阅读说明：本技术 柑橘氧甲基转移酶CitOMT2的体外酶活应用 (In-vitro enzyme activity application of citrus oxygen methyltransferase CitOMT2 ) 是由 孙崇德 刘晓娟 王岳 曹锦萍 陈昆松 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种柑橘氧甲基转移酶CitOMT2的体外酶活应用。通过原核表达得到的CitOMT2重组蛋白可以在体外高效催化多种黄酮类化合物在特定位点发生甲基化,即催化木犀草素、槲皮素、3-甲基槲皮素、圣草酚、五羟黄酮、杨梅素在B环间位的羟基处发生甲基化,生成相应的3’或3’/5’甲基化衍生物；催化黄芩素在7位羟基处发生甲基化生成7-甲基黄芩素。本发明首次鉴定得到一个能够催化类黄酮3’/5’/7位点的氧甲基转移酶CitOMT2。CitOMT2的这种多位点催化特性有助于快速而准确地扩大O-甲基化类黄酮的多样性,具有广阔的前景和应用价值。(The invention provides an in vitro enzyme activity application of citrus oxygen methyltransferase CitOMT 2. The CitOMT2 recombinant protein obtained through prokaryotic expression can efficiently catalyze a plurality of flavonoid compounds to be methylated at specific sites in vitro, namely catalyze luteolin, quercetin, 3-methyl quercetin, eriodictyol, quercetin and myricetin to be methylated at the hydroxyl of the B ring meta position, and generate corresponding 3' or 3'/5' methylated derivatives; catalyzing the baicalein to generate 7-methyl baicalein through methylation at a hydroxyl position at the 7 position. The invention identifies an oxygen methyltransferase CitOMT2 which can catalyze the 3'/5'/7 site of flavonoid for the first time. The multi-site catalytic property of CitOMT2 is helpful for rapidly and accurately expanding the diversity of O-methylated flavonoids, and has broad prospects and application values.)

柑橘氧甲基转移酶CitOMT2的体外酶活应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术和酶学领域，具体涉及一种柑橘的氧甲基转移酶CitOMT2的体外酶活应用。

背景技术

黄酮类化合物是植物中广泛存在的重要小分子化合物。到目前为止，类黄酮种类已超过10000种。类黄酮的结构多样性奠定了其在人体内发挥多重生物活性的基础。这种结构多样性主要是由一系列修饰反应形成的，其中O-甲基化是最重要的修饰之一。已有文献报道类黄酮的结构经过O-甲基化修饰后亲脂性增加、生物利用度提高，更有利于发挥其生物活性，如降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗抑郁。

目前生物活性研究所使用的O-甲基化类黄酮主要由植物天然产物分离纯化和化学合成得到，这两种方法工艺较为复杂。随着基因工程和酶学技术的发展，通过植物类黄酮氧甲基转移酶(Flavonoid O-methyltransferase,FOMT)酶法合成O-甲基化黄酮日益受到关注。植物FOMT是一类特异性催化类黄酮特定位点的羟基发生O-甲基化的转移酶类，通过植物FOMT在体外快速大量合成特定位点的O-甲基化类黄酮对后续的生物活性研究意义重大。

柑橘中富含多甲氧基黄酮，且存在能够催化邻位、间位、对位的多种FOMT，因此从柑橘中分离FOMT进行O-甲基化类黄酮的酶法合成有着广阔的应用前景。已有文献报道柑橘中存在一种能够有效催化3/5/7位的FOMT，但是植物中能够同时催化3'/5'/7的FOMT尚未报道。

发明内容

本发明的目的是提供所述柑橘氧甲基转移酶CitOMT2在体外酶活中的应用，尤其在催化木犀草素、槲皮素、3-甲基槲皮素、圣草酚生成相应的3'甲酯产物；在催化五羟黄酮、杨梅素生成相应的3',5'甲酯产物；在催化黄芩素在7位甲基化生成7-甲基黄芩素中的应用，即CitOMT2在体外催化类黄酮3'/5'/7位点的羟基发生甲基化的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供柑橘氧甲基转移酶CitOMT2，该酶来源于‘瓯柑’品种，在柑橘中首次发现，属于Ⅰ类氧甲基转移酶，其甲基化反应过程不依赖于金属离子。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的氧甲基转移酶CitOMT2，其氨基酸序列如SEQ:No.1所示的氨基酸序列。或者是将SEQ:No.1所示的氨基酸序列经过若干个氨基酸取代/添加/缺失且功能相同的蛋白质。

本发明提供的氧甲基转移酶CitOMT2的编码基因，其核苷酸序列如SEQ:No.2所示，或者是与SEQ:No.2所示的核苷酸序列同源性大于90％且编码具有相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别为SEQ:No.3和SEQ:No.4所示。

本发明提供含有上述编码基因的表达载体，在本发明的一个

具体实施方式

中，所述表达载体为含有上述编码基因的表达载体pET32a。

本发明提供含有上述表达载体的重组细胞，在本发明的一个具体实施方式中，所述重组细胞为大肠杆菌细胞BL21(DE3)pLysS(Promega)。

本发明首次鉴定得到一个能够催化类黄酮3'/5'/7位点的氧甲基转移酶CitOMT2。通过原核表达得到的CitOMT2重组蛋白可以在体外高效催化木犀草素、槲皮素、3-甲基槲皮素、圣草酚、五羟黄酮、杨梅素在B环间位的羟基处发生甲基化，生成相应的3'或3'/5'甲基化衍生物；催化黄芩素在7位羟基处发生甲基化生成7-甲基黄芩素。CitOMT2的这种多位点催化特性有助于快速而准确地扩大O-甲基化类黄酮的多样性，具有广阔的前景和应用价值。

附图说明

图1：CitOMT2重组蛋白SDS-PAGE电泳图；其中：泳道1：蛋白分子质量标准；泳道2：诱导后未纯化上清；泳道3：纯化的CitOMT2-pET32a重组蛋白。

图2：CitOMT2反应产物鉴定的HPLC分析图；其中反应底物分别为木犀草素(A)、槲皮素(B)、3-甲基槲皮素(C)、圣草酚(D)、五羟黄酮(E)、杨梅素(F)、黄芩素(G)。

图3：CitOMT2反应产物鉴定的二级质谱图；其中反应底物分别为木犀草素(A)、槲皮素(B)、3-甲基槲皮素(C)、圣草酚(D)、五羟黄酮(E)、杨梅素(F)、黄芩素(G)。

图4：CitOMT2催化底物甲基化示意图；其中在3'位点甲基化(A)、在3',5'位点甲基化(B)、在7位点甲基化(C)。

图5：不同pH(A)和温度(B)对CitOMT2重组蛋白活性的影响。

图6：CitOMT2的亚细胞定位图。

具体实施方式

结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但下述实施例不限制本发明的保护范围。下述实施例中所用的操作方法，如未作特殊说明，均为常规试验方法，可参照《分子克隆实验指南》(第三版)。

实施例1：CitOMT2全长的克隆

(一)实验方法

1.CTAB法提取‘瓯柑’果皮RNA

将新鲜的‘瓯柑’果皮切成丁，之后加液氮速冻并研磨；取0.3g样品粉末加入到提前在65℃预热的4ml CTAB/β-巯基乙醇提取液中，涡旋混匀后继续在65℃加热5min；向混合液中加入4ml三氯甲烷：异戊醇(24:1/V:V)抽提液，充分涡旋混匀后，15℃，10000rpm离心10min；吸取上清液到新的离心管，加入4ml上述抽提液，重复抽提，离心后吸取上清液到新的离心管；向得到的上清液中加入1/4体积的10M的氯化锂溶液，4℃静置过夜；第二天，4℃，10000rpm离心30min，弃净上清；向沉淀中加入400μL 65℃预热的SSTE，轻拍溶解沉淀，之后加入400μL上述抽提液并充分涡旋混匀；将上述混合液全部转移到1.5ml离心管中，15℃，10000rpm离心10min；吸取上清到新的1.5ml离心管中，向其中加入2倍体积的无水乙醇(提前在-20℃预冷)，轻柔混匀后，在-80℃静置30min；4℃，10000rpm离心20min，弃净上清后将沉淀在通风橱中晾干(5-10min)，加入20μL DEPC水溶解沉淀，至此得到总RNA样品。用1％琼脂糖凝胶电泳检测所得RNA样品结构的完整性(上下两条清晰条带，亮度比约为2:1)，之后用紫外分光光度计检测其纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～2.0)，并记录RNA浓度(μg/μL)。

2.cDNA合成

以提取的总RNA样品为模板，使用逆转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Takara，日本)进行cDNA合成，并将cDNA稀释10倍作为后续的克隆模板。

3.目的基因全长克隆

参照FastStart High Fidelity PCR System(Roche)，以上述稀释的cDNA为模板，以引物对SEQ:No.3和SEQ:No.4进行目的基因的PCR扩增。扩增体系和程序如下：

扩增体系(30μL)：10×buffer 3μL，dNTP 2.4μL，cDNA模板0.6μL，上下游引物(10μM)各1.2μL，酶0.3μL，DEPC水21.3μL。扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72延伸10min，4℃保存。

上述PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，连接至pGEM-T Easy vector(Promega)，转化到大肠杆菌(DH5α)中，最后通过菌落PCR和后续的测序验证挑选阳性单克隆并保存。

(二)实验结果

成功从‘瓯柑’果皮中克隆得到CitOMT2全长序列1101bp，并构建了***CitOMT2全长序列的CitOMT2-T质粒。

实施例2：CitOMT2重组蛋白表达及纯化

(一)实验方法

1.目的基因重组细胞的构建

根据CitOMT2全长序列设计带有pET32a酶切位点的引物对SEQ:No.5和SEQ:No.6，以实施例1中得到的CitOMT2-T质粒为模板，按照实例1中所示的扩增体系和程序克隆CitOMT2全长序列(不含终止子)，构建CitOMT2-PET32a重组质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS(Promega)中，通过氨苄青霉素(Amp)抗性培养基以及菌落PCR筛选阳性重组细胞，并将相应菌液加入等体积的50％甘油保存在-80℃。

2.目的基因原核表达及重组蛋白纯化

将上述保存的菌液在含有Amp抗性的LB培养基上划线过夜培养，挑取单菌落接种于20ml含有Amp抗性的LB液体培养基中过夜振荡培养(37℃，150rpm)；菌液按1:50接种于500ml含有Amp抗性LB液体培养基，继续培养至OD₆₀₀＝0.5～0.6(37℃，150rpm)；加入终浓度为1mM的IPTG，诱导蛋白表达(18℃，150rpm)；诱导表达约20h后，离心收集菌体(5000rpm10min)，并重悬在50ml 1×PBS buffer(生工)中，放置到-80℃过夜；第二天，30℃融化上述重悬液，并用超声细胞破碎仪裂解菌体((超声3.0s，间隔2.0s，超声5min，功率28％)；离心(4℃，10000rpm，30min)，将上清过0.45滤膜(水系)后置于冰上准备过柱纯化；蛋白纯化参照HisTALON^TM Gravity Column Purification Kit(Takara，日本)说明书，收集目的蛋白；使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare，UK)将蛋白保存在Tris-HCl缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM DTT，10％甘油)中，置于-80℃保存；分别吸取1μL上述蛋白样品和10μL诱导后未纯化的上清液用于蛋白质聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，电泳胶配制方法和电泳条件参照预制胶缓冲液10％(弗德生物，中国)说明书；电泳结束后，将蛋白胶放入考马斯亮蓝R250(弗德生物，中国)中染色15min，75rpm；之后将蛋白胶在水中煮沸直至蛋白胶背景清洗干净，观察蛋白电泳图并拍照保存。

(二)实验结果

SDS-PAGE电泳图结果显示，纯化所得的蛋白样品大小约为58KDa(附图1)，与CitOMT2-PET32a重组蛋白理论计算值(58.75KDa)一致，可用于下一步的酶活研究。

实施例3：CitOMT2体外酶活测定

(一)实验方法

1.CitOMT2对不同底物的区域选择性测定

选取木犀草素、槲皮素、3-甲基槲皮素、圣草酚、五羟黄酮、杨梅素、黄芩素七种底物对CitOMT2重组蛋白的区域选择性进行测定。酶活反应体系200μL，其中重组蛋白25μL，S-腺苷甲硫氨酸1mM、底物200μM，反应缓冲液为Tris-HCl(pH8.0)。反应液混匀后置于37℃水浴锅孵育2h，加入等体积甲醇充分混匀终止反应，离心吸上清过0.22μm有机滤膜后用于后续的高效液相色谱(HPLC)及质谱分析。

HPLC分析条件：安捷伦1260HPLC系统；Sunfire C18ODS色谱柱(4.6×250mm，5μm，Waters，美国)；流动相：乙腈(A)，含有0.1％甲酸的纯净水(B)；流速：1ml/min；洗脱梯度：20％A(0-5min)，20％-27％A(5-10min)，27％A(10-15min)，27％-40％A(15-25min)，40％-60％A(25-35min)，60％-80％A(35-40min)，80％-100％A(40-42min)，100％-20％A(42-45min)，20％A(45-50min)；进样量：10μL；检测器：VWD检测器；检测波长：圣草酚为底物时280nm，其余底物为350nm。

高分辨质谱分析条件：AB TripleTOF 5600plus系统；木犀草素、圣草酚、3-甲基槲皮素为底物时在负离子模式下进行质谱分析，五羟黄酮、黄芩素、槲皮素、杨梅素为底物时在正离子模式下进行质谱分析。

2.温度和pH对CitOMT2催化速率的影响测定

以木樨草素为底物进行CitOMT2酶活测定。

pH对酶催化速率影响测定：反应温度和时间分别为37℃和30min，设置8个pH梯度(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，其中pH(5.5-7.5)为磷酸钾缓冲液，pH(8.0-9.0)为Tris-HCl缓冲液。温度对酶催化速率影响测定：反应缓冲液和时间分别为Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和30min。设置8个温度梯度(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃)。上述反应完成后均加入2倍体积甲醇，充分混匀终止反应，之后离心过0.22μm有机滤膜进行液相分析，测定产物生成量。色谱条件与上述一致。

(二)实验结果

1.CitOMT2重组蛋白与上述7种底物孵育后，均可在HPLC分析中检测到新的物质峰(附图2)，进一步利用质谱分析技术确定了其反应产物(附图3)。上述分析结果表明CitOMT2重组蛋白可以在体外催化木犀草素、槲皮素、3-甲基槲皮素、圣草酚生成相应的3'甲酯产物(金圣草素、异鼠李素、3,3'-二甲基槲皮素、高圣草酚)；催化五羟黄酮、杨梅素生成相应的3',5'甲酯产物(苜蓿素、丁香亭)；催化黄芩素在7位甲基化生成7-甲基黄芩素。7种底物及相应产物的结构式见附图4。

2.pH和温度依赖性试验结果表明，以木犀草素为底物时，CitOMT2重组蛋白更偏好碱性缓冲液，且在温度为55℃时反应速率最高(附图5)。

实施例4：CitOMT2亚细胞定位

(一)实验方法

1.目的基因GFP融合载体的构建

以CitOMT2全长序列为模板，利用CE Design软件(诺唯赞，中国)设计单片段克隆引物对(不含终止子)SEQ:No.7和SEQ:No.8，以实例1中CitOMT2-T质粒为扩增模板进行PCR扩增，并用单片段克隆试剂盒(诺唯赞，中国)连接到35S-eGFP载体上，构建CitOMT2-GFP重组质粒。将测序正确的重组质粒以及35S-eGFP空载体分别通过电转法转化到农杆菌菌株G3101：pSoup中，通过卡那霉素(Kan)和庆大霉素(Get)抗性培养基以及菌落PCR筛选阳性单菌落，并将相应菌液加入等体积的50％甘油保存在-80℃。

2.烟草瞬时表达

将上述菌液划线活化后，刮取生长状态良好的菌落，用注射渗透液悬浮至OD₆₀₀为1.0。将含有CitOMT2-GFP和空载(35S-GFP)质粒的农杆菌悬浮液分别注射到两株本氏烟草中，每株烟草注射3片叶子(约4周大小)。注射2天后，用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光。

注射渗透液(pH 5.6)：10mM MgCl₂，10mM MES(生物缓冲液)，150μM乙酰丁香酮

(二)实验结果

注射含空载的农杆菌后，在烟草叶片的细胞核和细胞质中均观察到了GFP荧光。注射含CitOMT2-GFP质粒的农杆菌后，GFP荧光主要分布在烟草叶片的细胞质中，表明CitOMT2在植物中主要定位在细胞质(附图6)。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 柑橘氧甲基转移酶CitOMT2的体外酶活应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 366

<212> PRT

<213> 柑橘 (Citrus reticulata cv. Suavissima)

<400> 1

Met Gly Ser Thr Ser Ser Glu Thr Gln Ile Ser Pro Ala Gln Gly Ser

1 5 10 15

Asp Glu Glu Ala Asn Leu Leu Ala Met Gln Leu Thr Ser Ala Ser Val

20 25 30

Leu Pro Met Val Leu Lys Ser Ala Ile Glu Leu Asp Leu Leu Glu Ile

35 40 45

Ile Ala Lys Ala Gly Pro Asp Ala Phe Met Ser Pro Lys Asp Ile Ala

50 55 60

Ser Gln Leu Pro Thr Lys Asn Pro Asp Ala His Ile Val Leu Asp Arg

65 70 75 80

Ile Leu Arg Leu Leu Ala Ser Tyr Ser Val Leu Asn Cys Ser Leu Arg

85 90 95

Asn Leu Pro Asp Gly Lys Val Glu Arg Leu Tyr Gly Leu Ala Pro Val

100 105 110

Cys Lys Phe Leu Thr Lys Asn Glu Asp Gly Val Thr Leu Ser Asp Leu

115 120 125

Cys Leu Met Asn Gln Asp Lys Val Leu Met Glu Ser Trp Tyr Tyr Leu

130 135 140

Lys Asp Ala Val Leu Glu Gly Gly Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly

145 150 155 160

Met Asn Ala Phe Asp Tyr His Gly Lys Asp Leu Arg Phe Asn Lys Ile

165 170 175

Phe Asn Asn Gly Met Ser Ser His Ser Thr Ile Thr Met Lys Lys Ile

180 185 190

Leu Glu Asn Tyr Lys Gly Phe Glu Gly Leu Asn Ser Val Val Asp Val

195 200 205

Gly Gly Gly Ile Gly Ala Thr Leu Asn Met Ile Ile Ser Lys Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Lys Gly Ile Asn Phe Asp Leu Pro His Val Ile Gln Asp Ala

225 230 235 240

Pro Ala Phe Pro Gly Val Glu His Val Gly Gly Asp Met Phe Val Ser

245 250 255

Val Pro Lys Gly Asp Ala Ile Phe Ile Lys Trp Ile Cys His Asp Trp

260 265 270

Ser Asp Glu His Cys Val Lys Phe Leu Lys Asn Cys Tyr Glu Ala Leu

275 280 285

Pro Val Asn Gly Lys Val Ile Val Ala Glu Ser Ile Leu Pro Val Thr

290 295 300

Pro Asp Thr Ser Leu Ala Ser Lys Val Val Ile His Val Asp Cys Ile

305 310 315 320

Met Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Gln Glu Phe

325 330 335

Arg Ala Leu Ala Lys Ala Ala Gly Phe Gln Gly Phe Gln Val Val Ser

340 345 350

Ser Ala Phe Asn Thr Tyr Ile Met Glu Phe Leu Lys Ser Ala

355 360 365

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> 柑橘 (Citrus reticulata cv. Suavissima)

<400> 2

atgggttcaa ccagttcaga aactcaaata agtccagccc aaggctcgga tgaagaggca 60

aacctcttgg ccatgcaatt aaccagtgcc tcagtcttgc ctatggttct caaatcagcc 120

attgagcttg atcttttaga gatcatcgct aaagctgggc cagatgcttt catgtctcca 180

aaagacatag cttctcagct gcccacaaag aacccagatg cccatatcgt gcttgatcgt 240

atattgcgcc ttctggcgag ctattcagtc cttaattgct ctttgcgcaa tctccccgac 300

ggcaaagttg agaggcttta tggccttgcc cccgtttgta aattcctcac taaaaatgaa 360

gatggtgtta cactttccga tctttgtctc atgaaccaag acaaggttct catggagagc 420

tggtactact taaaagatgc agtgcttgaa ggtggcattc catttaacaa ggcctatggg 480

atgaatgcat tcgattacca tggcaaagat ctaagattca acaagatttt caacaatgga 540

atgtcttctc attctaccat taccatgaag aaaattcttg aaaattacaa agggtttgaa 600

ggcctcaact cagttgtcga cgttggtggt ggaattggag ccacacttaa catgattatc 660

tccaagtatc catcgattaa aggcatcaac tttgatttgc cacatgttat tcaggatgct 720

ccagcttttc ctggtgtcga gcatgttggg ggagacatgt ttgttagtgt tccaaaggga 780

gatgccattt ttatcaagtg gatatgtcat gattggagtg atgagcactg cgtgaaattc 840

ttgaagaact gctatgaagc actcccagta aatgggaaag tcattgttgc tgaatctatc 900

ctcccagtaa ccccggacac aagcctcgca tccaaagtag tcatccatgt cgactgcatc 960

atgttggctc ataacccggg tggcaaagag aggactgaac aagagttcag agcattggct 1020

aaggctgctg gattccaagg tttccaagtt gtgagctctg cttttaatac ttacattatg 1080

gaatttctca agagtgcttg a 1101

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 3

atgggttcaa ccagttcaga aac 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 4

tcaagcactc ttgagaaatt cc 22

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 5

ataggatcca tgggttcaac cagttcagaa ac 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 6

gaaggactcg agagcactct tgagaaattc c 31

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 7

cggtacccgg ggatccatgg gttcaaccag ttcagaaac 39

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 8

cgactctaga ggatccagca ctcttgagaa attccataat g 41