阅读说明：本技术 用于分离靶核酸的组合物和方法 (Compositions and methods for isolating target nucleic acids ) 是由 A·沙阿 于 2018-05-10 设计创作，主要内容包括：提供了能够用于核酸分离和纯化的靶捕获探针的群体。所述群体的探针包括：第一区域和第二区域,所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括聚(r)序列,所述聚(r)序列包括(i)包括G和A核苷酸的随机序列或(ii)非随机重复(A和G)序列；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(SBP),其中所述SBP能够特异性结合第二特异性结合配偶体(SBP2)。还提供了相关的组合、方法、用途、试剂盒和反应混合物。(Populations of target capture probes are provided that can be used for nucleic acid isolation and purification. The probes of the population include: a first region and a second region, the first region being at least about 12 residues in length and comprising a poly (r) sequence comprising (i) a random sequence comprising G and a nucleotides or (ii) a non-random repeating (a and G) sequence; the second region comprises a first Specific Binding Partner (SBP), wherein the SBP is capable of specifically binding to a second specific binding partner (SBP 2). Related combinations, methods, uses, kits and reaction mixtures are also provided.)

用于分离靶核酸的组合物和方法

本申请要求于2017年5月11日提交的美国临时专利申请第62/504,900号的权益，所述申请通过引用并入本文用于所有目的。

本公开涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及用于通过使用探针群体从混合物(如样品)中分离核酸的方法和组合物，所述探针群体与一个或多个靶核酸进行杂交以允许其与混合物的其它组分分离。

序列表

本申请与电子格式的序列表一同提交。所述序列表以创建于2018年5月1日的标题为“2018-05-01_01159-0016-00PCT_Seq_List_ST25.txt”的文件的形式提供，所述文件大小为4,131字节。序列表的电子格式信息通过引用整体并入本文。

背景技术与

发明内容

如核酸的体外扩增和体外杂交等许多分子生物学程序包含一些核酸的制备，以促进后续程序。核酸纯化的方法可以分离样品中存在的所有核酸、基于物理特征分离不同类型的核酸或从样品中分离特定核酸。许多方法涉及复杂的程序、使用苛刻的化学药品或条件，或者需要很长时间才能完成所述核酸分离。一些方法涉及使用专门的寡核苷酸，每个寡核苷酸对预期的靶核酸都具有特异性，这增加了方法的设计、优化和性能的复杂性，特别是如果需要分离一个以上靶核酸或期望的靶核酸的序列未知时。一些方法不需要特定的靶序列就可以分离靶核酸，但是不能高效地分离所有序列。因此，仍然需要一种简单、高效和快速的方法来将所关注的核酸与其它样品组分分离。

因此，以下实施例在本公开提供的实施例中。

实施例1是一种用于从样品中分离靶核酸的捕获探针群体，其包括：第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(r)序列，所述聚(r)序列包括(i)包括G和A核苷酸的随机序列或(ii)非随机重复(A和G)序列；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(SBP)，其中所述SBP能够特异性结合第二特异性结合配偶体(SBP2)。

实施例2是根据实施例1所述的捕获探针群体，其中所述聚(r)序列包括包含G和A核苷酸的随机序列。

实施例3是根据实施例2所述的捕获探针群体，其中所述第一区域包括至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个随机聚(r)序列核苷酸。

实施例4是根据前述实施例中任一项所述的捕获探针群体，其中聚(r)序列包括至少约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个非随机重复(A和G)序列核苷酸。

实施例5是根据前述实施例中任一项所述的捕获探针群体，其中所述第一区域的长度为至少13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。

实施例6是根据前述实施例中任一项所述的捕获探针群体，其中所述第一区域由随机的G和A核苷酸、非随机重复(A和G)序列或其组合组成。

实施例7是关节实施例1到5中任一项所述的捕获探针群体，其中所述第一区域进一步包括处于所述聚(r)序列与第二聚(r)序列之间的连接子序列，并且所述第二聚(r)序列包括(i)包括G和A核苷酸的随机序列或(ii)非随机重复(A和G)序列。

实施例8是根据实施例7所述的捕获探针群体，其中所述聚(r)序列的长度为至少约6个残基并且所述第二聚(r)序列的长度为至少约6个残基。

实施例9是根据前述实施例中任一项所述的捕获探针群体，其中所述第一区域包括2'-O-甲基修饰的RNA残基。

实施例10是根据前述实施例中任一项所述的捕获探针群体，其中所述第一区域包括聚(r)₁₈、聚(r)₂₄或聚(r)₂₅序列。

实施例11是根据前述实施例中任一项所述的捕获探针群体，其中所述SBP是非核酸部分。

实施例12是根据实施例1到10中任一项所述的捕获探针群体，其中所述SBP包括均聚序列。

实施例13是根据实施例12所述的捕获探针群体，其中所述SBP包括dT₃dA₃₀(SEQ IDNO:10)或dA₃₀(SEQ ID NO:11)序列。

实施例14是根据前述实施例中任一项所述的捕获探针群体，其中所述SBP位于所述第一区域的3'位。

实施例15是包括根据前述实施例中任一项所述的捕获探针群体和第二捕获探针群体的组合，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括聚(k)序列，所述聚(k)序列包括(i)包括G和U/T核苷酸的随机序列或(ii)非随机重复(G和U/T)序列；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(SBP3)，其中所述SBP3能够特异性结合第四特异性结合配偶体(SBP4)。

实施例16是根据实施例15所述的组合，其中所述SBP和SBP3能够结合相同SBP2/SBP4。

实施例17是根据实施例16所述的组合，其中所述SBP和所述SBP3彼此相同。

实施例18是根据实施例15到17中任一项所述的组合，其中所述第二群体的所述第一区域的长度为至少13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。

实施例19是根据实施例15到18中任一项所述的组合，其中所述第二群体的所述第一区域包括聚(k)₁₈、聚(k)₂₄或聚(k)₂₅序列。

实施例20是根据实施例15到19中任一项所述的组合，其中所述第二群体的所述第一区域由随机的G和U/T核苷酸或非随机重复(G和U/T)组成。

实施例21是一种用于从样品中分离靶核酸的试剂盒或反应混合物，所述反应混合物包括：

实施例22是根据实施例1到14中任一项所述的捕获探针群体或根据实施例15到20中任一项所述的组合；以及

实施例23是固定在载体上的SBP2。

实施例24是根据实施例21所述的试剂盒或反应混合物，其中所述SBP和SBP2是基本上互补的核酸序列。

实施例25是根据实施例21所述的试剂盒或反应混合物，其中所述SBP和SBP2是非核酸部分。

实施例26是根据实施例21到23中任一项所述的试剂盒或反应混合物，所述反应混合物进一步包括洗涤剂。

实施例27是根据实施例21到24中任一项所述的试剂盒或反应混合物，所述反应混合物进一步包括十二烷基硫酸锂或十二烷基硫酸钠和/或氢氧化锂。

实施例28是根据实施例21到25中任一项所述的试剂盒或反应混合物，所述反应混合物包括根据实施例15到20中任一项所述的捕获探针的组合。

实施例29是根据实施例26所述的试剂盒或反应混合物，其中所述SBP和所述SBP3能够结合所述SBP2。

实施例30是根据实施例26所述的试剂盒或反应混合物，所述反应混合物进一步包括固定在载体上的SBP4。

实施例31是根据实施例21到28中任一项所述的试剂盒或反应混合物，所述混合物进一步包括溶液相。

实施例32是根据实施例29所述的反应混合物，其中所述反应混合物包括处于所述溶液相中和/或与所述捕获探针缔合的靶核酸。

实施例33是根据实施例30所述的反应混合物，其中所述靶核酸源自经过处理以将细胞内组分释放到所述溶液相中的细胞。

实施例34是根据实施例29到31中任一项所述的反应混合物，其中所述溶液相包括来自动物、环境、食物或工业来源的样品。

实施例35是根据实施例29到32中任一项所述的反应混合物，其中所述溶液相包括样品，所述样品包括外周血、血清、血浆、脑脊髓液、痰或拭子标本。

实施例36是一种用于从样品中分离靶核酸的方法，所述方法包括：使根据实施例1到14中任一项所述的捕获探针或根据实施例15到20中任一项所述的组合与含有核酸的溶液接触以形成反应混合物，其中所述反应混合物进一步包括包含所述SBP2的载体；在允许所述第一区域与所述靶核酸进行杂交并且允许所述SBP与固定在所述载体上的所述SBP2进行缔合的条件下孵育所述反应混合物，从而形成与溶液相接触的杂交复合物；以及从所述溶液相中分离出所述载体，从而将所述靶核酸与所述样品中的其它组分分离。

实施例37是一种用于从样品中分离靶核酸的方法，所述方法包括：在允许所述第一区域与所述靶核酸进行杂交并且允许所述SBP与固定在所述载体上的所述SBP2进行缔合的条件下将根据实施例21到33中任一项所述的反应混合物与所述样品一起孵育，从而形成与溶液相接触的杂交复合物；以及从所述溶液相中分离出所述载体，从而将所述靶核酸与所述样品中的其它组分分离。

实施例38是根据实施例34或35所述的方法，其中所述样品含有细胞，并且在所述接触步骤之前进行处理以将细胞内组分释放到所述溶液中。

实施例39是根据实施例36所述的方法，其中所述处理包括用含有洗涤剂的溶液处理所述样品。

实施例40是根据实施例34到37中任一项所述的方法，其中所述样品来自动物、环境、食物或工业来源。

实施例41是根据实施例34到38中任一项所述的方法，其中所述样品包括外周血、血清、血浆、脑脊髓液、痰或拭子标本。

实施例42是根据实施例34到39中任一项所述的方法，其中所述样品包括细胞裂解物。

实施例43是根据实施例34到40中任一项所述的方法，其中所述SBP和所述SBP2是非核酸部分。

实施例44是根据实施例34到40中任一项所述的方法，其中所述SBP和所述SBP2是基本上互补的核酸序列。

实施例45是根据实施例34到42中任一项所述的方法，其中使根据实施例15到20中任一项所述的组合与含有核酸的所述溶液接触。

实施例46是根据实施例43所述的方法，其中所述SBP和所述SBP3能够结合所述SBP2。

实施例47是根据实施例43所述的方法，其中所述反应混合物进一步包括包含所述SBP4的载体。

实施例48是根据前述实施例中任一项所述的群体、组合、反应混合物或方法，其中所述靶核酸包括DNA。

实施例49是根据前述实施例中任一项所述的群体、组合、反应混合物或方法，其中所述靶核酸包括RNA。

实施例50是根据前述实施例中任一项所述的群体、组合、反应混合物或方法，其中所述靶核酸包括病毒核酸。

实施例51是根据前述实施例中任一项所述的群体、组合、反应混合物或方法，其中所述靶核酸包括原核核酸。

实施例52是根据前述实施例中任一项所述的群体、组合、反应混合物或方法，其中所述靶核酸包括真核核酸。

实施例53是根据前述实施例中任一项所述的群体、组合、反应混合物或方法，其中所述靶核酸包括合成核酸。

实施例54是根据前述实施例中任一项所述的群体、组合、反应混合物或方法，其中所述靶核酸包括DNA、RNA、病毒核酸、细菌核酸、真核核酸和/或合成核酸的组合。

附图说明

图1示出了将使用(r)₁₈/(k)₁₈捕获探针混合物的提取与仅使用(k)₁₈捕获探针的提取进行比较的49个临床标本的ΔCT，如实例2所述。每个柱状图代表来自单个标本的结果。

具体实施方式

在详细描述本教导之前，应理解，本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为此类组合物或工艺步骤可以变化。应注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a/an)”以及“所述(the)”均包含复数形式。因此，例如，提及“寡聚体”包含多个寡聚体等。将以包含性的意义来解释连词“或”，即等同于“和/或”，除非包含性的意义在上下文中是不合理的。

应理解的是，本公开中所论述的温度、浓度、时间等之前存在隐含的“约”，使得轻微和非实质性的偏差都处于本教导的范围内。通常，术语“约”指示组合物的组分的量的非实质性变化，所述非实质性变化对组合物的活性或稳定性没有任何显著影响。而且，使用“包括(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”、“包含(include/includes/including)”并不旨在是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，且并不是对本教导的约束。在通过引用并入的任何材料与本公开的明确内容不一致的程度上，以明确内容为准。

除非特别指出，否则说明书中叙述“包括”各个组分的实施例也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；说明书中叙述“由各个组分组成”的实施例也被认为是“包括”所述组分或“基本上由所述组分组成”；并且说明书中叙述“基本上由各个组分组成”的实施例也被认为是“由所述组分组成”或“包括”所述组分(这种可互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。

A.定义

“样品”包含可以含有靶核酸的任何标本。样品包含“生物样品”，所述生物样品包含源自活体或死亡生物的任何组织或材料，其中所述材料或组织可以含有源自所述活体或死亡生物的靶核酸，包含例如外周血、血浆、血清、***、胃肠组织、脑脊髓液、痰、拭子标本或其它体液或材料。可以处理生物样品以物理或机械地破坏组织或细胞结构，从而将细胞内组分释放到溶液中，所述溶液可以进一步含有酶、缓冲液、盐、洗涤剂等，这些溶液用于使用标准方法制备生物样品进行分析。同样，样品可以包含处理后的样品，如通过使样品通过或穿过过滤装置，或然后进行离心，或通过粘附于介质、基质或载体而获得的样品。

“核酸”是指包括两个或更多个具有含氮杂环碱基或碱基类似物的共价键核苷或核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其它键连接在一起以形成多核苷酸。核酸包含RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“主链”可以由多种键构成，包含以下中的一或多个：糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(在“肽核酸”或PNA中，参见例如，国际专利申请公开第WO 95/32305号)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代(如例如2'-甲氧基取代和2'-卤化物取代(例如2'-F))的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(例如，肌苷、5-甲基异胞嘧啶、异鸟嘌呤；参见例如《核酸的生物化学(The Biochemistry of theNucleic Acids)》5-36,Adams等人编辑,第11版,1992；Abraham等人,2007,《生物技术(BioTechniques)》43:617-24),其包含嘌呤碱基或嘧啶碱基的衍生物(例如，N⁴-甲基脱氧甘氨酸、脱氮-或氮杂-嘌呤、脱氮-或氮杂嘧啶、在5或6位具有取代基的嘧啶碱基、在2、6和/或8位具有改变或替代取代基的嘌呤碱基(如2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O⁶-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O⁴-烷基-嘧啶)以及吡唑化合物(如，未取代或3-取代的吡唑啉[3,4-d]嘧啶)；美国专利第5,378,825号、第6,949,367号和国际专利申请公开第WO 93/13121号，所述专利各自通过引用并入本文)。核酸可以包含“无碱基”残基，在所述残基中，主链不包含一或多个残基的含氮碱基(参见例如，美国专利第5,585,481号，其通过引用并入本文)。核酸可以仅包括如在RNA和DNA中所发现的常规的糖、碱基和键，或者也可以包含常规的组分和取代(例如，通过2'-甲氧基主链连接的常规碱基，或包含常规碱基与一或多个碱基类似物的混合物的核酸)。核酸可以包含“锁定核酸”(LNA)，其中一或多个核苷酸单体具有锁定在模仿糖构象的RNA中的双环呋喃糖单元，从而增强了对单链RNA(ssRNA)、单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)中互补序列的杂交亲和力(Vester等人,《生物化学(Biochemistry)》43:13233-41,2004,其通过引用并入本文)。核酸可以包含经过修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如，添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加至核酸。尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸，但是本领域众所周知用于体外制备核酸的合成方法。

如本文所用，术语“多核苷酸”表示核酸链。在整个本申请中，核酸由5'-端至3'-端命名。合成核酸，例如DNA、RNA、DNA/RNA嵌合体(包含当在本文中包含非天然核苷酸或类似物时)，通常是“3'到5'”合成的，即通过向生长中的核酸的5'-端加入核苷酸。

如本文所用，“核苷酸”是由磷酸基、5-碳糖和含氮碱基(在本文中也被称为“核碱基”)组成的核酸的亚基。RNA中发现的5-碳糖是核糖。在DNA中，5-碳糖是2'-脱氧核糖。所述术语还包含此类亚基的类似物，如核糖的2'位置处的甲氧基(在本文中也被称为“2'-O-Me”或“2'-甲氧基”)。如本文所用，除非另外说明，否则2'-甲氧基寡核苷酸中的“T”残基可与“U”互换。

如本文所用，“非核苷酸单元”是不明显参与聚合物杂交的单元。例如，此类单元不参与任何显著的与核苷酸的氢键结合，并且将排除具有五个核苷酸碱基之一或其类似物作为组分的单元。

如本文所用，“靶核酸”是包括待扩增的靶序列的核酸。靶核酸可以是本文所述的DNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。除了靶序列之外，靶核酸可以包含其它序列，可以不扩增所述其它序列。

本文使用的“靶杂交序列”是指被配置成与靶核酸进行杂交的寡聚体的部分。靶杂交序列可以但不一定包含在与靶标进行杂交的分段之间的连接子(例如，连接子序列或非核苷酸链)。

如本文所用，术语“区域”是指核酸的一部分，其中所述部分比整个核酸小。例如，当参考的核酸是捕获探针时，术语“区域”可用于指代整个寡核苷酸的较小的靶杂交部分或充当特异性结合配偶体的较小部分。

可互换的术语“寡聚体”、“寡”和“寡核苷酸”是指具有通常少于1,000个核苷酸(nt)残基的核酸，包含处于下限为约5nt残基且上限为约500至900nt残基的范围内的聚合物。在一些实施例中，寡核苷酸处于下限为约12至15nt且上限为约50至600nt的大小范围内，而其它实施例处于下限为约15至20nt且上限为约22至100nt的范围内。寡核苷酸可以从天然存在的来源中纯化或可以使用多种众所周知的酶或化学方法中的任何一种来进行合成。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能；相反，其通常用于覆盖本文所述的所有此类试剂。寡核苷酸可以发挥各种不同的功能。例如，如果寡核苷酸对互补链具有特异性并能够与互补链进行杂交，并且可以在存在核酸聚合酶的情况下进一步延伸，则所述寡核苷酸可以用作引物；如果寡核苷酸含有被RNA聚合酶识别的序列并允许转录(例如，T7引物)，则所述寡核苷酸可以用作引物并提供启动子；如果寡核苷酸能够与靶核酸或其扩增子进行杂交，则所述寡核苷酸可以起到检测靶核酸的作用，并进一步提供可检测的部分(例如，荧光团)。

“扩增”是指用于获得靶核酸序列或其互补体或其片段的多个拷贝的任何已知步骤。多个拷贝可以被称为扩增子或扩增产物，其可以是双链或单链的并且可以包含DNA、RNA或两者。“片段”的扩增是指产生含有少于完整靶核酸或其补体的扩增的核酸，例如，通过使用与靶核酸的内部位置进行杂交并从所述内部位置开始聚合的扩增的寡核苷酸来产生。已知的扩增方法包含例如复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)以及转录介导或转录相关的扩增。复制酶介导的扩增使用自我复制的RNA分子和复制酶，如QB-复制酶(参见例如，美国专利第4,786,600号，其通过引用并入本文)。PCR扩增使用DNA聚合酶、引物对和热循环来合成dsDNA或cDNA的两条互补链的多个拷贝(参见例如，美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；和第4,800,159号；)所述专利各自通过引用并入本文)。LCR扩增通过使用杂交、连接和变性的多个循环来使用四个或更多个不同的寡核苷酸来扩增靶标及其互补链(参见例如，美国专利第5,427,930号和第5,516,663号，所述专利各自通过引用并入本文)。SDA使用的引物含有限制性内切核酸酶和可切割含有靶序列的半修饰DNA双链体的一条链的内切核酸酶的识别位点，，从而在一系列引物延伸和链置换步骤中进行扩增(参见例如，美国专利第5,422,252号、第5,547,861号；和第5,648,211号；)所述专利各自通过引用并入本文)。扩增可以是线性的或指数的。

在促进杂交以检测靶序列或扩增的核酸的条件下，“检测探针”、“检测寡核苷酸”、“探针寡聚体”和“检测探针寡聚体”可互换使用以指代与核酸或扩增的核酸中的靶序列进行特异性杂交的核酸寡聚体。检测可以是直接的(例如，直接与其靶序列杂交的探针)或间接的(例如，通过中间分子结构与其靶标连接的探针)。检测探针可以是DNA、RNA，其类似物或其组合(例如，DNA/RNA嵌合体)，并且它们可以是标记的或未标记的。检测探针可以进一步包含替代性主链键，如2'-O-甲基键。检测探针的“靶序列”通常是指通过标准碱基配对与探针寡聚体的至少一部分进行特异性杂交的较大核酸序列中的较小核酸序列区域。检测探针可以包括靶特异性序列和有助于探针的三维构象的其它序列(参见例如，美国专利第5,118,801号；第5,312,728号；第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号；)以及美国专利申请公开第20060068417号；所述专利各自通过引用并入本文)。

“稳定的”或“检测稳定的”是指反应混合物的温度比核酸双链体的解链温度低至少2℃。

如本文所用，“标记物”是指与被检测或导致可检测信号的探针直接或间接地连接的部分或化合物。直接标记可以通过将标记与探针连接的键或相互作用(包含共价键或非共价相互作用，例如氢键、疏水和离子相互作用)或通过形成螯合物或配位复合物来发生，。间接标记可以通过使用如结合对构件、抗体或附加寡聚体等桥接部分或“连接子”发生，所述桥接部分或“连接子”可以被直接地或间接地标记并且可以扩增可检测信号。标记物包含任何可检测的部分，如放射性核素、配体(例如生物素、抗生物素蛋白)、酶或酶底物、反应基或发色团(例如赋予可检测颜色的染料、颗粒或珠子)、发光化合物(例如生物发光、磷光或化学发光标记物)或荧光团。可以在均相测定中检测到标记物，在所述均相测定中，混合物中结合标记的探针具有与未结合标记的探针不同的可检测的变化，例如，不稳定性或差异降解特性。

“捕获探针”、“捕获寡核苷酸”、“捕获寡聚体”、“靶捕获寡聚体”和“捕获探针寡聚体”可互换使用以指代通过标准碱基配对与靶核酸中的靶序列进行特异性杂交并与固定化探针上的结合配偶体结合以将靶核酸捕获到载体上的核酸寡聚体。捕获寡聚体的一个实例包含两个结合区：序列结合区(例如靶特异性部分)和固定的探针结合区通常位于同一寡聚体上，尽管这两个区域可能存在于通过一或多个连接子连接在一起的两个不同的寡聚体上。捕获寡聚体的另一个实施例使用靶序列结合区，所述靶序列结合区包含随机或非随机的聚-GU、聚-GT或聚U序列以与靶核酸进行非特异性结合并将其连接到载体上的固定探针上。

如本文所用，“固定的寡核苷酸”、“固定的探针”、“固定的结合配偶体”、“固定的寡聚体”或“固定的核酸”是指将捕获寡聚体直接或间接地连接到载体的核酸结合配偶体。与载体连接的固定探针有助于将捕获探针结合的靶标与样品中未结合的物质分离。固定探针的一个实施例是与载体连接的寡聚体，其有助于将结合的靶序列与样品中未结合的物质分离。载体可以包含已知的材料(如不溶于溶液的基质和颗粒)，其可以由硝化纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷、聚丙烯、金属或其它组合物构成，其中的一个实施例可磁性吸引的粒子。载体可以是单分散磁球(例如，均匀大小+5％)，固定探针与所述单分散磁球直接连接(通过共价键、螯合或离子相互作用)或间接连接(通过一或多个连接子)，其中在杂交条件下，探针与载体之间的键或相互作用是稳定的。

“互补的”是指两个单链核酸的类似区域或同一单链核酸的两个不同区域的核苷酸序列具有核苷酸碱基组合物，所述核苷酸碱基组合物允许单链区域在严格的杂交或扩增条件下在稳定的双链氢键区域中杂交在一起。通过标准核酸碱基配对(例如，G:C、A:T或A:U配对)，彼此杂交的序列可以与预期靶序列完全互补或部分互补。“充分互补”是指能够通过一系列互补碱基之间的氢键键合与另一序列进行杂交的连续序列，所述互补碱基可以通过标准碱基配对在序列的每个位置上互补或可以含有一或多个残基，包含不互补的无碱基残基。充分互补的连续序列通常与将与寡聚体进行特异性杂交的序列至少80％或至少90％互补。“充分互补”的序列允许核酸寡聚物在合适的杂交条件下与其靶序列进行稳定杂交，即使所述序列并非完全互补的。当一个单链区的核苷酸的连续序列能够与其它单链区的核苷酸的类似序列形成一系列“规范”或“Watson-Crick”氢键结合的碱基对使得A与U或T配对并且C与G配对时，核苷酸序列是“完全”互补的(参见例如，Sambrook等人,《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)》,第2版(冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约,1989),所述文献根据§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57，具体地说§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57，其通过引用并入本文)。应理解，同一性百分比的范围包括所有整数和部分数字(例如，至少90％包含90、91、93.5、97.687等)。除非上下文另外指出，否则对特定序列的“互补体”的提及通常表示完全互补的序列。适当的杂交条件是本领域众所周知的，其可以基于序列组成来预测，或者可以通过使用常规测试方法来确定(参见例如，Sambrook等人,《分子克隆实验室手册》,第2版(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989),所述文献根据§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57，具体地说§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57，其通过引用并入本文)。

“摆动”碱基对是指G与U或T的配对。

“核酸杂交体”、“杂交体”或“双链体”是指含有双链区域、氢键合区域的核酸结构，其中所述区域足够稳定以允许在适当条件下分离或纯化双链体。此类杂交体可以包括RNA:RNA、RNA:DNA或DNA:DNA双链体分子等等。

“分离”或“纯化”是指样品的一个或多个组分被除去或与其它样品组分分离。样品组分包含常处于通常水性溶液相中的靶核酸，其也可以包含细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质和其它核酸。“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常，分离或纯化从其它样品组分中去除至少70％或至少80％或至少95％的靶核酸。

除非另外说明，否则提及“SEQ ID NO:X的序列”，特别是在权利要求书中，是指相应序列表条目的碱基序列，并且不需要主链的身份(包含但不限于RNA、2'-O-Me RNA、DNA或LNA)。此外，除非另外说明，否则出于序列表条目的目的，T和U残基应被认为是可互换的，例如，不论主题序列第六位的残基是T还是U，都认为所述主题序列与以T为第六核苷酸的SEQID NO相同。

B.捕获探针群体、方法和用途

本文提供了用于从样品中分离靶核酸的捕获探针群体，其包括：第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(r)序列，所述聚(r)序列包括(i)包括G和A核苷酸随机序列或(ii)非随机重复序列(A和G)；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(SBP)，其中所述SBP能够特异性结合第二特异性结合配偶体(SBP2)。“聚(r)”用作聚嘌呤(A和/或G)的缩写。在一些实施例中，聚(r)序列包括(i)包括G和A核苷酸的随机序列和(ii)非随机重复(A和G)序列。还提供了此类群体用于从混合物中纯化或分离靶核酸的用途，以及使用此类群体从混合物中纯化或分离靶核酸的方法。

捕获探针群体可以在不需要靶标中的特定序列的情况下结合靶核酸，因此可以用于捕获各种已知或未知的靶核酸。在一些实施例中，捕获探针例如通过与载体上的固定探针进行特异性结合而附着于所述载体。以这种方式，捕获探针连同靶核酸可以与其它样品组分分离。在一些实施例中，捕获探针群体包含包括非随机或随机聚合物序列的第一区域和包括特异性结合配偶体(SBP)的第二区域。聚合物序列与靶核酸非特异性地杂交，并且SBP与第二特异性结合配偶体(SBP2)结合，后者可以附接到固定的探针或载体上。捕获探针的一些实施例包含第一区域，所述第一区域包括由鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)核苷酸构成的随机聚合物序列，其可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或2'-O-甲基修饰的RNA残基(也被称为2'-O-Me核苷酸)。一些实施例包含一或多个碱基类似物(例如，肌苷、5-硝基吲哚)或随机聚合物序列中的无碱基位置。一些实施例包含含有一或多个聚(r)碱基序列的随机聚合物序列，即G和A碱基的随机混合物(例如参见《WIPO工业产权信息和文献手册(WIPOHandbook on Industrial Property Information and Documentation)》,标准ST.25(1998),表格1)。选择G碱基是因为其“摆动”特性，即G结合C或U/T。应理解，利用随机聚合物序列合成捕获探针提供了含有不同随机聚合物序列的寡核苷酸群体，所述随机聚合物序列由随机部分合成期间所包含的碱基构成。例如，包含由G和A构成的15nt随机聚合物序列的非特异性捕获探针群体由最多2¹⁵个唯一成员组成。

本文所述的非特异性捕获探针可以存在于许多不同的实施例中。在一些实施例中，探针可以由结构RP-SBP或SBP-RP表示，其中“RP”代表随机或重复序列(第一区域)，而“SBP”代表“特异性结合配偶体”(第二区域)。在这些代表性图中，SBP相对于RP以线性方式表示，但是本领域技术人员将理解，SBP可以在任何点连接到捕获探针的RP。因此，除非另外说明，否则第一区域和第二区域不一定彼此具有任何特定的空间关系。在RP由G和A碱基构成的实施例中，非特异性捕获探针可以由图示的结构(r)_x-SBP或SBP-(r)_x表示，其中“r”代表RP部分的G和A碱基，“x”代表r序列的长度(以nt为单位)，并且“SBP”代表“特异性结合配偶体”。尽管以线性方式示出了SBP和(r)_x序列，但是应该理解，SBP可以在任何点连接到捕获探针。在一些实施例中，第一区域包括(r)_x序列，其中x是2到30范围内的值，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些实施例中，包含但不限于当x小于约12时，第一区域包括(r)_y序列，其中x+y之和大于或等于约12。

在一些实施例中，第一区域包括非随机重复(A和G)序列。具体地，非随机重复序列可以包含直接重复或反向重复，或两者。因此，包括A和G核苷酸重复的这种重复序列的实例包含(AG)(GA)(AG)(GA)(AG)(GA)(SEQ ID NO:1)、(AG)(AG)(AG)(GA)(AG)(AG)(SEQ ID NO:2)、(AAG)(GAA)(GAA)(AAG)(SEQ ID NO:3)、(AAG)(AAG)(AAG)(AAG)(SEQ ID NO:4)等，其中括号表示组成重复，但不具有任何结构含义。在一些实施例中，非随机重复序列包括一或多个部分重复，例如，(AAG)(AAG)(AAG)(AAG)(A)(SEQ ID NO:5)。

第一区域可以由本文所述的聚(r)序列和任选的本文所述的连接子组成。可替代地，第一区域可以由本文所述的随机(A和G)序列和任选的本文所述的连接子组成。可替代地，第一区域可以由本文所述的非随机重复(A和G)序列、本文所述的聚(r)序列和任选的连接子(例如非核苷酸连接子(如C-9连接子)或核苷酸连接子(如任意序列，例如长度为约1-10个核苷酸))组成。

非特异性捕获探针的SBP组分可以是与可作为固定探针的一部分的SBP2特异性结合的特异性结合对的任何成员。适合用作SBP和SBP2成员的特异性结合对的一些实施例包含受体和配体对、酶和底物或辅因子对、酶和辅酶对、抗体(或抗体片段)和抗原对、糖和凝集素对、生物素和抗生物素蛋白或链霉亲和素、配体和螯合剂对、镍和组氨酸，以及完全或基本上互补的核酸序列。在一些实施例中，SBP和SBP2成员是基本上互补的核酸序列，如互补均聚序列，例如捕获探针包含与连接到载体的互补固定的SBP2序列进行杂交的3'基本均聚SBP序列。其它实施例使用非核酸结合对，如与作为SBP和SBP2成员的抗生物素蛋白或链霉亲和素特异性结合的生物素。

可以合成非特异性捕获探针的实施例以包含多种核酸构型中的任何一种，如标准DNA或RNA寡核苷酸，或包含一个或多个修饰键的寡核苷酸，其中糖部分具有取代(例如2'甲氧基或2'卤化物)或替代性构型(例如，锁定核酸(LNA)或蛋白质核酸(PNA)构型)中的一或多个位置。捕获探针的实施例可以包含非核苷酸化合物作为连接子(例如，C-9)，其连接捕获探针的随机聚合物和/或非随机重复片段。非特异性捕获探针的一些实施例包含使用2'-O-甲基修饰的RNA残基合成随机聚合物部分的探针或含有LNA构型中的一或多个残基的探针。可以根据预期的靶核酸或要分离的靶核酸的类型来选择包含在非特异性捕获探针的寡核苷酸部分中的一种或多种构型。例如，在随机聚合物区域中用2'-O-甲基修饰的RNA残基合成的非特异性捕获探针可用于捕获RNA靶标，而在随机聚合物区域中用某些LNA构型合成的非特异性捕获探针可用于捕获单链DNA(ssDNA)靶标。捕获探针的一些实施例包含构型的组合(例如，LNA和DNA)，其可以是相邻的或通过连接子进行连接。在一些实施例中，第一区域由2'-O-甲基修饰的RNA残基组成。

非特异性靶捕获方法相对快速且易于实施，在一些实施例中需要少于一个小时即可完成，而在一些实施例中靶捕获反应仅需要孵育5分钟。任选的步骤，如洗涤被捕获的核酸以进一步纯化核酸(例如，约另外20分钟)。

在一些实施例中，非特异性靶捕获涉及在基本上水性的溶液中和允许捕获探针与混合物中的靶核酸非特异性地杂交的条件下，将含有或疑似含有靶核酸的样品与本文所述的非特异性捕获探针混合。这种条件可以涉及短时间内升高温度(例如60℃持续约15分钟)，然后在室温下孵育(例如约20-25℃持续约10到90分钟)。可替代地，整个孵育可以在室温下进行并且基本上时间较短(例如，约5分钟)。混合物还可以包含固定的探针，所述固定探针通过SBP-SBP2特异性结合对与非特异性捕获探针特异性结合。固定探针可以与捕获探针同时或在捕获探针与样品混合之前或之后被引入混合物中。在一些实施例中，在将捕获探针与样品一起孵育之后，将固定探针引入样品与非特异性捕获探针的混合物中，以使捕获探针和靶核酸在捕获探针与固定探针结合之前在溶液相中非特异性地杂交。在其它实施例中，将固定探针与捕获探针基本上同时引入混合物中以使混合步骤最小化，这对于自动化系统特别有用。在使用具有尾部序列作为SBP的捕获探针的实施例中，捕获探针在核酸杂交条件下与固定探针中包含的互补序列(SBP2)特异性结合，以允许靶核酸非特异性地结合到捕获探针并通过固定探针连接到载体，从而与其它样品组分分离。

在其中捕获物与靶核酸非特异性杂交并与固定探针特异性结合的孵育后，通过将带有附着复合物的载体与溶液相分离，将由固定探针、捕获探针和靶核酸构成的复合物与其它样品组分分离。然后，可以任选地执行一个或多个洗涤步骤以去除可能已经附着到复合物、复合物的组分或载体上的非核酸样品组分。在一些实施例中，进行以下洗涤步骤：用基本上水性的洗涤溶液洗涤附着于载体的复合物，所述洗涤溶液将杂交复合物保持在载体上，然后将附着于载体的复合物与含有其它样品组分的洗涤溶液分离。可以在进行随后的测定步骤之前将被捕获的靶核酸与其它复合物组分中的一个或多个分离，或者可以将附着于载体的复合物直接用于后续一个或多个步骤。后续步骤包含，例如，使用检测探针对被捕获的核酸进行检测，和/或对包含在被捕获的核酸中的一或多个序列进行体外扩增。

尽管包含在非特异性捕获探针中的一或多个连续随机序列的长度可以变化，但是约12nt或更长的聚(r)序列足以高效地靶捕获许多靶标。非特异性捕获探针中的随机聚(r)序列之间存在非随机寡核苷酸或非核苷酸间隔物可能影响靶捕获效率。包含LNA构型中的随机聚-(r)序列的至少一部分的非特异性捕获探针可以比具有DNA构型中类似长度的非特异性捕获探针更有效地靶捕获ssDNA，并且包含LNA和DNA残基混合物的非特异性捕获探针可以比包含LNA构型中的所有聚(r)序列的非特异性捕获探针更有效。与双链DNA(dsDNA)的靶捕获相比，包含LNA构型中的随机聚(r)序列的至少一部分的非特异性捕获探针可以更有效地靶捕获RNA和ssDNA。与通过使用2'-甲氧基RNA碱基合成相同长度的随机聚(r)序列的捕获探针相比，包含LNA构型中的随机聚(r)序列的至少一部分的非特异性捕获探针可以更有效地靶捕获RNA。这些通用参数可用于选择用于捕获预期的靶核酸或靶核酸类型的捕获探针群体的合适实施例，可以通过使用如以下实例中所述的标准程序测试所述靶核酸，以选择非特异性捕获探针和提供期望的靶捕获结果的条件。

固定的探针可以通过在靶捕获方法中使用的杂交条件下稳定的任何键与载体连接。一些实施例使用单分散颗粒的载体，可以通过使用已知的方法(例如，离心、过滤、磁吸引或其它物理或电化学分离)从混合物中取回所述单分散颗粒。在一些实施例中，单分散颗粒是磁性微珠。在一些实施例中，使用磁吸引从混合物中取回颗粒。在一些实施例中，将被捕获的靶核酸分离并浓缩在载体上，即，与初始样品中靶核酸的浓度相比，靶核酸被浓缩在载体上，这可以提高使用被捕获的核酸进行的后续测定步骤的灵敏度，如扩增测定步骤。

可以使用本文所述的靶捕获探针群体和方法从同一样品中同时分离出多个(例如，两个或多个)靶核酸，因为非特异性捕获探针与样品中存在的一种以上核酸结合。在一些实施例中，可以设计和选择非特异性捕获探针以用于从含有核酸(例如，DNA和RNA)混合物的样品中优先捕获特定类型的核酸(例如，RNA)。在一些实施例中，通过设计捕获探针以选择性地结合不同的固定探针，可以将非特异性捕获探针从混合物中选择性地移除，所述固定探针被引入到混合物中并随后与含有捕获探针和靶核酸的附着复合物分离。例如，优先与DNA和RNA混合物中的RNA结合的第一非特异性捕获探针可以通过第一SBP与第一载体上的第一固定SBP2结合，而优先与DNA和RNA混合物中的DNA结合的第二非特异性捕获探针可以通过第二SBP与第二载体上的第二固定SBP2结合。然后，通过选择性地将第一载体和第二载体及其附着复合物去除到测定系统的不同区域或在测定期间的不同时间，可以将样品的RNA组分与同一样品的DNA组分选择性地分离。

在示例性实施例中，通过将靶核酸或其溶液与基本水性溶液(例如，含有盐和螯合剂的缓冲溶液)混合来制备样品。将样品的一部分与基本水性溶液中含有的试剂、非特异性靶捕获探针和附接到载体(例如，磁性颗粒)的固定探针混合以制备靶捕获混合物。将靶捕获混合物在合适的温度下孵育，以形成由非特异性捕获探针、靶核酸和附接到载体的固定探针构成的捕获复合物。然后将载体上的复合物与溶液相分离。任选地洗涤载体上的复合物以除去溶液相的剩余部分，并将载体上的复合物与洗涤溶液分离。检测与载体缔合的靶核酸，以定性检测或定量测量与其它样品组分分离的靶核酸的数量。将理解的是，靶捕获混合物中可以包含另外的寡核苷酸，如辅助寡核苷酸(美国专利第5,030,557号,Hogan等人)和/或扩增引物。

可以使用体外方法来合成非特异性靶捕获探针(例如，Caruthers等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,第154卷,第287页(1987)；美国专利第5,252,723号,Bhatt；WO92/07864,Klem等人)。可以使用LNA构型或含有此类结构组合的寡核苷酸中的标准RNA碱基和键、DNA碱基和键、具有2'甲氧基键的RNA碱基、DNA碱基来制备合成的寡核苷酸。可以合成寡核苷酸以包含非核苷酸间隔物(例如，C-9)或核酸类似物(例如，肌苷或5-硝基吲哚)。在一些实施例中，捕获探针的一个或多个非特异性部分通常含有作为随机“r”残基(即，G或A碱基)的一个位置或一系列位置。在一些实施例中，通过使用含有等量的G和A碱基的混合物合成随机r残基。非特异性捕获探针的一些实施例包含含有与靶核酸进行非特异性杂交的第一区域的5'部分和例如由dT_0-3dA_18-30(SEQ ID NO:9)构成的3'DNA“捕获尾部”序列，如dT₃dA₃₀(SEQ ID NO:10)或dA₃₀(SEQ ID NO：11)序列。捕获尾部分(有时也简称为尾部)允许捕获探针(带有或不带有结合的靶核酸)与附着在聚dT寡聚体上的载体缔合，并与靶捕获混合物的溶液相分离。将理解的是，任何“尾部”序列或非核酸特异性结合配偶体(SBP)可以附接到非特异性捕获探针，并且载体(SBP2)上所选择的特异性结合配偶体是具有SBP的特异性结合对的成员。

本文所述的非特异性捕获探针的实施例使用以下命名法以5'到3'定向缩写寡核苷酸组分的结构。含有一或多个随机G或A碱基残基的寡核苷酸使用术语“(r)_x”，其中“r”代表G和A的随机分类，并且“x”表示G和A残基的随机分类中的位置数。如果寡聚体使用带有2'-甲氧基键主链的RNA碱基，则术语也可以包含“2'-Ome”，以表示G和A碱基的随机分类的修饰键，例如2'-Ome-(r)_x。如果寡核苷酸使用标准DNA键，则术语可以包含“d”以表示G和A碱基的随机分类的DNA，例如d(r)_x，而如果寡聚体使用具有锁定核酸(LNA)构型的DNA碱基，则术语包含“L”以表示G和A碱基的随机分类的LNA构型，例如L(r)_x。由不同部分的组合构成的寡核苷酸可以包含这些术语中的一或多个以限定整个结构。例如，以5'到3'定向的由六个具有标准DNA键的随机G和A碱基(r碱基)、三个具有标准DNA键的T碱基和五个具有标准DNA键的随机G和A碱基(r碱基)构成的寡核苷酸将被缩写为d(r)₆-dT₃-d(r)₅(SEQ ID NO:12)。又例如，以5'到3'定向的由五个具有LNA键的随机G和A碱基、三个具有DNA键的A碱基和四个具有DNA键的随机G和A碱基构成的寡核苷酸将被缩写为L(r)₅-dA₃-d(r)₄(SEQ ID NO:13)。又例如，以5'到3'定向的由十个具有2'-甲氧基键的随机G和A碱基和三十个具有标准DNA键的A碱基的3'尾部构成的寡核苷酸将被缩写为2'-Ome-(r)₁₀-dA₃₀(SEQ ID NO:14)。

在一些实施例中，提供了如上所述的捕获探针群体和第二捕获探针群体的组合，所述第二捕获探针群体包括：第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括聚(k)序列，所述聚(k)序列包括(i)包括G和U/T核苷酸的随机序列或(ii)非随机重复(G和U/T)序列；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(SBP3)，其中所述SBP3能够特异性结合第四特异性结合配偶体(SBP4)。Becker等人在US 2013/0209992(2013年8月15日)中描述了示例性第二群体，所述专利通过引用并入本文。可以使用与上面讨论的(r)_x命名法平行的(k)_x命名法来描述第二群体的捕获探针。“G和U/T核苷酸”包含(i)G和U核苷酸、(ii)G和T核苷酸或(iii)G、U和T核苷酸。类似地，非随机重复(G和U/T)序列中的重复可以包含(i)G和U核苷酸、(ii)G和T核苷酸或(iii)G、U和T核苷酸，并且(GU)和(GT)等序列被认为是彼此重复，尽管前者中存在U，而后者中存在T。第二捕获探针群体可以包含RNA、DNA、LNA和/或2'-O-甲基修饰的RNA残基。SBP4可以是以上关于SBP2描述的任何实施例，并且不一定与SBP2相同。

在一些实施例中，(包括聚(r)序列的群体的)SBP和第二群体的SBP3能够结合相同SBP2/SBP4，即，同一实体既可以充当SBP2又可以充当SBP4。例如，SBP2/SBP4可以是聚T序列，并且SBP和SBP3可以独立地是dA₃₀(SEQ ID NO:11)或dT₃dA₃₀(SEQ ID NO：10)序列。在一些实施例中，SBP和SBP3彼此相同。

在一些实施例中，在进一步包括固定在载体上的SBP2的反应混合物或试剂盒中提供本文所公开的捕获探针群体或组合。上面讨论了SBP2的实例。试剂盒的反应混合物或组分可以以干燥形式或以溶液相提供。在一些实施例中，溶液相包括洗涤剂，如十二烷基硫酸锂或十二烷基硫酸钠。在一些实施例中，溶液相包括碱基，如氢氧化锂。

可以使用本文所公开的群体、组合、反应混合物和试剂盒从各种类型的样品中分离靶核酸。在一些实施例中，样品来自动物来源(例如，人、非人类脊椎动物、非人类哺乳动物)、环境来源(例如，水、植物、土壤)、食物来源(例如，食品、食物制备区域)或工业来源(例如生物反应器、细胞培养皿、制药器皿、生物试剂、药物试剂)。示例性动物或人类来源包含外周血、血清、血浆、脑脊髓液、痰或拭子标本(例如，鼻咽、口腔、伤口、***或***分泌物)。因此，在一些实施例中，反应混合物进一步包括样品(如前述任一种)。在一些实施例中，靶核酸与反应混合物中的靶捕获探针群体的成员缔合。靶核酸可以是病毒、原核、真核或合成来源或其组合，并且可以是DNA、RNA、经过修饰的核酸或其组合。

包含实例以描述所公开的非特异性靶标捕获方法和组合物的实施例。下文描述的靶标捕获程序中的示例性试剂如下，尽管分子生物学领域的技术人员将理解，许多不同的试剂可用于执行所述反应和测试的基本步骤。运样试剂：110mM十二烷基硫酸锂(LLS)、15mMNaH₂PO₄、15mM Na₂HPO₄、1mM EDTA、1mM EGTA，pH值为6.7。靶捕获试剂(TCR)：250mM HEPES、1.88M LiCl、310mM LiOH、100mM EDTA，pH值为6.4,和250μg/ml的磁性颗粒(0.7-1.05μ颗粒、Sera-Mag^TM MG-CM)以及与其共价结合的(dT)₁₄寡聚体。洗涤溶液：10mM HEPES、150mMNaCl、6.5mM NaOH、1mM EDTA、0.3％(v/v)乙醇、0.02％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯和0.1％(w/v)月桂基硫酸钠，pH值为7.5。杂交试剂：100mM琥珀酸、2％(w/v)LLS、100mM LiOH、15mM aldrithiol-2、1.2M LiCI、20mM EDTA和3.0％(v/v)乙醇，pH值为4.7。选择试剂：600mM硼酸、182.5mM NaOH、1％(v/v)辛苯聚醇(X-100)，pH值为8.5或pH值为9.2，以水解未杂交的检测探针寡聚体上的标记物。检测试剂包括检测试剂I：1mM硝酸和32mM H₂O₂，以及检测试剂II：1.5M NaOH，以从标记物产生化学发光(参见美国专利第5,283,174号、第5,656,744号和第5,658,737号)。

可以通过使用任何检测核酸的方法来检测被捕获的靶核酸。例如，可以通过使用选择性地结合一般核酸或选择性地结合特定形式的核酸的染料来检测被捕获的核酸。可以通过结合与被捕获的核酸中的靶序列进行特异性杂交的检测探针来检测特异性核酸，或者可以通过体外核酸扩增处理被捕获的核酸中的靶序列以扩增被捕获的核酸的部分，随后检测所述部分。在一些实施例中，通过将样品中的靶核酸与特异性检测探针进行杂交来对所述靶核酸进行标记。检测探针杂交可以发生在靶捕获之前、与靶捕获同时发生和/或发生在靶捕获之后。通过使用在别处详细描述的众所周知的程序，用吖啶酯(AE)化合物标记示例性形式的检测探针，所述化合物在均相系统中产生化学发光信号(表示为相对光单位或“RLU”)(美国专利第5,658,737号，参见第25栏,第27-46行，和Nelson等人,1996,《生物化学(Biochem)》35:8429-8438,8432处)。

这一描述和示例性实施例不应被视为限制。出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另外说明，否则在所有情况下，应将表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求书中使用的其它数值理解为由术语“约”修饰(如果尚未对其进行修改)。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求书中列出的数字参数是近似值，其可以根据试图获得的期望特性而变化。至少，并且并非试图将等同原则的应用限制于权利要求书的范围，每个数字参数至少应根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。

实例

提供以下实例以说明某些公开的实施例，并且以下实例不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。

实例1—使用(r)₁₈和(k)₁₈/(r)₁₈捕获探针回收短DNA片段

本实例说明了含(r)₁₈和含(k)₁₈靶捕获探针群体自身或彼此结合用于捕获短DNA片段的用途。实验中使用的(k)₁₈和(r)₁₈捕获探针包括靶杂交序列(随机(k)₁₈和(r)₁₈，其中核苷酸残基含有2'-甲氧基核糖)和直接连接到靶杂交序列((k)₁₈或(r)₁₈序列)的3'末端的捕获尾，由此形成如下所示的连续核酸序列。

(r)₁₈捕获探针序列：

5'-RRRRRRRRRRRRRRRRRRTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO:6)

(k)₁₈捕获探针序列：

5'-KKKKKKKKKKKKKKKKKKTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO:7)

包含聚A核苷酸的链段以使捕获探针与涂覆有聚T核苷酸链段的磁性微颗粒进行杂交。捕获探针的一端与磁性微颗粒进行杂交，并且捕获探针的另一端与靶核酸进行非特异性杂交。通过施加磁场，将缔合有捕获探针和靶核酸的微颗粒从溶液中分离出来。

在此实验中，对应于腺病毒1六邻体基因的区域的500bp DNA片段(也被称为腺病毒基因块)被用作靶核酸以测量(k)₁₈捕获探针自身、(r)₁₈捕获探针自身、或(k)₁₈/(r)₁₈捕获探针混合物用以捕获短DNA片段的能力。腺病毒基因块的序列如下：

ATGTGCCTTACCGCCAGAGAACGCGCGAAGATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTCGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCTCAGCGTTTGACGCTGCGGTTTATCCCCGTGGACCGCGAGGATACCGCATACTCGTACAAGGCGCGGTTTACCCTGGCTGTGGGTGACAACCGTGTGCTTGACATGGCTTCCACATACTTTGACATTCGCGGCGTGCTGGACCGGGGCCCCACTTTTAAGCCCTACTCCGGCACTGCCTACAACGCTCTAGCCCCCAAAGGCGCTCCCAATTCCTGCGAGTGGGAACAAGAAGAACCAACTCAGGAAATGGCTGAAGAACTTGAAGATGAGGAGGAGGCAGAGGAGGA(SEQ ID NO:8)。通过对腺病毒基因组的所述区域具有特异性的实时PCR测定法测量腺病毒基因块的回收率。

将腺病毒基因块以每mL约13,888个拷贝的浓度引入到包括腺病毒阴性鼻咽(NP)拭子标本库的基质中。这些NP标本含有生理水平的非腺病毒背景核酸。对含腺病毒基因块的NP标本进行处理以使双链DNA变性。将72μL含腺病毒基因块的NP标本(含有约1000份腺病毒基因块拷贝)在体积为936μL的最终反应物中孵育，所述最终反应物含有100μg涂有聚T的磁性微颗粒和以下之一：a)20皮摩尔的(k)₁₈靶捕获探针；b)20皮摩尔的(r)₁₈靶捕获探针；或c)10皮摩尔的(k)₁₈靶捕获探针加10皮摩尔的(r)₁₈靶捕获探针。通过施加磁场将磁性微颗粒和结合的核酸从溶液中分离出来，从而将上清液从被捕获的靶:捕获探针:磁性微颗粒组合中去除。然后将磁性微颗粒重悬于洗涤溶液中。对重悬的微颗粒再进行一轮分离，除去上清液，并将其重悬在洗涤溶液中。分离并去除第二轮洗涤溶液后，将微颗粒在50μL洗脱缓冲液(水中含防腐剂的5mM Tris)中孵育，所述洗脱缓冲液破坏核苷酸杂交。通过施加磁场分离磁性颗粒，并回收含有洗脱物的核酸。

通过实时PCR测定每个含有洗脱物的核酸的腺病毒基因块的回收率。作为对照，以代表100％回收的拷贝水平测定了未进行靶捕获的纯腺病毒基因块(表1中的“直接尖峰”)。根据实时PCR扩增曲线超过固定阈值(CT)的循环数推断出回收的腺病毒基因块的拷贝水平。表1列出了CT值，并估计了使用不同靶捕获探针的腺病毒基因块的回收百分比。

表1.腺病毒基因块的回收

该实验表明，(r)₁₈捕获探针能够更好地捕获DNA的短序列。重要的是，在(r)₁₈捕获探针上添加(k)₁₈捕获探针不会干扰腺病毒基因块的回收，并且使用10皮摩尔的R18捕获探针(与10皮摩尔的(k)₁₈捕获探针组合)与使用20皮摩尔的(r)₁₈捕获探针产生相似的结果。当(r)₁₈靶捕获探针和(k)₁₈靶捕获探针在捕获反应中混合在一起时，二者是兼容的。

实例2—使用(k)₁₈/(r)₁₈捕获探针从临床标本中回收腺病毒核酸

该实例证明，与仅使用(k)₁₈靶捕获探针相比，使用(k)₁₈靶捕获探针与(r)₁₈靶捕获探针的组合((k)₁₈/(r)₁₈混合物)从临床标本中回收腺病毒核酸的效率提高。本研究中使用的临床样品是鼻咽(NP)拭子标本。在本实验中使用的(r)₁₈和(k)₁₈捕获探针如上文实例1所述。

在本实验中，用(k)₁₈/(r)₁₈混合物或仅用(k)₁₈处理49个临床NP标本，通过对比测定已知所述标本为腺病毒阳性。简而言之，对NP标本进行处理以使双链DNA变性。将NP标本在体积为936μL的最终反应物中孵育，所述最终反应物含有100μg涂有聚T的磁性微颗粒和以下之一：a)20皮摩尔的(k)₁₈靶捕获探针或b)10皮摩尔的(k)₁₈靶捕获探针加10皮摩尔的(r)₁₈靶捕获探针。通过施加磁场将磁性微颗粒和结合的核酸从溶液中分离出来，从而将上清液从被捕获的靶:捕获探针:磁性微颗粒组合中去除。然后将磁性微颗粒重悬于洗涤溶液中。对重悬的微颗粒再进行一轮分离，除去上清液，并将其重悬在洗涤溶液中。分离并除去第二轮洗涤溶液后，将微颗粒在50μL洗脱缓冲液中孵育，所述洗脱缓冲液破坏核苷酸杂交。通过施加磁场分离磁性颗粒，并回收含有洗脱物的核酸。

通过实时PCR测定每个含有洗脱物的核酸的腺病毒核酸的回收率。通过比较实时PCR曲线超过固定阈值(CT)的循环数，可以推断出腺病毒核酸回收率在两种测试条件之间的相对差异。增量CT(ΔCT)为(k)₁₈/(r)₁₈混合物提取的CT减去仅(k)₁₈提取的CT。负ΔCT表明(k)₁₈/(r)₁₈混合物回收更多的腺病毒核酸而正ΔCT表明仅(k)₁₈回收更多的腺病毒核酸。图1绘制了所有49个临床标本的ΔCT。

数据表明，(k)₁₈/(r)₁₈混合物在49个标本中的39个中回收更多的腺病毒核酸。在这些标本中，平均ΔCT为-0.64，其表示使用(k)₁₈/(r)₁₈混合物的腺病毒核酸回收率增加了56％。在所有49个标本中，平均ΔCT为-0.46，其表示使用(k)₁₈/(r)₁₈混合物的腺病毒DNA回收率增加了38％。

序列表

<110> 简·探针公司(GEN-PROBE INCORPORATED)

<120> 用于分离靶核酸的组合物和方法

<130> 01159-0016-00PCT

<150> US 62/504,900

<151> 2017-05-11

<160> 14

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性非随机重复序列

<400> 1

aggaaggaag ga 12

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性非随机重复序列

<400> 2

agagaggaag ag 12

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性非随机重复序列

<400> 3

aaggaagaaa ag 12

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性非随机重复序列

<400> 4

aagaagaaga ag 12

<210> 5

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性非随机重复序列

<400> 5

aagaagaaga aga 13

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (r)18捕获探针序列

<400> 6

rrrrrrrrrr rrrrrrrrtt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 51

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (k)18捕获探针序列

<400> 7

kkkkkkkkkk kkkkkkkktt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 51

<210> 8

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 腺病毒1六邻体的500 bp DNA片段

<400> 8

atgtgcctta ccgccagaga acgcgcgaag atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg 60

tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag 120

ttcgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc ctgaataaca agtttagaaa ccccacggtg 180

gcgcctacgc acgacgtgac cacagaccgg tctcagcgtt tgacgctgcg gtttatcccc 240

gtggaccgcg aggataccgc atactcgtac aaggcgcggt ttaccctggc tgtgggtgac 300

aaccgtgtgc ttgacatggc ttccacatac tttgacattc gcggcgtgct ggaccggggc 360

cccactttta agccctactc cggcactgcc tacaacgctc tagcccccaa aggcgctccc 420

aattcctgcg agtgggaaca agaagaacca actcaggaaa tggctgaaga acttgaagat 480

gaggaggagg cagaggagga 500

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 非特异性捕获探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> t在每个位置都存在或不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(30)

<223> a在每个位置都存在或不存在

<400> 9

tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 非特异性捕获探针

<400> 10

tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 33

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 非特异性捕获探针

<400> 11

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 30

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性寡核苷酸

<400> 12

rrrrrrtttr rrrr 14

<210> 13

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> 锁定核酸（LNA）构型

<400> 13

rrrrraaarr rr 12

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(10)

<223> 2'-甲氧基键

<400> 14

rrrrrrrrrr aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40