CN110699398A - 一种静息细胞转化植物甾醇制备a环降解物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种静息细胞转化植物甾醇制备A环降解物的方法，属于甾族化合物制备技术领域。发明内容包括种子培养、静息细胞转化、分离提取、精制步骤。本发明以植物甾醇为原料生产A环降解物，原料易得，降低了生产成本；相对于常规的转化A环降解物的方法，本发明的静息细胞转化植物甾醇制备A环降解物的方法，归一含量高，转化时间短，造成的污染小，在实际生产中，能节约生产成品，提高经济效益。
Description
技术领域
本发明属于甾族化合物制备技术领域，具体涉及一种静息细胞转化植物甾醇制备A环降解物的方法。
背景技术
近代，有关使用微生物法转化植物甾醇制备甾体中间体的研究成果被广泛报道和研究，相关报道最早可追溯到1937年，Mamoli和Vercellone在他们发表的两篇专利Ber.70470和Ber.702079中，公开了通过酵母发酵将17-酮-类固醇还原成17-β-羟类固醇。此后，peterson和Murray在美国专利N0.2602769中公开一种用根霉属真菌产生孕酮的11-a-羟化方法。1972年，Kraychy等在美国专利N0.3684657中公开了用MycobacteriumSP.NRRL B-3683降解17位脂肪链制备4-AD，ADD的方法。1973年，Marsheck等在美国专利N0.3759791中公开了用Mycobacterium SP.NRRL B-3805，以胆甾烷等17位有8个以上碳原子的甾体原料制备4-AD。
A环降解物是合成雌酚酮和***及其衍生物的重要中间体，但转化过程中甾核A环、B环开环，非常容易降解，产品难以积累，从而难以达到产业化标准。A环降解物在国内目前主要利用微生物在油相中转化植物甾醇生产，例如专利号为CN104404099A的专利公开了一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法，在发酵转化中用到大豆油，提取困难，废油难以处理且环境影响大。
菌株偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)NK-XHX-103记载在专利号为CN103756940 A的文献中，一般只用来将植物甾醇转化为δ-内酯，目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高δ-内酯的收率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是一种静息细胞转化植物甾醇制备A环降解物的方法，可以减少废油产生和转化时间，提高A环降解物的产率和纯度。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
本发明提供一种静息细胞转化植物甾醇制备A环降解物的方法，包括以下步骤：
(1)静息细胞转化：将偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)NK-XHX-103菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，过滤分离后对所述植物甾醇进行发酵转化，对所述植物甾醇进行发酵转化，得到发酵产物；
(2)分离提取：转化完成后进行过滤，滤液酸化后用氯仿提取分层，水层用氯仿萃取2-3次，氯仿减压浓缩，得到A环降解物粗品；
(3)精制：所述A环降解物粗品进行精制提纯，得到A环降解物产品。
优选地，步骤(1)中NK-XHX-103菌种种子培养的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L；pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30分钟；
(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，接种后，30℃，200rpm摇床培养48h；
(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30分钟；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；
(4)种子罐培养：将二级种子液按体积比10％接种至种子罐中；接种后，于30℃，200rpm，空气流量0.5VVM，罐压0.05MPa下培养48h-72h。
优选地，偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)NK-XHX-103的保藏编号是CCTCC M2013543。
优选地，步骤(1)中种子培养完成后将种子菌液进行过滤，滤饼用pH＝8.0的20mM的磷酸盐缓冲液淋洗并抽滤干。
优选地，步骤(1)所述的发酵基础培养基的配方：植物甾醇10-100g/L，羟丙基环糊精10-400g/L，菌20-200g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)；
优选地，所述植物甾醇粉碎至200目。
优选地，步骤(2)所述的提取方法具体为：将转化完的菌液进行抽滤或离心，去除其中的菌体，滤液加入20％硫酸调pH至2.0，搅拌30分钟；加入20％体积的氯仿，搅拌萃取30分钟，静置8h以上，分层；下层氯仿层分出减压浓缩至干；上层水层加入发酵液20％体积的氯仿再重复萃取2次，得到的氯仿层合并，继续减压浓缩；将浓缩得到的物质加入4V(相对于底物量)甲苯升温至60℃减压浓缩至小体积，降温至0-4℃过滤，滤饼用少量甲苯淋洗。
优选地，所述步骤(3)精制方法具体为：将提取得到的粗品，加入甲醇2V(相对于底物量)，活性炭0.05W，升温60℃搅拌脱色2h，过滤，并用少量甲醇洗碳；在60℃减压浓缩至干，加少量水带干残余的甲醇，加入4V甲苯，减压浓缩，带出其中的水分并浓缩至1V左右，冷却至0-4℃，养晶2h，抽滤并淋洗，70℃烘干。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的静息细胞转化植物甾醇制备A环降解物的方法转化时间短，产品收率和归一含量高，实现无油转化，造成的污染小，经济效益好，更适合产业化生产。
(2)本发明采用静息细胞转化法，反应路线更短，省掉了许多反应步骤和后处理步骤，有利于反应收率的提高，减少中间损耗。本发明的制备方法还能减少化学试剂的使用，有利于环境保护。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的物质均可自常规途径购买得到。保藏编号为CCTCCM2013543的偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)NK-XHX-103保藏于中国典型培养物保藏中心。
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1偶发分枝杆菌种子培养
菌种：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)NK-XHX-103
1、斜面培养
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0。
121℃灭菌30分钟。凝固成型后，在无菌条件下接种。
接种后，30℃培养4天，入4℃冰箱保存，保存时间不超过1个月。
2、摇瓶转化
(1)一级种子培养
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0；121℃灭菌30分钟，冷却至室温。
在无菌条件下接种，接种量：每100毫升刮取1环斜面菌体。接种后，30℃，200rpm摇床培养48h。
(2)二级种子培养
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0。121℃灭菌30分钟。冷却至室温。
在无菌条件下接种，接种量：10％。接种后，30℃，200rpm摇床培养48h。
3、50升罐种子培养
将二级种子液按体积比10％接种至50升罐，接种后体积为30升。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5VVM，罐压0.05MPa，培养时间：48h-72h。
实施例2发酵转化
(1)按照实施例1进行种子培养；
(2)种子分离
将培养好的种子过滤，滤饼用pH＝8.0的20mM的磷酸盐缓冲液淋洗并抽滤干。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化培养基配方：植物甾醇：10g/L，羟丙基环糊精：10g/L，偶发分枝杆菌：20g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，转化时间88h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取
将转化完的菌液进行抽滤或离心，去除其中的菌体，滤液加入20％硫酸调pH至2.0，搅拌30分钟；加入1.2升氯仿，搅拌萃取30分钟，静置8h以上，分层；下层氯仿层分出减压浓缩至干；上层水层加入氯仿再重复萃取2次，每次使用1.2升氯仿，得到的氯仿层继续减压浓缩；将浓缩得到的物质加入240毫升甲苯升温至60℃减压浓缩至小体积，降温至0-4℃过滤，滤饼用少量甲苯淋洗，得到A环降解物粗品。
(5)精制
提取得到的A环降解物粗品加入甲醇120毫升，活性炭3克，升温60℃搅拌脱色2h，过滤，并用少量甲醇洗碳；60℃减压浓缩至干，加少量水带干残余的甲醇，加入240毫升甲苯，减压浓缩，带出其中的水分并浓缩至60毫升左右，冷却至0-4℃，养晶2h，抽滤并淋洗，70℃烘干。收白色针状晶体15.2克，归一含量99.11％。
实施例3发酵转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)种子分离
将培养好的种子过滤，滤饼用pH＝8.0的20mM的磷酸盐缓冲液淋洗并抽滤干。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化培养基配方：植物甾醇：20g/L，羟丙基环糊精：40g/L，偶发分枝杆菌：40g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，转化时间104h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例2提取、水解及精制方法进行后处理，除水相提取用的氯仿外，其它试剂用量加倍，减压浓缩体积加倍。收白色针状晶体31.5克，归一含量98.99％。
实施例4发酵转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)种子分离
将培养好的种子过滤，滤饼用pH＝8.0的20mM的磷酸盐缓冲液淋洗并抽滤干。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化培养基配方：植物甾醇40g/L，羟丙基环糊精160g/L，偶发分枝杆菌80g/L，PPE5g/L，余量为20mM PBS；pH＝7.5-8.0。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，转化时间96h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例2提取、水解及精制方法进行后处理，除水相提取用的氯仿外，其它试剂用量为实例2的4倍，减压浓缩体积为实例2的4倍。收白色针状晶体61.1克，归一含量99.42％。
实施例5发酵转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)种子分离
将培养好的种子过滤，滤饼用pH＝8.0的20mM的磷酸盐缓冲液淋洗并抽滤干。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化培养基配方：植物甾醇：80g/L，羟丙基环糊精：320g/L，偶发分枝杆菌：160g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，转化时间128h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例2提取、水解及精制方法进行后处理，除水相提取用的氯仿外，其它试剂用量为实例2的8倍，减压浓缩体积为实例2的8倍。收白色针状晶体117.4克，归一含量99.12％。
实施例6发酵转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)种子分离
将培养好的种子过滤，滤饼用pH＝8.0的20mM的磷酸盐缓冲液淋洗并抽滤干。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化培养基配方：植物甾醇：100g/L，羟丙基环糊精：400g/L，偶发分枝杆菌：200g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，转化时间144h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例2提取、水解及精制方法进行后处理，除水相提取用的氯仿外，其它试剂用量为实例2的8倍，减压浓缩体积为实例2的10倍。收白色针状晶体145.8克，归一含量98.99％。