具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。

在球形赖氨酸芽孢杆菌C3-41基因组中预测到氨肽酶Amp0279的编码基因：其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其对应氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

将amp0279全基因通过引物对

P6-F:CGCGGATCCATGACGTTTGAAGAAAAATTAC

P6-R:CGCGAGCTCTTAGAAAGCCCAGCTACCT

从C3-41基因组中扩增下来，通过双酶切、连接将amp0279基因插入表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pET28a-amp0279。

重组质粒pET28a-amp0279核酸序列为SEQ ID NO:3所示。(加粗字母的序列为在pET28a中插入的amp0279的序列)。

将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株，并提取质粒进一步测序验证。此过程得到重组菌株大肠杆菌BL21(pET28a-amp0279)。

本发明提供的产氨肽酶Amp0279的基因工程菌株BL21(pET28a-amp0279)，所表达的氨肽酶经镍柱亲和层析法纯化，进行酶学性质检测。

具体的氨肽酶Amp0279基因序列的获得、重组质粒和重组菌株的构建、产物氨肽酶Amp0279的性质分析、应用条件分析方法如下：

实验材料：

1)菌株和质粒：球形赖氨酸芽孢杆菌C3-41、大肠杆菌JM109和BL21、谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647；pET28a和pXMJ19-5.7。

2)酶和试剂盒：限制性内切酶(NEB)、Golden Mix(擎科)、Rapid Tag Master Mix(Vazyme)、T4 DNA连接酶(NEB)；DNA纯化试剂盒(Omega)、FastPure Plasmid Mini Kit(Vazyme)、PAGE凝胶快速制备试剂盒(10％)(上海雅酶生物医药科技有限公司)、BCA试剂盒(Takara)、蛋白染料(Biosharp)和蛋白亲和层析镍柱(Ni-SepharoseTM 6Fast Flow,GEHealthare,US)；in-fusion连接酶等工具酶(TaKaRa)；Cycle-Pure Kit和Gel ExtractionKit(Omega Bio-Tek)；Prestained Protein Ladder 26616(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；Western(Millipore，USA)。

3)生化试剂：Isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)；卡那霉素；氯霉素

50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：配好50mM磷酸氢二钠溶液后，用0.1M柠檬酸溶液调节pH(3.0-5.0)；10×TBST缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物购自赛默飞世尔科技公司；SDS、Tris购自北京拜尔迪生物技术有限公司；甘油、乙酸、盐酸、氯化钠、氯化镁、氯化钙购自国药集团有限公司；Leu-pNA购自SIGMA-ALDRICH；脱脂奶粉购自北京雷根生物技术有限公司。

对硝基苯胺法所需溶液：

底物200mM Leu-pNA：DMSO配制，0.063g Leu-pNA溶于1250μL DMSO，50μL分装。

反应终止液：40％(v/v)冰醋酸，160mL乙酸，用超纯水定容至400mL。

反应缓冲液：pH 8.0 50mM Tris-HCl，1.2114g溶于200mL超纯水。

50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液：分别配制0.1M磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，按比例混合，调pH 6.0、7.0后，加等体积超纯水调至浓度为50mM

50mM Tris-HCl缓冲液：配制50mM Tris溶液，加浓盐酸调节pH(8.0-9.0)

50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液：配50mM甘氨酸溶液，用5M氢氧化钠溶液调节pH(10.0-11.0)

金属离子溶液母液：用超纯水配制10mL

1M K⁺溶液：0.7455g KCl；

100mM Na⁺溶液：0.0584g NaCl；

100mM Mg²⁺溶液：0.2033g MgCl₂·6H₂O；

100mM Ca²⁺溶液：0.1010g CaCl₂；

100mM Mn²⁺溶液：0.1258g MnCl₂；

100mM Cu²⁺溶液：0.1705g CuCl₂·2H₂O；

100mM Zn²⁺溶液：0.288g ZnSO₄·7H₂O；

100mM Fe²⁺溶液：0.278g FeSO₄·7H₂O；

100mM Co²⁺溶液：0.2379gCoCl₂·6H₂O。

100mM EDTA：0.3722g EDTA。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1：氨肽酶Amp0279结构和功能预测及基因序列的获得

根据球形赖氨酸芽孢杆菌C3-41基因组序列(CP000817)，预测出amp0279基因(300199..301428)编码的蛋白质Amp0279可能为氨肽酶。序列比对发现Amp0279的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌编码的AmpS具有最高相似性(51％)(见图1)。3D建模分析发现其可能是一个二聚体结构，具有四个钴离子结合位点，可能属于M29家族(见图2)。图2是Amp0279 3D结构模型(SWISS-MODEL)。Amp0279是一个同源二聚体。图中靠左的为链A，靠右的为链B，4Co²⁺为其活性中心，标为圆点。预测的6个活性位点(GLU 249、GLU 315、HIS 344、TYR 351、HIS 377和ASP 379)围绕链A上的两个Co²⁺。根据其基因序列设计带有酶切位点BamHI和SacI的引物，将该基因从基因组中扩增出来，并纯化。

实施例2：含有氨肽酶Amp0279基因的重组表达质粒pET28a-amp0279及重组菌BL21(pET28a-amp0279)的构建

氨肽酶Amp0279基因5′端和3′端分别引入了限制性内切酶BamHI和SacI位点，用限制性内切酶BamHI和SacI完成氨肽酶Amp0279基因和大肠杆菌诱导型表达载体pET28a的双酶切，再使用连接酶将两者连接，构建重组表达质粒pET28a-amp0279。将该重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株BL21(pET28a-amp0279)，提取质粒测序验证。

实施例3：镍柱亲和层析法纯化氨肽酶Amp0279

将重组菌接种于5mL LB(50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220rpm过夜培养得到种子液。将种子液按照1:100的比例加入新鲜LB培养基(50μg/mL卡那霉素)中，培养3h左右至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度为1mM)进行低温慢速诱导(25℃，160rpm)5h左右。离心(5000g，10min)收菌，弃上清。超声破碎菌体，4℃，12000g，30min离心后保留上清液进行蛋白镍柱亲和层析。透析后，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。得到已知浓度的纯氨肽酶Amp0279，可经SDS-PAGE检测到约55KD的单一条带(纯化后Amp0279检测图见图3)。

实施例4：氨肽酶Amp0279的性质分析

用对硝基苯胺法检测氨肽酶酶活，本专利所用底物为Leu-pNA。将1mM底物Leu-pNA，10ng/μL Amp0279和反应缓冲液配成800μL反应液，反应1h后，加入200μL40％(v/v)的冰醋酸终止反应，检测405nm波长时的吸光度，判断底物水解情况和酶水解底物的能力。在30-80℃的50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)中测定氨肽酶活性，检测反应最适温度(图4)。在不同pH的反应缓冲液条件下，检测Amp0279氨肽酶活性(图5)。通过以上检测，确定50℃，pH 8.0为优化条件。定义U为在50℃，pH 8.0条件下，每分钟水解底物Leu-pNA产生1μmolpNA的酶量。将纯化后的酶在不同温度(40-80℃)下孵育2h，然后冷却至室温。在50℃，pH8.0下测定残留活性，评估Amp0279热稳定性(图6)。将酶与不同的缓冲液(如上所述pH 5.0-10.0)在4℃下孵育2h，在pH 8.0，50℃下测定残余活性，评估其pH稳定性(图7)。检测金属离子和金属离子螯和剂EDTA对Amp0279酶活性的影响(图8)，在最适温度和pH条件下，分别向反应体系中加入1mM K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Co²⁺或EDTA，1h后检测其吸光度。之后，探究不同浓度Co²⁺对其酶活的影响(图9)，向反应体系中加不同浓度的Co²⁺，测其酶活。

通过以上分析，发现Amp0279最优条件是50℃，pH8.0，在40-55℃、pH 6.0-9.0范围内酶活力稳定，最优条件下在加入100μM Co²⁺后，比酶活力可达35383U/mg。

实施例5：氨肽酶Amp0279与商业化风味酶的酶活力比较

将风味酶(上海源叶生物科技有限公司，LOT:P29F11B109057)粉末溶解在缓冲液(20mM Tris，200mMNaCl，pH＝8.0)中，作为储备溶液(400μg/mL)，然后用BCA蛋白质检测试剂盒(TaKaRa生物公司，日本)检测蛋白含量。酶活力测定方法同实施例4，条件包括通用条件(通常在30℃，pH7.5)，以及Amp0279的优化条件(50℃，pH8.0，100μM Co²⁺)。结果显示，在不添加Co²⁺的优化条件下，Amp0279的比酶活性约为的1/40(1024Vs.42249U/mg)，而在添加100μM Co²⁺的条件下，Amp0279的活性明显增加，可达到35383U/mg，略高于(33663U/mg)(见表1)。

表1 Amp0279和商业化风味酶的酶活力比较。

其中，a:根据风味酶粉末溶解后测出的蛋白含量进行比酶活的换算

b:通用条件

c:Amp0279的优化条件

在经过大肠杆菌BL21验证的基础上，考虑到大肠杆菌表达系统需要复杂耗时且增加成本的纯化和去除标签的流程，本发明进一步开发氨肽酶Amp0279的分泌表达系统。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种很有潜力的外源蛋白表达宿主，其表达系统有几个优势：(1)外源蛋白可分泌到胞外且作为最主要的蛋白成分存在于培养基上清中，因而可简化下游蛋白质纯化的过程；(2)细胞外培养液的氧化环境适宜二硫键的形成，从而进一步促进蛋白质折叠和活性蛋白形式的表达；(3)细胞外蛋白酶含量低，从而提高了分泌蛋白的稳定性和产量；(4)不产生内毒素。谷氨酸棒状杆菌也是一个GRAS菌株，除作为氨基酸和有机酸等物质的生产菌株以外，还可用于微生物酶的生产。因此有利于进一步获得更为优良的重组质粒和重组菌株。

谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2021年9月29日，保藏编号为：CCTCC NO：M20211238，分类学命名Corynebacterium glutamicum。

重组质粒和重组谷氨酸棒状杆菌的构建、Amp0279分泌表达情况及表达产物氨肽酶Amp0279的粗酶活检测如下：

pXMJ19-5.7-amp0279组成型重组质粒的构建：

以C.glutamicum CGMCC1.15647基因组为模板，使用引物对

cspB2F(TCCCACTACCGAGATATCCTTGAATAATAATTGCACCGCACAGGTGATACATG)/cspR_A-6(TTCTTCAAACGTCATAGTGGTTTCCTGAGCGAATGCTG)

扩增cspB2基因的启动子和信号肽序列，使用引物对

Cg_6-F(GCTCAGGAAACCACTATGACGTTTGAAGAAAAATTAC)/Cg_6-R(AAAACAGCCAAGCTGAATTCTTAGAAAGCCCAGCTACCT)从C3-41基因组中扩增amp0279基因序列，用in-fusion、overlap的方法将内源性的表达原件cspB2和氨肽酶基因amp0279连接后，再将目的基因插入pXMJ19的EcoRⅠ/EcoRⅤ线性化载体中。连接产物转化大肠杆菌JM109。PCR筛选阳性克隆子，提取质粒进一步测序验证。获得的重组表达质粒为pXMJ19-5.7-amp0279。其核酸序列为SEQ ID NO:4所示。

将重组表达质粒pXMJ19-5.7-amp0279转化谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647感受态细胞，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株。得到的产氨肽酶Amp0279的基因工程菌株CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)所分泌表达的氨肽酶直接检测酶活。

具体实施例为：

实施例6：含有amp0279基因的重组表达质粒pXMJ19-5.7-amp0279的构建

根据球形赖氨酸芽胞杆菌C3-41的基因组序列(CP000817)预测的amp0279(300199..301428)基因序列设计带有overlap接头的引物，将该片段从基因组中扩增出来，并纯化，得到氨肽酶编码基因amp0279片段；以C.glutamicum CGMCC1.15647基因组为模板，扩增含有overlap接头的cspB2基因的启动子和信号肽序列。采用限制性内切酶EcoRI和EcoRⅤ完成分泌型表达载体pXMJ19的双酶切。用in-fusion连接酶构建组成型表达质粒pXMJ19-5.7-amp0279。将该重组表达质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株JM109(pXMJ19-5.7-amp0279)。大肠杆菌的培养温度为37℃，氯霉素浓度25μg/mL。

实施例7：含有氨肽酶Amp0279基因的重组表达菌株CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)的构建

采用LB液体培养基活化培养实施例6的菌株JM109(pXMJ19-5.7-amp0279)，提取重组质粒pXMJ19-5.7-amp0279。谷氨酸棒状杆菌感受态的制备方法为现有方法。将谷氨酸棒状杆菌感受态细胞放在冰上融化，将约1μg质粒加入到感受态细胞中并混匀，冰浴，将电转仪电压调至2.5KV，时间为4.5-5ms，电击1次；加入1mL 46℃预热的LBHIS液体培养基至电转杯中，混匀后将混合物转移至EP管中，46℃准确孵育6min；在30℃，110rpm条件下孵育1.5h；7000g条件下离心2min；取100-150μL残液吹打沉淀菌体涂布到带有氯霉素的固体LBHIS培养基中，30℃，培养约36h长出转化子。谷氨酸棒状杆菌培养温度为30℃，氯霉素浓度为10μg/mL。

实施例8：检测Amp0279在重组菌株CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)中分泌表达情况

将谷氨酸棒状杆菌菌株接种到LB液体培养基中，培养过夜后按1∶10的比例转接于新鲜的50mL培养基中，培养至32h。取菌液1mL，12000g/min离心10min，分别收集发酵液上清和菌体。菌体Tris-HCL洗涤2遍后冰上超声波破碎。破碎后的上清、沉淀和发酵液上清都通过SDS-PAGE来检测。使用从BL21(pET28-amp0279-BL21)表达并纯化的Amp0279蛋白免疫小鼠产生的抗血清，通过Western Blot来分析Amp0279的表达。结果显示，CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)培养基上清中能检测到明显的表达杂交信号(图10)。图中M：Prestained Protein Ladder 26616；+：从BL21(pET28-amp0279-BL21)表达并纯化的Amp0279蛋白；1和2为CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7)和CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)培养基上清；3和4为CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7)和CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)超声破碎离心后上清液；5和6分别为CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7)和CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)超声破碎和离心后的细胞碎片。

实施例9：检测重组菌CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)细菌培养基上清酶活

用对硝基苯胺法检测氨肽酶酶活，所用底物为Leu-pNA。取细菌培养液离心，测菌体沉淀湿重，同时收集上清，进行酶活检测。将1mM底物Leu-pNA，100μM Co²⁺，200μL的上清液和反应缓冲液配成800μl反应液，置于50℃，pH 8.0条件1h后，加入200μL 40％(v/v)的冰醋酸终止反应，检测405nm波长时的吸光度，来指示底物水解情况和酶水解底物的能力。定义单位μM/g为每克细菌湿重水解Leu-pNA的μM值。结果显示，无需浓缩和纯化，从重组菌的培养上清液中可以检测到酶的活性(反应体系每g细胞湿重的培养液释放pNA量为20-40μM)(图11)，图中白色柱是谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum CGMCC1.15647(pXMJ19-5.7-amp0279)分泌表达的Amp0279粗酶活检测。

还需要说明的是pXMJ19-5.7-amp0279的序列SEQ ID NO:4中，靠前的斜体字部分是信号肽和启动子序列，中间大写字体部分是amp0279序列，后面的小写字体部分是pXMJ19-5.7载体序列。

atAatCgcaccgcacaggtgatacatacttacctcctcaagtagtccgaggttaagtgtgttttaggtgaacaaatttcagtttcaggtagaaaactttcgacccgcttcagagtttctattagtaaatctgacaccacttgattaaatggtctacccccgaattgggggatgggttattttttgctatgaacgtagttttggtgcatatgacctgcgtttataaagaaatataaacgtgatcagatcgatataaaagaaacagtttgtactcaggtttgaagctttttcttcgattcgcctggcaagaatctcaattgtcgcttacagtttttctcaacgacaggctgctaagctgctagttcggtggcctagtgagtggcgtttacttgaatgaaaagtaatcccatgtcgtgatcagccaatttgggttgtgtcaaagcaattcaaaggtttcatctttcgatatcctattcaaggagaccctcgcctctatgtttaacaatcgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggacttgttgttccagcattcgctcaggaaaccactATGACGTTTGAAGAAAAATTACAGGCATACGCGGAACTTGCAGTAAAAGTTGGGGTAAACATTCAACCAGGTCAATATTTGTTAGTCAACACATCAGTTGAGGCTTTAGATTTTGCTCGTTTAGTCGTTAAAGAGGCGTATAAGGCTGGGGCAGGGCGTGTCCATGTTAATTTTTCTGACGATGAAATGGATCGTGCCTATTTTGAACATGCCTCTGATGAAGAATTTAACCGTTTCCCCGAATGGGTCGTACAAATGCGTGATGAACTCATTGAACGTAAAGGGGCATTATTATGGATAGATGCCGCAGATCCTGATAAATTAACAGGAATCTCGGCTGATCGATTAGCTACTCATCAAAAGGTATCAGGAGCTGCGTTGAAAAACTATCGTAATGCAGTTATGAAGGATTTGATTGCGTGGTCCATTATTGCAGTACCTTCGCCAAAGTGGGCGGCAAAGGTATTCCCTCAATTGACAGCAGACGAGCAAGTACCTGCTTTATGGGAAGCTATCTTTAAAACAGTTCATATCGGAGAAGGTAACGCAGTTGAAAATTGGCATCAGCATGTAACGAATTTAGAATCTCGGGCAGAACTTTTAAATAATAAAAAGTATGCGAAGCTACACTATACTGCACCTGGAACAGATTTAACGATTGCTTTAGCTCCACAGCATAAATGGGTAACTGGTGGCAGTAAAACGCCTGAAGGCCATGTTTTTATCGCCAATATGCCAACAGAAGAAGTCTATACACTTCCTATGAAGCAAGGTGTAGACGGTTATGTTAGTAATTCAAAGCCTTTAGTATATCAGGGCAATATCATTGATGGCTTTAAATTAACATTTAAAGAAGGAAAAATCATTAAAGCAGAAGCTGAAGTAGGTCAAGATTTACTACAGGAGCTTATTCAAGTAGATGAGGGTTCTAGTTATTTAGGTGAAGTAGCACTTGTCCCGCATGAGTCACCAATTTCAGCATCAGGGATTTTATACTTTAATACACTATTCGATGAGAATGCTTCGAACCATTTAGCGATTGGAGAAGCATACCCGACATGCTTAGAGGGTGGTAGAGACTTGGAAAACGGTCAACTAGAAGCATTAGGTGCGAATATTTCTGTAACCCATGAAGACTTTATGGTTGGTAACGGTGAAATGGACATTGATGGTATATTACCAGATGGAACTATAGAGCCTATATTCCGTAAAGGTAGCTGGGCTTTCTAAaattcagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccattcggggtcgttcactggttcccctttctgatttctggcatagaagaacccccgtgaactgtgtggttccgggggttgctgatttttgcgagacttctcgcgcaattccctagcttaggtgaaaacaccatgaaacactagggaaacacccatgaaacacccattagggcagtagggcggcttcttcgtctagggcttgcatttgggcggtgatctggtctttagcgtgtgaaagtgtgtcgtaggtggcgtgctcaatgcactcgaacgtcacgtcatttaccgggtcacggtgggcaaagagaactagtgggttagacattgttttcctcgttgtcggtggtggtgagcttttctagccgctcggtaaacgcggcgatcatgaactcttggaggttttcaccgttctgcatgcctgcgcgcttcatgtcctcacgtagtgccaaaggaacgcgtgcggtgaccacgacgggcttagcctttgcctgcgcttctagtgcttcgatggtggcttgtgcctgcgcttgctgcgcctgtagtgcctgttgagcttcttgtagttgctgttctagctgtgccttggttgccatgctttaagactctagtagctttcctgcgatatgtcatgcgcatgcgtagcaaacattgtcctgcaactcattcattatgtgcagtgctcctgttactagtcgtacatactcatatttacctagtctgcatgcagtgcatgcacatgcagtcatgtcgtgctaatgtgtaaaacatgtacatgcagattgctgggggtgcagggggcggagccaccctgtccatgcggggtgtggggcttgccccgccggtacagacagtgagcaccggggcacctagtcgcggataccccccctaggtatcggacacgtaaccctcccatgtcgatgcaaatctttaacattgagtacgggtaagctggcacgcatagccaagctaggcggccaccaaacaccactaaaaattaatagtccctagacaagacaaacccccgtgcgagctaccaactcatatgcacgggggccacataacccgaaggggtttcaattgacaaccatagcactagctaagacaacgggcacaacacccgcacaaactcgcactgcgcaaccccgcacaacatcgggtctaggtaacactgagtaacactgaaatagaagtgaacacctctaaggaaccgcaggtcaatgagggttctaaggtcactcgcgctagggcgtggcgtaggcaaaacgtcatgtacaagatcaccaatagtaaggctctggcggggtgccataggtggcgcagggacgaagctgttgcggtgtcctggtcgtctaacggtgcttcgcagtttgagggtctgcaaaactctcactctcgctgggggtcacctctggctgaattggaagtcatgggcgaacgccgcattgagctggctattgctactaagaatcacttggcggcgggtggcgcgctcatgatgtttgtgggcactgttcgacacaaccgctcacagtcatttgcgcaggttgaagcgggtattaagactgcgtactcttcgatggtgaaaacatctcagtggaagaaagaacgtgcacggtacggggtggagcacacctatagtgactatgaggtcacagactcttgggcgaacggttggcacttgcaccgcaacatgctgttgttcttggatcgtccactgtctgacgatgaactcaaggcgtttgaggattccatgttttcccgctggtctgctggtgtggttaaggccggtatggacgcgccactgcgtgagcacggggtcaaacttgatcaggtgtctacctggggtggagacgctgcgaaaatggcaacctacctcgctaagggcatgtctcaggaactgactggctccgctactaaaaccgcgtctaaggggtcgtacacgccgtttcagatgttggatatgttggccgatcaaagcgacgccggcgaggatatggacgctgttttggtggctcggtggcgtgagtatgaggttggttctaaaaacctgcgttcgtcctggtcacgtggggctaagcgtgctttgggcattgattacatagacgctgatgtacgtcgtgaaatggaagaagaactgtacaagctcgccggtctggaagcaccggaacgggtcgaatcaacccgcgttgctgttgctttggtgaagcccgatgattggaaactgattcagtctgatttcgcggttaggcagtacgttctcgattgcgtggataaggctaaggacgtggccgctgcgcaacgtgtcgctaatgaggtgctggcaagtctgggtgtggattccaccccgtgcatgatcgttatggatgatgtggacttggacgcggttctgcctactcatggggacgctactaagcgtgatctgaatgcggcggtgttcgcgggtaatgagcagactattcttcgcacccactaaaagcggcataaaccccgttcgatattttgtgcgatgaatttatggtcaatgtcgcgggggcaaactatgatgggtcttgttgttggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaactccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgtcgaagctcggcggatttgtcctactcaagctgatccgacaaaatccacacattatcccaggtgtccggatcggtcaaatacgctgccagctcatagaccgtatccaaagcatccggggctgatccccggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgtggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagat

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 一种包含氨肽酶Amp0279编码序列的重组质粒、重组谷氨酸棒状杆菌及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacgtttg aagaaaaatt acaggcatac gcggaacttg cagtaaaagt tggggtaaac 60

attcaaccag gtcaatattt gttagtcaac acatcagttg aggctttaga ttttgctcgt 120

ttagtcgtta aagaggcgta taaggctggg gcagggcgtg tccatgttaa tttttctgac 180

gatgaaatgg atcgtgccta ttttgaacat gcctctgatg aagaatttaa ccgtttcccc 240

gaatgggtcg tacaaatgcg tgatgaactc attgaacgta aaggggcatt attatggata 300

gatgccgcag atcctgataa attaacagga atctcggctg atcgattagc tactcatcaa 360

aaggtatcag gagctgcgtt gaaaaactat cgtaatgcag ttatgaagga tttgattgcg 420

tggtccatta ttgcagtacc ttcgccaaag tgggcggcaa aggtattccc tcaattgaca 480

gcagacgagc aagtacctgc tttatgggaa gctatcttta aaacagttca tatcggagaa 540

ggtaacgcag ttgaaaattg gcatcagcat gtaacgaatt tagaatctcg ggcagaactt 600

ttaaataata aaaagtatgc gaagctacac tatactgcac ctggaacaga tttaacgatt 660

gctttagctc cacagcataa atgggtaact ggtggcagta aaacgcctga aggccatgtt 720

tttatcgcca atatgccaac agaagaagtc tatacacttc ctatgaagca aggtgtagac 780

ggttatgtta gtaattcaaa gcctttagta tatcagggca atatcattga tggctttaaa 840

ttaacattta aagaaggaaa aatcattaaa gcagaagctg aagtaggtca agatttacta 900

caggagctta ttcaagtaga tgagggttct agttatttag gtgaagtagc acttgtcccg 960

catgagtcac caatttcagc atcagggatt ttatacttta atacactatt cgatgagaat 1020

gcttcgaacc atttagcgat tggagaagca tacccgacat gcttagaggg tggtagagac 1080

ttggaaaacg gtcaactaga agcattaggt gcgaatattt ctgtaaccca tgaagacttt 1140

atggttggta acggtgaaat ggacattgat ggtatattac cagatggaac tatagagcct 1200

atattccgta aaggtagctg ggctttctaa 1230

<210> 2

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Phe Glu Glu Lys Leu Gln Ala Tyr Ala Glu Leu Ala Val Lys

1 5 10 15

Val Gly Val Asn Ile Gln Pro Gly Gln Tyr Leu Leu Val Asn Thr Ser

20 25 30

Val Glu Ala Leu Asp Phe Ala Arg Leu Val Val Lys Glu Ala Tyr Lys

35 40 45

Ala Gly Ala Gly Arg Val His Val Asn Phe Ser Asp Asp Glu Met Asp

50 55 60

Arg Ala Tyr Phe Glu His Ala Ser Asp Glu Glu Phe Asn Arg Phe Pro

65 70 75 80

Glu Trp Val Val Gln Met Arg Asp Glu Leu Ile Glu Arg Lys Gly Ala

85 90 95

Leu Leu Trp Ile Asp Ala Ala Asp Pro Asp Lys Leu Thr Gly Ile Ser

100 105 110

Ala Asp Arg Leu Ala Thr His Gln Lys Val Ser Gly Ala Ala Leu Lys

115 120 125

Asn Tyr Arg Asn Ala Val Met Lys Asp Leu Ile Ala Trp Ser Ile Ile

130 135 140

Ala Val Pro Ser Pro Lys Trp Ala Ala Lys Val Phe Pro Gln Leu Thr

145 150 155 160

Ala Asp Glu Gln Val Pro Ala Leu Trp Glu Ala Ile Phe Lys Thr Val

165 170 175

His Ile Gly Glu Gly Asn Ala Val Glu Asn Trp His Gln His Val Thr

180 185 190

Asn Leu Glu Ser Arg Ala Glu Leu Leu Asn Asn Lys Lys Tyr Ala Lys

195 200 205

Leu His Tyr Thr Ala Pro Gly Thr Asp Leu Thr Ile Ala Leu Ala Pro

210 215 220

Gln His Lys Trp Val Thr Gly Gly Ser Lys Thr Pro Glu Gly His Val

225 230 235 240

Phe Ile Ala Asn Met Pro Thr Glu Glu Val Tyr Thr Leu Pro Met Lys

245 250 255

Gln Gly Val Asp Gly Tyr Val Ser Asn Ser Lys Pro Leu Val Tyr Gln

260 265 270

Gly Asn Ile Ile Asp Gly Phe Lys Leu Thr Phe Lys Glu Gly Lys Ile

275 280 285

Ile Lys Ala Glu Ala Glu Val Gly Gln Asp Leu Leu Gln Glu Leu Ile

290 295 300

Gln Val Asp Glu Gly Ser Ser Tyr Leu Gly Glu Val Ala Leu Val Pro

305 310 315 320

His Glu Ser Pro Ile Ser Ala Ser Gly Ile Leu Tyr Phe Asn Thr Leu

325 330 335

Phe Asp Glu Asn Ala Ser Asn His Leu Ala Ile Gly Glu Ala Tyr Pro

340 345 350

Thr Cys Leu Glu Gly Gly Arg Asp Leu Glu Asn Gly Gln Leu Glu Ala

355 360 365

Leu Gly Ala Asn Ile Ser Val Thr His Glu Asp Phe Met Val Gly Asn

370 375 380

Gly Glu Met Asp Ile Asp Gly Ile Leu Pro Asp Gly Thr Ile Glu Pro

385 390 395 400

Ile Phe Arg Lys Gly Ser Trp Ala Phe

405

<210> 3

<211> 6593

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160

ggtcgcggat ccatgacgtt tgaagaaaaa ttacaggcat acgcggaact tgcagtaaaa 5220

gttggggtaa acattcaacc aggtcaatat ttgttagtca acacatcagt tgaggcttta 5280

gattttgctc gtttagtcgt taaagaggcg tataaggctg gggcagggcg tgtccatgtt 5340

aatttttctg acgatgaaat ggatcgtgcc tattttgaac atgcctctga tgaagaattt 5400

aaccgtttcc ccgaatgggt cgtacaaatg cgtgatgaac tcattgaacg taaaggggca 5460

ttattatgga tagatgccgc agatcctgat aaattaacag gaatctcggc tgatcgatta 5520

gctactcatc aaaaggtatc aggagctgcg ttgaaaaact atcgtaatgc agttatgaag 5580

gatttgattg cgtggtccat tattgcagta ccttcgccaa agtgggcggc aaaggtattc 5640

cctcaattga cagcagacga gcaagtacct gctttatggg aagctatctt taaaacagtt 5700

catatcggag aaggtaacgc agttgaaaat tggcatcagc atgtaacgaa tttagaatct 5760

cgggcagaac ttttaaataa taaaaagtat gcgaagctac actatactgc acctggaaca 5820

gatttaacga ttgctttagc tccacagcat aaatgggtaa ctggtggcag taaaacgcct 5880

gaaggccatg tttttatcgc caatatgcca acagaagaag tctatacact tcctatgaag 5940

caaggtgtag acggttatgt tagtaattca aagcctttag tatatcaggg caatatcatt 6000

gatggcttta aattaacatt taaagaagga aaaatcatta aagcagaagc tgaagtaggt 6060

caagatttac tacaggagct tattcaagta gatgagggtt ctagttattt aggtgaagta 6120

gcacttgtcc cgcatgagtc accaatttca gcatcaggga ttttatactt taatacacta 6180

ttcgatgaga atgcttcgaa ccatttagcg attggagaag catacccgac atgcttagag 6240

ggtggtagag acttggaaaa cggtcaacta gaagcattag gtgcgaatat ttctgtaacc 6300

catgaagact ttatggttgg taacggtgaa atggacattg atggtatatt accagatgga 6360

actatagagc ctatattccg taaaggtagc tgggctttct aagagctccg tcgacaagct 6420

tgcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg 6480

aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc 6540

ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gat 6593

<210> 4

<211> 7188

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataatcgcac cgcacaggtg atacatactt acctcctcaa gtagtccgag gttaagtgtg 60

ttttaggtga acaaatttca gtttcaggta gaaaactttc gacccgcttc agagtttcta 120

ttagtaaatc tgacaccact tgattaaatg gtctaccccc gaattggggg atgggttatt 180

ttttgctatg aacgtagttt tggtgcatat gacctgcgtt tataaagaaa tataaacgtg 240

atcagatcga tataaaagaa acagtttgta ctcaggtttg aagctttttc ttcgattcgc 300

ctggcaagaa tctcaattgt cgcttacagt ttttctcaac gacaggctgc taagctgcta 360

gttcggtggc ctagtgagtg gcgtttactt gaatgaaaag taatcccatg tcgtgatcag 420

ccaatttggg ttgtgtcaaa gcaattcaaa ggtttcatct ttcgatatcc tattcaagga 480

gaccctcgcc tctatgttta acaatcgtat ccgcactgca gctctcgctg gtgcaatcgc 540

aatctccacc gcagcttccg gacttgttgt tccagcattc gctcaggaaa ccactatgac 600

gtttgaagaa aaattacagg catacgcgga acttgcagta aaagttgggg taaacattca 660

accaggtcaa tatttgttag tcaacacatc agttgaggct ttagattttg ctcgtttagt 720

cgttaaagag gcgtataagg ctggggcagg gcgtgtccat gttaattttt ctgacgatga 780

aatggatcgt gcctattttg aacatgcctc tgatgaagaa tttaaccgtt tccccgaatg 840

ggtcgtacaa atgcgtgatg aactcattga acgtaaaggg gcattattat ggatagatgc 900

cgcagatcct gataaattaa caggaatctc ggctgatcga ttagctactc atcaaaaggt 960

atcaggagct gcgttgaaaa actatcgtaa tgcagttatg aaggatttga ttgcgtggtc 1020

cattattgca gtaccttcgc caaagtgggc ggcaaaggta ttccctcaat tgacagcaga 1080

cgagcaagta cctgctttat gggaagctat ctttaaaaca gttcatatcg gagaaggtaa 1140

cgcagttgaa aattggcatc agcatgtaac gaatttagaa tctcgggcag aacttttaaa 1200

taataaaaag tatgcgaagc tacactatac tgcacctgga acagatttaa cgattgcttt 1260

agctccacag cataaatggg taactggtgg cagtaaaacg cctgaaggcc atgtttttat 1320

cgccaatatg ccaacagaag aagtctatac acttcctatg aagcaaggtg tagacggtta 1380

tgttagtaat tcaaagcctt tagtatatca gggcaatatc attgatggct ttaaattaac 1440

atttaaagaa ggaaaaatca ttaaagcaga agctgaagta ggtcaagatt tactacagga 1500

gcttattcaa gtagatgagg gttctagtta tttaggtgaa gtagcacttg tcccgcatga 1560

gtcaccaatt tcagcatcag ggattttata ctttaataca ctattcgatg agaatgcttc 1620

gaaccattta gcgattggag aagcataccc gacatgctta gagggtggta gagacttgga 1680

aaacggtcaa ctagaagcat taggtgcgaa tatttctgta acccatgaag actttatggt 1740

tggtaacggt gaaatggaca ttgatggtat attaccagat ggaactatag agcctatatt 1800

ccgtaaaggt agctgggctt tctaaaattc agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga 1860

ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc 1920

ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc 1980

gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa 2040

ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 2100

aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg 2160

cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag 2220

gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc ttttgtttat ttttctaaat 2280

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 2340

aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 2400

attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 2460

tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 2520

gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttgcttcct cgctcactga 2580

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 2640

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 2700

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 2760

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 2820

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 2880

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc 2940

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 3000

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 3060

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 3120

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 3180

gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 3240

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 3300

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 3360

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 3420

cttcacctag atccttttgg ggtgggcgaa gaactccagc atgagatccc cgcgctggag 3480

gatcatccag ccattcgggg tcgttcactg gttccccttt ctgatttctg gcatagaaga 3540

acccccgtga actgtgtggt tccgggggtt gctgattttt gcgagacttc tcgcgcaatt 3600

ccctagctta ggtgaaaaca ccatgaaaca ctagggaaac acccatgaaa cacccattag 3660

ggcagtaggg cggcttcttc gtctagggct tgcatttggg cggtgatctg gtctttagcg 3720

tgtgaaagtg tgtcgtaggt ggcgtgctca atgcactcga acgtcacgtc atttaccggg 3780

tcacggtggg caaagagaac tagtgggtta gacattgttt tcctcgttgt cggtggtggt 3840

gagcttttct agccgctcgg taaacgcggc gatcatgaac tcttggaggt tttcaccgtt 3900

ctgcatgcct gcgcgcttca tgtcctcacg tagtgccaaa ggaacgcgtg cggtgaccac 3960

gacgggctta gcctttgcct gcgcttctag tgcttcgatg gtggcttgtg cctgcgcttg 4020

ctgcgcctgt agtgcctgtt gagcttcttg tagttgctgt tctagctgtg ccttggttgc 4080

catgctttaa gactctagta gctttcctgc gatatgtcat gcgcatgcgt agcaaacatt 4140

gtcctgcaac tcattcatta tgtgcagtgc tcctgttact agtcgtacat actcatattt 4200

acctagtctg catgcagtgc atgcacatgc agtcatgtcg tgctaatgtg taaaacatgt 4260

acatgcagat tgctgggggt gcagggggcg gagccaccct gtccatgcgg ggtgtggggc 4320

ttgccccgcc ggtacagaca gtgagcaccg gggcacctag tcgcggatac cccccctagg 4380

tatcggacac gtaaccctcc catgtcgatg caaatcttta acattgagta cgggtaagct 4440

ggcacgcata gccaagctag gcggccacca aacaccacta aaaattaata gtccctagac 4500

aagacaaacc cccgtgcgag ctaccaactc atatgcacgg gggccacata acccgaaggg 4560

gtttcaattg acaaccatag cactagctaa gacaacgggc acaacacccg cacaaactcg 4620

cactgcgcaa ccccgcacaa catcgggtct aggtaacact gagtaacact gaaatagaag 4680

tgaacacctc taaggaaccg caggtcaatg agggttctaa ggtcactcgc gctagggcgt 4740

ggcgtaggca aaacgtcatg tacaagatca ccaatagtaa ggctctggcg gggtgccata 4800

ggtggcgcag ggacgaagct gttgcggtgt cctggtcgtc taacggtgct tcgcagtttg 4860

agggtctgca aaactctcac tctcgctggg ggtcacctct ggctgaattg gaagtcatgg 4920

gcgaacgccg cattgagctg gctattgcta ctaagaatca cttggcggcg ggtggcgcgc 4980

tcatgatgtt tgtgggcact gttcgacaca accgctcaca gtcatttgcg caggttgaag 5040

cgggtattaa gactgcgtac tcttcgatgg tgaaaacatc tcagtggaag aaagaacgtg 5100

cacggtacgg ggtggagcac acctatagtg actatgaggt cacagactct tgggcgaacg 5160

gttggcactt gcaccgcaac atgctgttgt tcttggatcg tccactgtct gacgatgaac 5220

tcaaggcgtt tgaggattcc atgttttccc gctggtctgc tggtgtggtt aaggccggta 5280

tggacgcgcc actgcgtgag cacggggtca aacttgatca ggtgtctacc tggggtggag 5340

acgctgcgaa aatggcaacc tacctcgcta agggcatgtc tcaggaactg actggctccg 5400

ctactaaaac cgcgtctaag gggtcgtaca cgccgtttca gatgttggat atgttggccg 5460

atcaaagcga cgccggcgag gatatggacg ctgttttggt ggctcggtgg cgtgagtatg 5520

aggttggttc taaaaacctg cgttcgtcct ggtcacgtgg ggctaagcgt gctttgggca 5580

ttgattacat agacgctgat gtacgtcgtg aaatggaaga agaactgtac aagctcgccg 5640

gtctggaagc accggaacgg gtcgaatcaa cccgcgttgc tgttgctttg gtgaagcccg 5700

atgattggaa actgattcag tctgatttcg cggttaggca gtacgttctc gattgcgtgg 5760

ataaggctaa ggacgtggcc gctgcgcaac gtgtcgctaa tgaggtgctg gcaagtctgg 5820

gtgtggattc caccccgtgc atgatcgtta tggatgatgt ggacttggac gcggttctgc 5880

ctactcatgg ggacgctact aagcgtgatc tgaatgcggc ggtgttcgcg ggtaatgagc 5940

agactattct tcgcacccac taaaagcggc ataaaccccg ttcgatattt tgtgcgatga 6000

atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct tgttgttggc gtcccggaaa 6060

acgattccga agcccaacct ttcatagaag gcggcggtgg aatcgaaatc tcgtgatggc 6120

aggttgggcg tcgcttggtc ggtcatttcg aagggcacca ataactgcct taaaaaaatt 6180

acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat 6240

ggaagccatc acagacggca tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc 6300

cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca 6360

cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa aacatattct 6420

caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat 6480

atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt 6540

cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc accagctcac 6600

cgtctttcat tgccatacgg aactccggat gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa 6660

taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat 6720

ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt 6780

ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt ttctccattt 6840

tagcttcctt agctcctgaa aatctcgtcg aagctcggcg gatttgtcct actcaagctg 6900

atccgacaaa atccacacat tatcccaggt gtccggatcg gtcaaatacg ctgccagctc 6960

atagaccgta tccaaagcat ccggggctga tccccggcgc cagggtggtt tttcttttca 7020

ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca 7080

agcggtccac gtggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg 7140

gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagat 7188