一种羧肽酶及其编码基因和应用
阅读说明：本技术 一种羧肽酶及其编码基因和应用 (Carboxypeptidase, and coding gene and application thereof ) 是由 叶茂 邓毛程 李静 张远平 尚红岩 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种羧肽酶及其编码基因和应用。该羧肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了编码该羧肽酶的核苷酸序列。该羧肽酶具有能水解几乎所有的氨基酸残基的作用,具有良好的应用潜力,并且对丰富羧肽酶家族成员,开发我国传统调味品环境资源都具有重要意义。因此,可将其用于制备小分子寡肽,可通过如下步骤制备小分子寡肽：将本发明提供的羧肽酶加入到含有蛋白底物的水解反应体系中,在25～35℃条件下进行酶水解反应2～8h,得到相应的小分子寡肽。(The invention discloses a carboxypeptidase, and a coding gene and application thereof. The amino acid sequence of the carboxypeptidase is shown in SEQ ID NO. 1. The invention also provides a nucleotide sequence for coding the carboxypeptidase. The carboxypeptidase has the function of hydrolyzing almost all amino acid residues, has good application potential, and has important significance for enriching members of carboxypeptidase families and developing environmental resources of traditional condiments in China. Thus, it can be used to prepare small molecule oligopeptides, which can be prepared by: the carboxypeptidase provided by the invention is added into a hydrolysis reaction system containing a protein substrate, and the enzyme hydrolysis reaction is carried out for 2-8h at the temperature of 25-35 ℃, so as to obtain the corresponding small molecular oligopeptide.)
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，特别涉及一种羧肽酶及其编码基因和应用。
背景技术
羧肽酶(Carboxypeptidases,CPs)是指能专一催化水解多肽链羧基末端氨基酸的一类外肽酶，是一种具有重要应用潜力的工业酶制剂。根据酶活性部位作用机制的不同，羧肽酶主要可以分为丝氨酸羧肽酶(EC.3.4.16)，金属羧肽酶(EC.3.4.17)和半胱氨酸羧肽酶(EC.3.4.18)。羧肽酶的应用主要涉及到生物、化学、医学等多个学科领域。例如，在食品和饲料工业，可用于制备高F值寡肽，去除赭曲霉素，多肽脱苦、生物活性多肽的延长或特异性修饰；在生物学领域，可用于多肽的合成及多肽氨基酸序列测定，也可作为模式酶，对其他酶的研究提供帮助；在医学用途方面，由于羧肽酶广泛参与机体的生化反应，可通过体内羧肽酶的检测达到诊断和治疗疾病的目的；此外，在医药上还可用于体内不良物质(甲氨蝶吟等)的降解。近几年，羧肽酶的新功能和新用途不断被发现和拓展，使得羧肽酶具有更高的研究价值和更广阔的应用前景。
宏基因组学(Metagenomics)是近年来随着微生物学和现代生命科学的迅猛发展兴起的一门新兴的科学技术。其基本研究思路是直接提取环境中所有微生物的基因组DNA，克隆到合适的载体，构建宏基因组文库，将环境中全部微生物的核酸信息收集在一起，并运用序列筛选或功能筛选方式从文库中获得有用的酶、抗生素、活性物质等。许多新型的生物催化剂已通过宏基因组文库技术成功筛选到，如酯酶、纤维素酶、木聚糖酶及β-葡萄糖苷酶等生物催化剂，并且在此基础上获得了有关新酶的许多特征信息。
到目前为止，从宏基因组文库中寻找新羧肽酶基因的研究，国内外尚无相关的报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种羧肽酶。该酶对C-端氨基酸残基专一性低，能水解几乎所有的氨基酸残基，对丰富羧肽酶家族成员，开发新的蛋白水解成风味肽的途径都具有重要意义。
本发明的另一目的在于提供编码所述羧肽酶的基因。
本发明的再一目的在于提供所述羧肽酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种羧肽酶，其氨基酸序列如下所示：
MGSTVTEVKGMFSVRFIAIVTMLTLFLVLDLSAAAEKTGAALDYEANSGKILYQQNADEIIAIASMTKMMSQLEYLVHEAVDKGKIALDQKVKVSEGGYKTSQDIETSNVPENGGRFPNYTVKEYEPMAIFEGNGSATIARLAEGTAGKEVDFVLKMANDHAKEWGGSDICLKKYKFVNATGLTNKDLKGGPEGTTPEKNFEMSALDVAFVFAPQRLNPDGYPVQLDTAKIPGKKEFWRKNPFTSTGGNWMLPGIKQYDGLKWNKTGTSPEAEYKGFTGTVSEPEGETRNISVVIIKTYPSSNTARYYVDTKKHSYLIGGLILNNFEKKMYGTDSSVNFGQETISFDNARDKDVVVQTKQYISLPDQKGSKDVYKKMEFKSKGQEAPIKQGAKLGSMTISKDAEDPGFLSRGKSMKVTTSAIEFANEFTRSMREIGLLFFSGVWNAVDVKNNTVK。
一种核苷酸序列，是编码所述的羧肽酶的核苷酸序列；优选为无内含子，具有1365bp完整的开放读码框的核苷酸序列；更优选为如下所示的序列：
ATGGGTTCTACCGTTACCGAAGTTAAAGGTATGTTCTCTGTTCGTTTCATCGCTATCGTTACCATGCTGACCCTGTTCCTGGTTCTGGACCTGTCTGCTGCTGCTGAAAAAACCGGTGCTGCTCTGGACTACGAAGCTAACTCTGGTAAAATCCTGTACCAGCAGAACGCTGACGAAATCATCGCTATCGCTTCTATGACCAAAATGATGTCTCAGCTGGAATACCTGGTTCACGAAGCTGTTGACAAAGGTAAAATCGCTCTGGACCAGAAAGTTAAAGTTTCTGAAGGTGGTTACAAAACCTCTCAGGACATCGAAACCTCTAACGTTCCGGAAAACGGTGGTCGTTTCCCGAACTACACCGTTAAAGAATACGAACCGATGGCTATCTTCGAAGGTAACGGTTCTGCTACCATCGCTCGTCTGGCTGAAGGTACCGCTGGTAAAGAAGTTGACTTCGTTCTGAAAATGGCTAACGACCACGCTAAAGAATGGGGTGGTTCTGACATCTGCCTGAAAAAATACAAATTCGTTAACGCTACCGGTCTGACCAACAAAGACCTGAAAGGTGGTCCGGAAGGTACCACCCCGGAAAAAAACTTCGAAATGTCTGCTCTGGACGTTGCTTTCGTTTTCGCTCCGCAGCGTCTGAACCCGGACGGTTACCCGGTTCAGCTGGACACCGCTAAAATCCCGGGTAAAAAAGAATTCTGGCGTAAAAACCCGTTCACCTCTACCGGTGGTAACTGGATGCTGCCGGGTATCAAACAGTACGACGGTCTGAAATGGAACAAAACCGGTACCTCTCCGGAAGCTGAATACAAAGGTTTCACCGGTACCGTTTCTGAACCGGAAGGTGAAACCCGTAACATCTCTGTTGTTATCATCAAAACCTACCCGTCTTCTAACACCGCTCGTTACTACGTTGACACCAAAAAACACTCTTACCTGATCGGTGGTCTGATCCTGAACAACTTCGAAAAAAAAATGTACGGTACCGACTCTTCTGTTAACTTCGGTCAGGAAACCATCTCTTTCGACAACGCTCGTGACAAAGACGTTGTTGTTCAGACCAAACAGTACATCTCTCTGCCGGACCAGAAAGGTTCTAAAGACGTTTACAAAAAAATGGAATTCAAATCTAAAGGTCAGGAAGCTCCGATCAAACAGGGTGCTAAACTGGGTTCTATGACCATCTCTAAAGACGCTGAAGACCCGGGTTTCCTGTCTCGTGGTAAATCTATGAAAGTTACCACCTCTGCTATCGAATTCGCTAACGAATTCACCCGTTCTATGCGTGAAATCGGTCTGCTGTTCTTCTCTGGTGTTTGGAACGCTGTTGACGTTAAAAACAACACCGTTAAA。
上述核苷酸序列可通过化学合成方法得到，也可通过如下步骤制备得到：
一、提取传统发酵食品环境样品，提取总基因组并纯化；
二、将纯化后的总基因组经酶切处理；
三、将酶切产物连接到克隆载体上，电击转化大肠杆菌工程菌中构建传统发酵食品环境宏基因组文库，用SIGEX(基于底物诱导的基因表达方法)方法从文库中筛选羧肽酶阳性克隆，通过高通量筛选得到阳性克隆子；
四、经测序和Blast比较设计引物，以阳性克隆子的质粒为模板，用设计好的引物进行链式酶聚合反应，从而克隆得到上述核苷酸序列。
步骤一中所述的传统发酵食品包括腐乳、豆豉、豆酱和酱油等。
步骤二中所述的酶优选为Sau3AI。
步骤三种所述的克隆载体优选为Puc118 BamHI/BAP。
步骤三中所述的大肠杆菌工程菌优选为大肠杆菌DH5α。
步骤三中所述的SIGEX(基于底物诱导的基因表达方法)方法如下：所有的克隆子在含有诱导物IPTG的固体培养基中培养，用IPTG诱导羧肽酶和荧光蛋白GFP的表达，凡是表达gfp基因的克隆必定含有羧肽酶操纵子及相应的羧肽酶基因，根据GFP的荧光表达强弱，用流式细胞仪(FACS)选出表达GFP荧光最强(间接表明羧肽酶的表达量最高)的阳性克隆子。
步骤四中所述的设计好的引物如下：
上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGGTTCTACCGTTAC-3’；
下游引物R1：5’-CGGAAGCTTTTTAACGGTGTTGTT-3’。
另外，本发明还提供了上述羧肽酶的制备方法，可通过化学合成方法获得，或是采用上述核苷酸序列表达得到，包括如下步骤：
(1)将上述核苷酸序列克隆至表达载体中，再转入表达细胞中，得到含有重组载体的细胞；
(2)对步骤(1)得到的含有重组载体的细胞进行培养，经IPTG诱导，从培养物分离、纯化，获得羧肽酶。该羧肽酶具有能水解几乎所有的氨基酸残基的作用。
步骤(1)中所述的表达载体优选为pET-32a(+)。
步骤(1)中所述的表达细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
步骤(2)中所述的培养的培养基优选为含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基。
步骤(2)中所述的诱导的具体步骤如下：当含有重组载体的细胞生长至OD600＝0.7～0.9时加入IPTG至终浓度0.5～1.5mM，20～30℃、150～250r/min下培养20～25h；当含有重组载体的细胞生长至OD600＝0.8时加入IPTG至终浓度1mM，25℃、200r/min下培养22h。
步骤(2)中所述的分离的方式优选为离心。
另外，本发明还提供了所述的羧肽酶在制备小分子寡肽中的应用，优选包括如下步骤：将所述的羧肽酶加入到含有蛋白底物的水解反应体系中，在25～60℃条件下进行酶水解反应2～8h，得到相应的小分子寡肽。
所述的蛋白底物包括大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白和酵母蛋白等。
所述的水解反应体系的温度优选为35～55℃。
所述的水解反应体系的pH值为5～9；优选为6～8。
所述的水解反应体系中的缓冲溶液优选为醋酸缓冲液。
所述的蛋白底物在所述的水解反应体系中的质量浓度为1％～10％；优选为2％。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)相比于现有技术，本发明应用宏基因组技术从我国传统调味品环境宏基因组文库获得的羧肽酶，发现了该酶具有能水解几乎所有的氨基酸残基的作用，具有良好的应用潜力，并且对丰富羧肽酶家族成员，开发我国传统调味品环境资源都具有重要意义。
(2)本发还通过对该酶在水解蛋白生成小分子寡肽中的最适条件进行研究，发现了在以大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、酵母蛋白等蛋白为底物原料的水解生成小分子寡肽反应中，本发明的羧肽酶在25-35℃条件下进行酶催化反应2-8h，所述底物的质量浓度为1％～10％，采用上述反应条件能够高效、快速地水解生成小分子寡肽，小分子寡肽分子量≤3000Da，具有很好的应用价值。
附图说明
图1是本发明提供的羧肽酶纯化的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为重组蛋白粗酶液(未纯化)；泳道2为纯化后的蛋白。
图2是纯化的羧肽酶的最适反应温度的测定结果图。
图3是纯化的羧肽酶的最适反应pH值的测定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1羧肽酶基因的获得及水解蛋白生成小分子寡肽的验证
1、羧肽酶基因的获得
从我国传统发酵食品——腐乳发酵环境样品，构建发酵食品环境宏基因组文库，具体步骤如下：提取总基因组并纯化；将纯化后的总基因组经Sau3AI酶切处理；将酶切产物连接到pUC118 BamHI/BAP载体上，电击转化大肠杆菌DH5α中构建传统发酵食品环境宏基因组文库。
将所获得的基因组文库的所有克隆子在含有诱导物IPTG的固体培养基中培养，用IPTG诱导羧肽酶和荧光蛋白GFP的表达，凡是表达gfp基因的克隆必定含有羧肽酶操纵子及相应的羧肽酶基因，根据GFP的荧光表达强弱，用流式细胞仪(FACS)选出表达GFP荧光最强(间接表明羧肽酶的表达量最高)的阳性克隆子。
提取上述阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序，得到一个羧肽酶的核酸序列，该序列由1365个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示，将其命名为cp_215；该核酸编码的多肽，含455个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其命名为CP_215。
2、基因片段的克隆
根据核酸cp_215序列，设计扩增引物：上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGGTTCTACCGTTAC-3’(下划线为BamHI酶切位点序列)；下游引物R1：5’-CGGAAGCTTTTTAACGGTGTTGTT-3’(下划线为HindIII酶切位点序列)。
以阳性克隆子的质粒为模板，以F1和R1为引物，进行PCR扩增，反应体系为：PrimeSTARTM HS DNA Ploymerase(2.5U/μl)0.2μl，5×缓冲液6μl，dNTP Mix(2.5mM)2.4μl，模板(100ng/μl)0.5μl，引物F1和F2(10mM)各0.2μl，超纯水补足至50μl。PCR反应条件：95℃预变性2min；98℃变性10s、70℃退火15s、72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃。
将PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后用BamHI和HindIII双酶切16h，与经过同样处理的pET-32a(+)(Invitrogen)表达载体进行连接，电转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒DNA，进行测序验证发现其核苷酸序列与SEQ ID NO.2中的序列相同，能够有效地获取目的基因片段。
3、重组羧肽酶CP_215的获得
将含有经测序验证正确质粒的菌株接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、250r/min下培养14h，按1(v/v)％的接种量转接至100ml的含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，当生长至OD600＝0.8时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度1.0mM，25℃、200r/min下培养22h，12000r/min离心5min，弃上清，将菌体重悬于20ml 50mMTri-HCl(pH7.5)中，用超声波破碎仪破碎菌体(200w、时间5秒、间隔5秒，全程5分钟，冰浴)，4℃、13000r/min离心15min，收集上清，即获得重组羧肽酶粗酶液。
将重组羧肽酶粗酶液用Invitrogen公司的His标签蛋白纯化试剂盒ProbandPurification system进行纯化重组蛋白，具体操作步骤按该公司产品说明书进行。纯化后的重组蛋白液氮速冻，保存至超低温冰箱中。纯化后的重组蛋白的浓度是180μg/ml。
粗酶液和纯化后的蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，结果如图1所示。可见，通过His标签蛋白纯化试剂盒Proband Purification system能成功从粗酶液纯化得到本发明的羧肽酶。
4、水解蛋白生成小分子寡肽功能的验证
将上述重组羧肽酶粗酶液1ml或纯化的酶液10μl，加入9ml pH6.0酸酸缓冲液(取醋酸钠54.6g，加1mol/L醋酸溶液20ml溶解后，加水稀释至500ml即可)作为反应介质，分别试验不同的底物(大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、酵母蛋白等蛋白)，浓度为2(w/w)％，30℃水浴反应6h后，水解生成相应的小分子寡肽，小分子寡肽分子量≤3000Da。产物通过GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)进行结构鉴定。
实施例2重组羧肽酶CP_215最适反应温度的测定
用浓度为100mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，以1％(w/v)酪蛋白为底物，加入纯化后的酶液100μl，分别在20、25、30、35、40、45、50、55和60℃保温10min，迅速加入2ml浓度为0.4mol/L的三氯乙酸终止反应，室温静置15min，1000rpm离心10min，取上清1ml，置于试管中，加入5ml浓度为0.4mol/L的Na2CO3溶液及1ml福林酚溶液，测定吸光值A680nm。结果如图2所示，重组羧肽酶CP_215在35～55℃仍具有较高的催化活性，最适反应温度为40℃。
实施例3重组羧肽酶CP_215最适反应pH值的测定
以1％(w/v)酪蛋白为底物，加入纯化后的酶液10μl，分别在pH4.0～7.0(100mM磷酸盐缓冲液)及pH7.0～9.0(Tris-HCl缓冲液)等不同pH值条件下，40℃保温10min，迅速加入2ml浓度为0.4mol/L的三氯乙酸终止反应，室温静置15min，1000rpm离心10min，取上清1ml，置于试管中，加入5ml0.4mol/LNa2CO3溶液及1ml福林酚溶液，测定吸光值A680nm。结果如图3所示，重组羧肽酶CP_215最适反应pH为7.5，在pH5.0～8.5仍有较高的酶活力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东轻工职业技术学院
<120> 一种羧肽酶及其编码基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 羧肽酶
<400> 1
Met Gly Ser Thr Val Thr Glu Val Lys Gly Met Phe Ser Val Arg Phe
1 5 10 15
Ile Ala Ile Val Thr Met Leu Thr Leu Phe Leu Val Leu Asp Leu Ser
20 25 30
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Gly Ala Ala Leu Asp Tyr Glu Ala Asn Ser
35 40 45
Gly Lys Ile Leu Tyr Gln Gln Asn Ala Asp Glu Ile Ile Ala Ile Ala
50 55 60
Ser Met Thr Lys Met Met Ser Gln Leu Glu Tyr Leu Val His Glu Ala
65 70 75 80
Val Asp Lys Gly Lys Ile Ala Leu Asp Gln Lys Val Lys Val Ser Glu
85 90 95
Gly Gly Tyr Lys Thr Ser Gln Asp Ile Glu Thr Ser Asn Val Pro Glu
100 105 110
Asn Gly Gly Arg Phe Pro Asn Tyr Thr Val Lys Glu Tyr Glu Pro Met
115 120 125
Ala Ile Phe Glu Gly Asn Gly Ser Ala Thr Ile Ala Arg Leu Ala Glu
130 135 140
Gly Thr Ala Gly Lys Glu Val Asp Phe Val Leu Lys Met Ala Asn Asp
145 150 155 160
His Ala Lys Glu Trp Gly Gly Ser Asp Ile Cys Leu Lys Lys Tyr Lys
165 170 175
Phe Val Asn Ala Thr Gly Leu Thr Asn Lys Asp Leu Lys Gly Gly Pro
180 185 190
Glu Gly Thr Thr Pro Glu Lys Asn Phe Glu Met Ser Ala Leu Asp Val
195 200 205
Ala Phe Val Phe Ala Pro Gln Arg Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Pro Val
210 215 220
Gln Leu Asp Thr Ala Lys Ile Pro Gly Lys Lys Glu Phe Trp Arg Lys
225 230 235 240
Asn Pro Phe Thr Ser Thr Gly Gly Asn Trp Met Leu Pro Gly Ile Lys
245 250 255
Gln Tyr Asp Gly Leu Lys Trp Asn Lys Thr Gly Thr Ser Pro Glu Ala
260 265 270
Glu Tyr Lys Gly Phe Thr Gly Thr Val Ser Glu Pro Glu Gly Glu Thr
275 280 285
Arg Asn Ile Ser Val Val Ile Ile Lys Thr Tyr Pro Ser Ser Asn Thr
290 295 300
Ala Arg Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Lys His Ser Tyr Leu Ile Gly Gly
305 310 315 320
Leu Ile Leu Asn Asn Phe Glu Lys Lys Met Tyr Gly Thr Asp Ser Ser
325 330 335
Val Asn Phe Gly Gln Glu Thr Ile Ser Phe Asp Asn Ala Arg Asp Lys
340 345 350
Asp Val Val Val Gln Thr Lys Gln Tyr Ile Ser Leu Pro Asp Gln Lys
355 360 365
Gly Ser Lys Asp Val Tyr Lys Lys Met Glu Phe Lys Ser Lys Gly Gln
370 375 380
Glu Ala Pro Ile Lys Gln Gly Ala Lys Leu Gly Ser Met Thr Ile Ser
385 390 395 400
Lys Asp Ala Glu Asp Pro Gly Phe Leu Ser Arg Gly Lys Ser Met Lys
405 410 415
Val Thr Thr Ser Ala Ile Glu Phe Ala Asn Glu Phe Thr Arg Ser Met
420 425 430
Arg Glu Ile Gly Leu Leu Phe Phe Ser Gly Val Trp Asn Ala Val Asp
435 440 445
Val Lys Asn Asn Thr Val Lys
450 455
<210> 2
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码羧肽酶的核苷酸序列
<400> 2
atgggttcta ccgttaccga agttaaaggt atgttctctg ttcgtttcat cgctatcgtt 60
accatgctga ccctgttcct ggttctggac ctgtctgctg ctgctgaaaa aaccggtgct 120
gctctggact acgaagctaa ctctggtaaa atcctgtacc agcagaacgc tgacgaaatc 180
atcgctatcg cttctatgac caaaatgatg tctcagctgg aatacctggt tcacgaagct 240
gttgacaaag gtaaaatcgc tctggaccag aaagttaaag tttctgaagg tggttacaaa 300
acctctcagg acatcgaaac ctctaacgtt ccggaaaacg gtggtcgttt cccgaactac 360
accgttaaag aatacgaacc gatggctatc ttcgaaggta acggttctgc taccatcgct 420
cgtctggctg aaggtaccgc tggtaaagaa gttgacttcg ttctgaaaat ggctaacgac 480
cacgctaaag aatggggtgg ttctgacatc tgcctgaaaa aatacaaatt cgttaacgct 540
accggtctga ccaacaaaga cctgaaaggt ggtccggaag gtaccacccc ggaaaaaaac 600
ttcgaaatgt ctgctctgga cgttgctttc gttttcgctc cgcagcgtct gaacccggac 660
ggttacccgg ttcagctgga caccgctaaa atcccgggta aaaaagaatt ctggcgtaaa 720
aacccgttca cctctaccgg tggtaactgg atgctgccgg gtatcaaaca gtacgacggt 780
ctgaaatgga acaaaaccgg tacctctccg gaagctgaat acaaaggttt caccggtacc 840
gtttctgaac cggaaggtga aacccgtaac atctctgttg ttatcatcaa aacctacccg 900
tcttctaaca ccgctcgtta ctacgttgac accaaaaaac actcttacct gatcggtggt 960
ctgatcctga acaacttcga aaaaaaaatg tacggtaccg actcttctgt taacttcggt 1020
caggaaacca tctctttcga caacgctcgt gacaaagacg ttgttgttca gaccaaacag 1080
tacatctctc tgccggacca gaaaggttct aaagacgttt acaaaaaaat ggaattcaaa 1140
tctaaaggtc aggaagctcc gatcaaacag ggtgctaaac tgggttctat gaccatctct 1200
aaagacgctg aagacccggg tttcctgtct cgtggtaaat ctatgaaagt taccacctct 1260
gctatcgaat tcgctaacga attcacccgt tctatgcgtg aaatcggtct gctgttcttc 1320
tctggtgttt ggaacgctgt tgacgttaaa aacaacaccg ttaaa 1365
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物F1
<400> 3
cgcggatcca tgggttctac cgttac 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物R1
<400> 4
cggaagcttt ttaacggtgt tgtt 24
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