阅读说明：本技术 一种微生物发酵提取杨梅素的方法 (Method for extracting myricetin by microbial fermentation ) 是由 王明谦 纪东艺 姚恩琪 于 2019-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于天然产物分离技术领域,涉及一种微生物发酵提取杨梅素的方法。所述方法包括以下步骤：1)制备含有黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌悬浮液的共固定化凝胶珠；2)将杨梅素提取原料捣碎,加乙醇回流提取1-5次,滤液合并并浓缩,滤渣干燥；3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物以及1/5-4/5干燥滤渣,40-50℃下发酵提取140-170h；4)发酵结束后,用筛网过滤发酵液,除去共固定化凝胶珠；5)过滤后的发酵液用乙醇回流提取1-5次,合并滤液浓缩,得沉淀物；6)沉淀物反复水洗4～6次,得成品。该提取方法大大提高杨梅素收率和纯度,并且绿色环保安全。(The invention belongs to the technical field of natural product separation, and relates to a method for extracting myricetin by microbial fermentation. The method comprises the following steps: 1) preparing co-immobilized gel beads containing an Aspergillus niger spore suspension and a Lactobacillus suspension; 2) mashing myricetin extraction raw material, adding ethanol, reflux-extracting for 1-5 times, mixing filtrates, concentrating, and drying the residue; 3) adding water into a fermentation tank, adding the co-immobilized gel beads in the step 1), the extract in the step 2) and 1/5-4/5 dried filter residues, and fermenting and extracting at 40-50 ℃ for 140-; 4) after the fermentation is finished, filtering the fermentation liquor by using a screen to remove the co-immobilized gel beads; 5) extracting the filtered fermentation liquor with ethanol under reflux for 1-5 times, mixing filtrates, and concentrating to obtain precipitate; 6) and repeatedly washing the precipitate for 4-6 times to obtain a finished product. The extraction method greatly improves the yield and purity of myricetin, and is green, environment-friendly and safe.)

一种微生物发酵提取杨梅素的方法

技术领域

本发明属于天然产物分离技术领域，涉及一种微生物发酵提取杨梅素的方法。

背景技术

杨梅素[3，5，7-三羟基-2-(3，4，5-三羟基苯基)-4H-1-苯并呋喃-4-酮，Myricetin]又名杨梅树皮素、杨梅黄酮、杨梅酮、杨梅黄素，是一种多羟基黄酮醇化合物，黄色针状结晶，熔点为324.0～325.5℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，微溶于水，难溶于氯仿、石油醚。现代药理学研究表明，杨梅素具有抗炎镇痛、抗肿瘤、降血糖、保肝和抗氧化等多种药理活性，尤其在防治心血管疾病方面作用明显。鉴于其优异的抗氧化功能及降低胆固醇等作用，从植物中提取杨梅素已成为研究热点。

杨梅素广泛分布于杨梅科、葡萄科、豆科、杜鹃花科和大戟科等多科植物中，而其中以杨梅科和葡萄科植物为代表植物。我国的杨梅资源非常丰富，其中非果部位(枝、叶、皮)目前几乎处于闲置和荒废状态，从杨梅植物非果部分中提取杨梅素，对这些非果部分进行有效利用具有良好的生态及经济价值。

杨梅素存在于细胞内含物中，提取方法一般是利用酒精良好的穿透性，将其溶出细胞外。如邓丹雯等人(邓丹雯，杨佩，吕建壵，等.杨梅素提取工艺优化[J].食品与发酵工业，2013(3))研究的利用乙醇从杨梅枝中提取杨梅素的工艺，最佳提取工艺为提取温度84.86℃、乙醇体积分数82.09％、液料比为12.82∶1、提取时间1.5h，在此条件下，杨梅素的提取得率依旧非常低，仅为1.355％。这是因为杨梅枝等植物中存在大量的纤维，细胞壁也是由木质素、纤维素及果胶等成分构成，它们都会影响杨梅素的溶出率，进而降低杨梅素的提取效率；而且杨梅素多以杨梅苷的形式存在于天然植物中，单纯的乙醇提取，并不能将植物中杨梅苷转换为杨梅素，故而杨梅素提取率低。中国专利申请(公开号CN107721963A)公开了一种从杨梅树皮中提取分离杨梅素的方法，利用盐酸、硫酸或者硝酸将提取到的杨梅苷加热水解脱苷形成杨梅素，从而提高最终杨梅素的得率。但是这些强酸都是易污染环境的工业原料，安全性也不高，而且强酸水解杨梅苷后的残留物质很难去除，降低杨梅素纯度。

发明内容

本发明针对现有技术中杨梅素提取工艺的不足，采用微生物发酵提取法代替传统的硫酸或盐酸提取法，提高杨梅素的提取得率和纯度，且提取方法绿色环保无污染。

本发明的一个目的通过以下技术方案来实现：

一种微生物发酵提取杨梅素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备共固定化凝胶珠：将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌悬浮液混合后，加入至海藻酸钠溶液中，采用注射剂将形成的混合液滴入至CaCl₂溶液中，形成共固定化凝胶珠；

2)将杨梅素提取原料捣碎，加乙醇回流提取1-5次，合并滤液加压浓缩或者减压浓缩除去乙醇，得到提取物，滤渣干燥；

3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物以及1/5-4/5干燥滤渣，40-50℃下发酵提取140-170h；

4)发酵结束后，用筛网过滤发酵液，除去共固定化凝胶珠；

5)过滤后的发酵液用乙醇回流提取1-5次，合并滤液减压浓缩除去乙醇，得沉淀物；

6)沉淀物反复水洗4～6次，得成品。

作为优选，所述黑曲霉孢子悬浮液中黑曲霉孢子含量为1×10⁸-1×10¹⁰CFU/ml，所述乳酸杆菌悬浮液中乳酸杆菌含量为1×10⁹-1×10¹¹CFU/ml。

作为优选，所述黑曲霉孢子悬浮液与乳酸杆菌悬浮液以体积比1:(0.8-1.2)混合。

作为优选，所述共固定化凝胶珠的直径为2.5-3mm。

作为优选，所述杨梅素提取原料为杨梅科或葡萄科植物原料。

作为优选，杨梅素提取原料捣碎至30-80目。

作为优选，步骤2)与步骤5)的乙醇提取，乙醇体积分数为70-95％，每次提取时间为1-3h。

作为优选，步骤3)中共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物的质量比为1:8-12。

作为优选，步骤3)的发酵提取温度为48℃。

作为优选，步骤4)所用筛网目数为10-30目。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明采用含有黑曲霉孢子和乳酸杆菌的共固定化凝胶珠发酵杨梅素提取原料，利用纤维二糖酶以及乳酸杆菌的相互协同作用最快及最大程度降解原料纤维素，有利于杨梅素及杨梅苷物质溶解出来；而纤维二糖酶以及乳酸杆菌降解纤维素后的最终产物乳酸将释放出的杨梅苷水解脱苷形成杨梅素，大大提高杨梅素收率及纯度。

2、本发明使用的黑曲霉孢子和乳酸杆菌以凝胶珠形式固定住，很好地控制了两种微生物之间的配比，使得发酵能长期稳定进行，避免了各菌种在发酵进行中发生改变而造成发酵质量降低。

3、本发明采用微生物发酵提取法代替传统的硫酸或盐酸提取法,将杨梅素前期提取必备的硫酸、盐酸等易污染环境的工业原料替换为对环境无污染的微生物原料，绿色环保更安全。

具体实施方式

在下文中，针对本发明的微生物发酵提取杨梅素的方法将详细地描述实施方式，然而，这些实施方式是示例性的，本发明公开内容不限于此。

在本发明的一些实施方式中，一种微生物发酵提取杨梅素的方法包括以下步骤：

1)制备共固定化凝胶珠：将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌悬浮液混合后，加入至海藻酸钠溶液中，采用注射剂将形成的混合液滴入至CaCl₂溶液中，形成共固定化凝胶珠；

2)将杨梅素提取原料捣碎，加乙醇回流提取1-5次，合并滤液加压浓缩或者减压浓缩除去乙醇，得到提取物，滤渣干燥；

3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物以及1/5-4/5干燥滤渣，40-50℃下发酵提取140-170h；

4)发酵结束后，用筛网过滤发酵液，除去共固定化凝胶珠；

5)过滤后的发酵液用乙醇回流提取1-5次，合并滤液减压浓缩除去乙醇，得沉淀物；

6)沉淀物反复水洗4～6次，得成品。

先制备共固定化凝胶珠：黑曲霉菌株在固体斜面培养基中培养5-7，产生大量孢子。将固体斜面培养基用生理盐水洗下，放入事先灭好菌三角瓶中，搅拌打散，过滤，取孢子，然后离心，离心沉淀物再用生理盐水洗两遍，最后用生理盐水重悬，得黑曲霉孢子含量为1×10⁸-1×10¹⁰CFU/ml的黑曲霉孢子悬浮液。将处于对数生长期的乳酸杆菌加生理盐水重悬，得到乳酸杆菌含量为1×10⁹-1×10¹¹CFU/ml的乳酸杆菌悬浮液，乳酸杆菌菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量因此宜采用处于对数生长期的乳酸杆菌。

将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌细胞悬浮液以体积比1:(0.8-1.2)混合后，加入至海藻酸钠溶液中，使海藻酸钠的终浓度为2-5％，将混合液搅拌均匀，并用注射器滴入到0.5-2％的CaCl₂溶液中，CaCl₂溶液处于静止或搅拌状态均可，形成直径为2.5-3mm的共固定化凝胶珠，置于0-6℃冰箱中固化8-15h后保存备用。

杨梅素提取原料可以为杨梅科、葡萄科、豆科、杜鹃花科和大戟科等植物的枝皮叶等，优选为杨梅科或葡萄科植物原料。将杨梅素提取原料捣碎，优选捣碎至30-80目，原料捣碎得越细越有利于有效物质的提取。杨梅素提取原料中加入乙醇进行回流提取1-5次，加入的乙醇与杨梅素提取原料的体积比为(8-10)：1，乙醇和杨梅素提取原料形成的混合物中，乙醇体积分数为70-95％，每次提取时间为1-3h，提取温度为保持溶液沸腾的温度即可。每次提取后都趁热在提取物溶解度大的情况下过200～300目筛，将多次提取后的滤液合并，加压浓缩或者减压浓缩除去乙醇(至无醇味)，得到提取物为固液混合物，过滤后的滤渣干燥除去乙醇。

步骤2)中的提取物以及1/5-4/5干燥滤渣与含有黑曲霉孢子和乳酸杆菌的共固定化凝胶珠加水一起发酵，40-50℃下发酵提取140-170h，共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物质量比为1:8-12。干燥滤渣不宜全部回收与提取物一起发酵，滤渣太多提取后期杂质太多，会降低杨梅素含量，添加1/5-4/5重量的滤渣即可。黑曲霉孢子为高产纤维二糖酶的菌种，随发酵进行，黑曲霉孢子产生的纤维二糖酶分解滤渣中纤维素，最终产物为葡萄糖，当葡萄糖浓度到一定程度时就会对分解反应产生反馈抑制作用，而当在乳酸杆菌存在时，正好能利用葡萄糖产生乳酸，有利于纤维素进一步分解，当乳酸浓度升高时，pH值下降，并且纤维二糖酶的活性在pH＝4-5时最强，分解纤维素最快。纤维二糖酶以及乳酸杆菌的协同作用使纤维素得到快速分解，并最终产生乳酸。

本发明采用含有黑曲霉孢子和乳酸杆菌的共固定化凝胶珠发酵，利用纤维二糖酶以及乳酸杆菌的相互协同作用最快及最大程度降解纤维素，有利于有效成分溶解出来；而最终产物乳酸将释放出的杨梅苷水解脱苷形成杨梅素。

发酵温度进一步优选为48℃，在此温度下纤维二糖酶和乳酸杆菌的协同作用能够得到较好的发挥，也有利于乳酸水解杨梅苷。

发酵结束后，用筛网过滤发酵液，筛网目数优选为10-30目，可除去共固定化凝胶珠，而其他固体成分保留在滤液中。

过滤后的发酵液用乙醇回流提取1-5次，乙醇和发酵液形成的混合物中，乙醇体积分数为70-95％，每次提取时间为1-3h，提取温度为保持溶液沸腾的温度即可。每次提取后都趁热过滤，将多次提取后的滤液合并，加压浓缩或者减压浓缩除去乙醇(至无醇味)，得到膏状沉淀物。沉淀物反复水洗4～6次，得成品。

在下文中，通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述说明。然而，这些实施方式是示例性的，本发明公开内容不限于此。如果无特殊说明，本发明以下具体实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。

以下具体实施例中，所使用的黑曲霉菌株(Asperillus niger)CICC 2487购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CICC 6226购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

实施例1

本实施例1中，杨梅素的提取方法包括以下步骤：

1)固定化细胞构建：黑曲霉菌株在固体斜面培养基中培养7，产生大量孢子，将孢子置于生理盐水中制成含量为3×10⁸CFU/ml的黑曲霉孢子悬浮液；将处于对数生长期的乳酸杆菌加生理盐水重悬，得到乳酸杆菌含量为2×10¹⁰CFU/ml的乳酸杆菌悬浮液。将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌细胞悬浮液以体积比1:1混合后，加入至海藻酸钠溶液中，使海藻酸钠的终浓度为3％，将混合液搅拌均匀，并用注射器滴入到1％的CaCl₂溶液中，形成直径范围为2.5-3mm的共固定化凝胶珠，置于4℃冰箱中固化10h。

2)取1kg杨梅枝，破碎至30～80目，先加75vt％乙醇保持溶液微沸状态下回流提取2h，乙醇加入体积量为杨梅枝重量的10倍量，趁热过滤，滤渣继续加75vt％乙醇，乙醇加入体积量为滤渣重量的8倍量，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，合并两次滤液，加压浓缩至无醇味，得固液混合物，滤渣干燥除去乙醇。

3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的固液混合物以及2/3重量的滤渣，共固定化凝胶珠、步骤2)中的固液混合物的质量比为1:10。48℃下发酵提取168h。

4)发酵结束后，用筛网过滤发酵液，筛网目数为20目，除去共固定化凝胶珠。

5)将过滤后的发酵液倒入提取罐中，加入乙醇，使得乙醇体积分数为75％，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，滤渣继续加入乙醇，使得乙醇体积分数为75％，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，合并两次滤液，减压蒸馏除去乙醇，得沉淀物。

6)沉淀物反复水洗5次，获得成品。

实施例2

本实施例1中，杨梅素的提取方法包括以下步骤：

1)固定化细胞构建：黑曲霉菌株在固体斜面培养基中培养6，产生大量孢子，将孢子置于生理盐水中制成含量为7×10⁸CFU/ml的黑曲霉孢子悬浮液；将处于对数生长期的乳酸杆菌加生理盐水重悬，得到乳酸杆菌含量为6×10¹⁰CFU/ml的乳酸杆菌悬浮液。将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌细胞悬浮液以体积比1:1混合后，加入至海藻酸钠溶液中，使海藻酸钠的终浓度为4％，将混合液搅拌均匀，并用注射器滴入到1.5％的CaCl₂溶液中，形成直径范围为2.5-3mm的共固定化凝胶珠，置于4℃冰箱中固化11h。

2)取1kg杨梅枝，破碎至30～80目，先加90vt％乙醇保持溶液微沸状态下回流提取2h，乙醇加入体积量为杨梅枝重量的9倍量，趁热过滤，滤渣继续加90vt％乙醇，乙醇加入体积量为滤渣重量的8倍量，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，合并两次滤液，加压浓缩至无醇味，得固液混合物，滤渣干燥去除乙醇。

3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的固液混合物和3/5重量的滤渣，共固定化凝胶珠、步骤2)中的固液混合物质量比为1:9.5。48℃下发酵提取168h。

4)发酵结束后，用筛网过滤发酵液，筛网目数为20目，除去共固定化凝胶珠。

5)将过滤后的发酵液倒入提取罐中，加入乙醇，使得乙醇体积分数为90％，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，滤渣继续加入乙醇，使得乙醇体积分数为90％，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，合并两次滤液，减压蒸馏除去乙醇，得沉淀物。

6)沉淀物反复水洗4次，获得成品。

实施例3

实施例3与实施例1的区别仅在于，实施例3的步骤3)发酵温度为40℃，其它与实施例1相同。

实施例4

实施例4与实施例1的区别仅在于，实施例4的黑曲霉孢子悬浮液与乳酸杆菌悬浮液以体积比1：0.8混合，其它与实施例1相同。

对比例1

对比例1直接采用硫酸加热反应提取杨梅素，工艺如下：

取1kg杨梅枝，破碎至30～80目，先加90vt％乙醇保持溶液微沸状态下回流提取2h，乙醇加入体积量为杨梅枝重量的9倍量，趁热过滤，滤渣继续加90vt％乙醇，乙醇加入体积量为滤渣重量的8倍量，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，合并两次滤液，加压浓缩至无醇味，得固液混合物，滤渣干燥。

往固液混合物中，加入2/3重量的滤渣，以及加入10倍体积量质量分数为8％的盐酸，110℃加热回流反应5h。

将上述反应产物倒入提取罐中，加入乙醇，使得乙醇体积分数为90％，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，滤渣继续加入乙醇，使得乙醇体积分数为90％，保持溶液微沸状态下回流提取1.5h，趁热过滤，合并两次滤液，减压蒸馏除去乙醇，得沉淀物。沉淀物反复水洗4次，获得成品。

对比例2

对比例2直接采用乳酸加热反应提取杨梅素，对比例2工艺与对比例1的区别仅在于，对比例2采用质量分数为10％的乳酸加热回流反应5h，其它与对比例1相同。

测定实施例1-4以及对比例1-2的提取成品中杨梅素含量，方法如下：

色谱条件：Waters uBondapak C18色谱柱(5mm×200mm，15～20μm)；流动相为水：甲醇：乙酸＝40:60:0.005(体积比)；检测波长370mm；流速1mL·min^-1；室温。

标准曲线的绘制：精密称取杨梅素对照品9.80mg、置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀配成9.8，19.6，29.4，39.2，49.0μg/ml系列浓度的杨梅素溶液。经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液20μm进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，以峰面积为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)绘制标准曲线。

供试品溶液制备：精密量取10mg成品，用甲醇稀释至100ml，取1ml用甲醇定容至10ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

取供试品溶液20μm进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，根据标准曲线获得杨梅素含量。

每份成品HPLC进样测试5次，取平均值。

实施例1-4以及对比例1-2的提取成品中杨梅素含量如表1所示。

根据杨梅素含量，计算实施例1-4以及对比例1-2最终杨梅素提取率，结果表1所示。

提取率％＝(杨梅素提取量/杨梅枝干质量)*100％

表1 实施例1-4以及对比例1-3的杨梅素提取率及杨梅素含量

实施例	提取率(％)	杨梅素含量(％)
			实施例1	5.24	70.15
实施例2	3.70	80.00
			实施例3	4.89	67.82
实施例4	5.02	68.55
			对比例1	4.72	60.13
对比例2	4.12	61.25

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。