一种红曲菌利用柚子副产物产降脂成分Monacolin K的方法
阅读说明：本技术 一种红曲菌利用柚子副产物产降脂成分Monacolin K的方法 (Method for producing lipid-lowering component Monacolin K by using pomelo byproducts through monascus ) 是由 张薄博 钱高飞 陈磊 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种红曲菌利用柚子副产物产降脂成分Monacolin K的方法,属于微生物发酵技术领域。本发明利用红曲菌固态发酵柚子囊和/或柚子皮产Monacolin K,Monacolin K产量高达7.413mg/g。柚子囊和/或柚子皮作为柚子加工过程的主要废弃物,本身是可食用无危害的,将其应用于红曲固态发酵产降脂成分Monacolin K,可以降低红曲产品的生产成本,同时满足了绿色环保和可持续发展的需求,是变废为宝的体现,具有重大的研究意义和经济价值。(The invention discloses a method for producing a lipid-lowering component Monacolin K by monascus through grapefruit by-products, belonging to the technical field of microbial fermentation. The Monacolin K is produced by fermenting the pomelo seed sacs and/or the pomelo peels in a solid state by using monascus, and the yield of the Monacolin K is up to 7.413 mg/g. The pomelo fruit sacs and/or the pomelo peel are/is used as main waste in the pomelo processing process, are edible and harmless, are applied to red yeast solid state fermentation to produce a fat-reducing component Monacolin K, can reduce the production cost of red yeast products, meet the requirements of environmental protection and sustainable development, are the embodiment of turning waste into wealth, and have great research significance and economic value.)
技术领域
本发明涉及一种红曲菌利用柚子副产物产降脂成分Monacolin K的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
心脑血管疾病成为人类健康的主要杀手之一，这与人体血液中胆固醇的过多积累有重要关系。Monacolin类物质作为真菌代谢的一种活性物质，是胆固醇合成的关键酶HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂，可有效维持胆固醇处于较低的密度水平。在抑制胆固醇合成方面，Monacolin K属于Monacolin类物质中效果极佳的，但根据现有研究，Monacolin K目前仍以发酵为主要生产方式，但其产率较低。近几年来，心血管疾病的发病率、死亡率已经跃居全球首位，降血脂类药物的需求量越来越大，同时人们对生活质量的要求越来越高，功能食品的需求量大大增高，功能食品行业快速发展，因此，Monacolin K的发酵法生产具有广阔的前景。
红曲菌是药食两用丝状真菌，在我国已有一千多年的使用历史，早在东汉时期已有红曲作为食物的记载，后来的《本草纲目》，《天工开物》，《神农本草经》等著作中已有红曲相关药用价值的记载。这与红曲菌在发酵过程中产生的多种功能活性物质紧密相关，其中最重要的就是具有降胆固醇功效的生理活性物质Monacolin K。
传统的红曲固态发酵主要以大米等谷物作为发酵基质，目前也有许多以农产品废弃物为基质进行红曲固态发酵生产Monacolin K的研究，例如，田洁等以麸皮为基质进行红曲菌固态发酵，得到的Monacolin K含量只有0.043mg/g；许建生等以红曲菌制备麦曲用于黄酒的酿造，为开发具有降脂功能的黄酒提供基础，但是通过含水量、接种量等发酵条件的优化最后仅得到1.252mg/g的Monacolin K含量；刘安军等以豆粕为基质进行红曲菌固态发酵产Monacolin K的研究，Monacolin K的最高含量只达到了0.0325mg/g。这些研究中Monacolin K含量普遍较低。
柚子囊和柚子皮是柚子加工过程产生的废弃物，柚子除了可食用的果肉外，还有很大一部分柚子囊及柚子皮，绝大部分的柚子囊和柚子皮都被直接丢弃，少部分柚子囊被加工成休闲食品，但是受众面不广。少量的柚子囊被用于去异味或者制作蜂蜜柚子茶之类产品，但使用量也远低于产生量。如果能够有效地利用柚子囊和柚子皮，就可获得可观的经济利益。同时，柚子囊和柚子皮本身是可食用无危害的，这样的农产品废弃物高附加值利用，可以达到物尽其用的效果。但是柚子囊和柚子皮主要包括膳食纤维、果胶、皂甙等，其成分与大米存在很大的区别，使得利用柚子囊和柚子皮进行红曲菌固态发酵仍存在一些需要解决的难点，如营养成分不足等。大米的成本比较高，而柚子副产物成本极低，用于固态发酵产活性物质可以达到废弃物绿色利用的效果，满足环保和可持续发展的理念。因此，提供一种处理柚子副产物的方法，提高产品附加值，具有重要的应用价值。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明将柚子副产物应用于红曲菌固态发酵产降脂成分Monacolin K，Monacolin K产量高达7.4mg/g，不仅降低红曲产品的生产成本，同时满足了绿色环保和可持续发展的需求，是变废为宝的体现，具有重大的研究意义和经济价值。
本发明的第一个目的是提供一种处理柚子副产物的方法，所述方法是利用红色红曲菌9901发酵柚子副产物生产Monacolin K；所述柚子副产物包括柚子皮和/或柚子囊；所述柚子副产物的初始含水量为40％～55％(m/m)；发酵过程中添加碳源和/或氮源。
在一种实施方式中，所述柚子副产物的初始含水量优选为45％。
在一种实施方式中，所述发酵的条件为：固态发酵，在25-35℃条件下活化培养1-3天，再在20-30℃条件下培养14-29天。
在一种实施方式中，所述碳源为甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖中的一种或多种；所述氮源为硝酸钠、酵母膏、蛋白胨中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述碳源为乳糖。
在一种实施方式中，所述乳糖的添加量为1-5％(m/m)。
在一种实施方式中，所述乳糖的添加量优选为3％。
在一种实施方式中，所述氮源为蛋白胨。
在一种实施方式中，所述蛋白胨的添加量为1-3％(m/m)。
在一种实施方式中，所述蛋白胨的添加量优选为1％。
在一种实施方式中，所述柚子副产物为：柚子囊和/或柚子皮，含水量40％-55％。
在一种实施方式中，所述柚子副产物优选为：柚子囊，含水量45％。
在一种实施方式中，所述方法是将红色红曲菌9901接种到种子培养基中得到种子液，然后将种子液以5％～10％(V/m)的接种量接种于柚子囊和/或柚子皮中发酵生产Monacolin K。
在一种实施方式中，所述接种量优选为10％(V/m)。
在一种实施方式中，所述种子培养基为(g·L-1)：葡萄糖40-80，鱼粉蛋白胨10-40，硝酸钠1-5，七水硫酸镁0.5-2，磷酸氢二钾0.5-2，玉米粉2-10，pH调至3-8。
本发明还提供所述方法及其制备得到的Monacolin K在制药或食品领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明利用红曲菌固态发酵柚子副产物产Monacolin K，Monacolin K产量高达7.413mg/g。柚子副产物作为柚子加工过程的主要废弃物，本身是可食用无危害的，将柚子囊和柚子皮应用于红曲固态发酵产降脂成分Monacolin K，可以降低红曲产品的生产成本，同时满足了绿色环保和可持续发展的需求，是变废为宝的体现，具有重大的研究意义和经济价值。
附图说明
图1：红曲菌利用柚子副产物产降脂成分Monacolin K。
具体实施方式
Monacolin K的测定方法：
(1)固态发酵样品的预处理
将红曲菌利用柚子囊固态发酵结束的产品放于电热鼓风干燥箱中烘干，用研磨机打碎至粉末状态，将每一份样品的粉末混匀，取0.50g样品于50mL比色管中，用70％乙醇定容至50mL，55℃水浴1h，每20min震荡一次，水浴结束后冷却至室温，用0.45μm滤膜过滤，滤液待用。
(2)液相色谱检测(HPLC检测)
仪器：Waters2487；色谱柱型号：20RBA×SB-C18；流动相：乙腈:水＝55:45(V/V)，磷酸调pH至2.5；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；进样量：20-30μL；检测器：紫外检测器；检测波长：238nm；
(3)Monacolin K含量的计算：Monacolin K含量(mg/g)＝c(mg/L)*0.05(L)/0.5(g)式中：
c：萃取液中Monacolin K浓度(mg/L)；
0.05：50mL转换成0.05L；
0.5：0.5g样品质量。
实施例1：不同菌株发酵生产Monacolin K
种子液培养基：葡萄糖60g·L-1，鱼粉蛋白胨25g·L-1，硝酸钠2g·L-1，七水硫酸镁1g·L-1，磷酸氢二钾1g·L-1，玉米粉6g·L-1，pH调至6.0。
发酵培养基：柚子囊(切细切小，如切为0.5～1cm边长的立方体)，50％含水量。
(1)种子液的制备
将红色红曲菌9901(参见姜冰洁的硕士学位论文《红曲菌固态发酵高产MonacolinK的研究》，公开日：2015-12-31)，CICC编号为41649、CICC编号为41232的红色红曲菌，CICC编号为41601、CICC编号为5046的紫色红曲菌，CGMCC编号为3.4633、CGMCC编号为3.4647的丛毛红曲菌分别活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。
(2)发酵培养
分别将步骤(1)中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901、CICC 41649、CICC41232、CICC 41601、CICC 5046、CGMCC 3.4633、CGMCC 3.4647液体种子以10％(V/m)的接种量接入装有10g柚子囊的250mL三角瓶中，初始含水量为50％；在温度30℃条件下，发酵培养2d；然后在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量分别为5.322mg/g、1.253mg/g、1.853mg/g、3.559mg/g、4.235mg/g、0.253mg/g、0.552mg/g(见表1)。
表1不同红曲菌发酵的结果
实施例2：不同初始含水量发酵生产Monacolin K
发酵培养基：柚子囊，不同初始含水量。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子以体积比10％的接种量接入装有10g柚子囊的250mL三角瓶中，发酵培养基初始含水量分别为40％、45％、50％、55％、60％、65％，在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d.。发酵结束后测得Monacolin K含量分别为5.514mg/g、6.372mg/g、5.762mg/g、5.625mg/g、5.310mg/g、4.760mg/g(见表2)。
表2不同初始含水量发酵的结果
实施例3：不同接种量发酵生产Monacolin K
发酵培养基：柚子囊，45％含水量。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比5％、10％、15％、20％、25％、30％的接种量接入装有10g柚子囊的250mL三角瓶中，初始含水量为45％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。发酵结束后测得Monacolin K含量分别为6.383mg/g、6.682mg/g、5.942mg/g、5.821mg/g、6.114mg/g、4.745mg/g(见表3)。
表3不同接种量发酵的结果
实施例4：添加不同碳源发酵生产Monacolin K
发酵培养基：柚子囊，45％含水量，添加5％含量的不同碳源。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g柚子囊的250mL三角瓶中，初始含水量为45％，额外添加碳源，种类分别为甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖，添加量为5％(m/m)。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。发酵结束后测得Monacolin K含量为7.588mg/g、6.226mg/g、7.558mg/g、7.763mg/g、7.441mg/g(见表4)。
表4添加不同碳源发酵的结果
实施例5：不同乳糖添加量发酵生产Monacolin K
发酵培养基：柚子囊，45％含水量，添加不同含量的乳糖。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g柚子囊的250mL三角瓶中，初始含水量为45％，额外添加乳糖，添加量分别为1％、3％、5％、7％、9％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为7.093mg/g、7.413mg/g、6.692mg/g、6.305mg/g、5.686mg/g(见表5)。
表5不同乳糖添加量发酵的结果
实施例6：添加不同氮源发酵生产Monacolin K
发酵培养基：柚子囊，45％含水量，添加2％含量的不同氮源。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量为45％，添加的氮源分别为硫酸铵、硝酸钠、玉米粉、酵母膏、蛋白胨，添加量为2％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d.结束后测得Monacolin K含量分别为3.815mg/g、5.981mg/g、4.184mg/g、6.240mg/g、6.506mg/g(见表6)。
表6添加不同氮源发酵的结果
实施例7：不同蛋白胨添加量发酵生产Monacolin K
发酵培养基：柚子囊，45％含水量，添加不同含量的硝酸钠。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量为45％，额外添加氮源，种类为蛋白胨，添加量分别为1％、1.5％、2％、2.5％、3％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为7.088mg/g、5.561mg/g、5.954mg/g、6.095mg/g、5.904mg/g(见表7)。
表7不同蛋白胨添加量发酵的结果
实施例8：其它废弃物发酵生产Monacolin K
参照实施例1-7的方法，对不同废弃物发酵生产Monacolin K的发酵参数进行优化。测定Monacolin K的最高产量。
(1)红曲菌利用柚子皮发酵生产Monacolin K
发酵培养基：柚子皮，45％含水量。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g柚子皮的250mL三角瓶中，初始含水量为45％。额外添加3％的乳糖作为碳源。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为4.423mg/g。
(2)红曲菌利用橘子皮发酵生产Monacolin K
发酵培养基：橘子皮，45％含水量。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g橘子皮的250mL三角瓶中，初始含水量为45％。额外添加3％的乳糖作为碳源。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为2.232mg/g。
(3)红曲菌利用花生粕发酵生产Monacolin K
发酵培养基：花生粕，45％含水量。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g花生粕的250mL三角瓶中，初始含水量为45％。额外添加3％的乳糖作为碳源。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为3.128mg/g(见表8)。
表8不同废弃物发酵生产Monacolin K
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。