn His Leu Ala Ile Gly Ser Ala Tyr

340 345 350

Ala Phe Asn Val Lys Gly Gly Glu Glu Met Ser Arg Glu Glu Leu Glu

355 360 365

Ala Ala Gly Val Asn Asn Ser Leu Thr His Val Asp Phe Met Ile Gly

370 375 380

Ser Ser Glu Met Asp Ile Asp Gly Val Thr Glu Ser Gly Glu Val Val

385 390 395 400

Pro Val Phe Arg Lys Gly Asp Trp Ala Phe

405 410

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggggtacca tgacagtatt tagtgaaaag ttagaaaagt atgc 44

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcct tagaacgccc agtcgccttt a 31