阅读说明：本技术 淀粉样蛋白β分解排出促进剂 (Amyloid beta decomposition/excretion promoter ) 是由 山本征辉 三泽幸一 石田惠子 西村瞳 于 2018-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种安全性高且可持续地摄取的淀粉样蛋白β分解排出促进剂。该淀粉样蛋白β分解排出促进剂以绿原酸类或其盐为有效成分。(The invention provides an amyloid beta decomposition/excretion promoter which is highly safe and can be ingested continuously. The amyloid beta decomposition/excretion promoter contains chlorogenic acids or salts thereof as an active ingredient.)

淀粉样蛋白β分解排出促进剂

技术领域

本发明涉及一种促进淀粉样蛋白β的分解和排出的淀粉样蛋白β分解排出促进剂。

背景技术

阿尔茨海默病是以记忆/学***成25年度厚生劳动省国民生活基础调查)，另外，预测其患者数量随着高龄化而今后也世界性地迅速增加，因此，谋求紧急的对策。但是，目前对阿尔茨海默病没有有效的预防、治疗方法，谋求新的化合物或预防/治疗方法的开发。

阿尔茨海默病的病理学的特征为老人斑和神经原纤维变化，可知老人斑为淀粉样蛋白β蛋白质进行凝集和纤维化而蓄积于细胞外而形成的斑，一直以来，作为形成其发病和病态进展的核心的机制，淀粉样蛋白假说备受关注。淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)通过酶反应而阶段性地被切断从而产生淀粉样蛋白β，这些物质在细胞外不溶化、凝集、蓄积而对神经传递等神经功能带来障碍，由此症状进展且阿尔茨海默病发病(非专利文献1)。

淀粉样蛋白β虽然其详细的作用不清楚，但是，已知有即使健康人也随着年龄增长而其产生增加。在脑内和末梢组织中产生淀粉样蛋白β，但脑内的浓度通过动态平衡机制的作用、特别是从脑向末梢的清除机制而较低地被抑制。在淀粉样蛋白β的清除中存在各种各样的经路，但作为代表的经路，已知有经由存在于脑血管的输送体low-density lipo-protein receptor-related protein(LRP1)等的排出机制。即，维持适当保持脑内的淀粉样蛋白β的产生、排出的动态平衡对健康的脑功能的维持是重要的，认为这样的机制因任何原因而破坏时，导致阿尔茨海默病的发病(非专利文献2)。

以往以及现在开发中的以淀粉样蛋白β的产生为原因的阿尔茨海默病的预防和治疗方法，其大部分基于淀粉样蛋白假说，以APP的切断酶阻碍、淀粉样蛋白β的中和、淀粉样蛋白β的凝集阻碍、分解促进等为中心正在进行物质探索。例如报道有作为源自天然物的成分的类黄酮的槲皮素或山奈酚具有淀粉样蛋白β的凝集阻碍作用(专利文献1)，从钩藤属植物提取物中分离出的化合物具有凝集淀粉样蛋白β的分解作用(专利文献2)等。

但是，仅淀粉样蛋白β的产生抑制或凝集抑制作用难以除去已经蓄积的淀粉样蛋白β，另外，即使将淀粉样蛋白β分解，如果不能将它们排出，则难以得到治疗的效果。另外，淀粉样蛋白β抗体疗法也有副作用的出现等，迄今为止没有达到利用这些方法对阿尔茨海默病可以看到明确的有效性。

另一方面，绿原酸类在植物中在咖啡豆和马铃薯等中被发现，迄今为止报道有抗氧化作用、降血压作用等(专利文献3)。另外，报道有将2个咖啡酸以酯键合而成的二-O-咖啡酰奎宁酸具有神经细胞保护作用(专利文献4)。

但是，绿原酸类具有淀粉样蛋白β的分解和排出促进作用还没有被报道。

(专利文献1)日本特开2007-145839号公报

(专利文献2)日本特表2004-514679号公报

(专利文献3)日本特开2002-53464号公报

(专利文献4)国际公开第2007/091613号

(非专利文献1)Hardy JA等，Science.1992；256：184

(非专利文献2)Zlokovic BV等，Nature Review.2011；12：723

发明内容

本发明为以下的1)～14)涉及的发明。

1)一种淀粉样蛋白β分解排出促进剂，其以绿原酸类或其盐为有效成分。

2)一种阿尔茨海默病的预防、治疗或改善剂，其以绿原酸类或其盐为有效成分。

3)一种淀粉样蛋白β分解排出促进用食品，其以绿原酸类或其盐为有效成分。

4)一种阿尔茨海默病的预防或改善用食品，其以绿原酸类或其盐为有效成分。

5)绿原酸类或其盐在制造淀粉样蛋白β分解排出促进剂中的用途。

6)绿原酸类或其盐在制造阿尔茨海默病的预防、治疗或改善剂中的用途。

7)绿原酸类或其盐在制造淀粉样蛋白β分解排出促进用食品中的用途。

8)绿原酸类或其盐在制造阿尔茨海默病的预防或改善用食品中的用途。

9)一种用于淀粉样蛋白β的分解排出促进的绿原酸类或其盐。

10)一种用于阿尔茨海默病的预防、治疗或改善的绿原酸类或其盐。

11)绿原酸类或其盐在分解排出促进淀粉样蛋白β中的非治疗性用途。

12)绿原酸类或其盐在预防或改善阿尔茨海默病中的非治疗性用途。

13)一种淀粉样蛋白β的分解排出促进方法，其将绿原酸类或其盐以有效量给药或摄取至需要它们的对象。

14)一种阿尔茨海默病的预防、治疗或改善方法，其将绿原酸类或其盐以有效量给药或摄取至需要它们的对象。

附图说明

图1是表示利用绿原酸类的凝集淀粉样蛋白的分解活性的图。

图2是表示绿原酸类的继续摄取所产生的淀粉样蛋白β排出输送体(LRP1、p-gp)增加作用的图。

图3是表示绿原酸类的继续摄取所产生的淀粉样蛋白β的脑内蓄积抑制作用的图(淀粉样蛋白β的观察像)。

图4是表示绿原酸类的继续摄取所产生的淀粉样蛋白β的海马体中的蓄积抑制作用的图(淀粉样蛋白β的蓄积比例)。

图5是表示绿原酸类的继续摄取所产生的记忆学习能力改善作用的图(新奇物体认识试验)。

图6是表示绿原酸类的继续摄取所产生的记忆学习能力改善作用的图(莫里斯水迷路试验)。

具体实施方式

本发明涉及提供一种安全性高且可持续地摄取的淀粉样蛋白β分解排出促进剂。

本发明的发明人对可以长期服用或摄取的安全性高的成分进行了各种研究，结果发现：绿原酸类兼具优异的淀粉样蛋白β的分解促进作用和排出促进作用；另外，在阿尔茨海默病模型动物中，不仅对阿尔茨海默症的预防是有效的，而且对改善也是有效的。

根据本发明，能够提供一种促进淀粉样蛋白β的分解和排出、对阿尔茨海默病的预防、治疗或改善有用的医药品、食品。

本发明中的“绿原酸类”是指3-咖啡酰奎宁酸(3-CQA)、4-咖啡酰奎宁酸(4-CQA)以及5-咖啡酰奎宁酸(5-CQA)的单咖啡酰奎宁酸、和3-阿魏酰奎宁酸(3-FQA)、4-阿魏酰奎宁酸(4-FQA)以及5-阿魏酰奎宁酸(5-FQA)的单阿魏酰奎宁酸的总称。绿原酸类的含量基于上述6种合计量进行定义。

本发明的“绿原酸类”只要含有上述6种绿原酸类中的至少1种即可，从淀粉样蛋白β的分解排出促进作用方面考虑，优选含有单咖啡酰奎宁酸，更优选至少含有5-咖啡酰奎宁酸。5-咖啡酰奎宁酸的含量在绿原酸类中优选为10质量％以上，更优选为20质量％以上，更优选为30质量％以上，进一步优选为40质量％以上。

绿原酸类可以为盐的形态，作为盐可以列举药学上可接受的盐、例如钠、钾等碱金属盐、镁、钙等碱土金属盐、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等有机胺盐、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸盐等。

本发明的绿原酸类或其盐可以使用含有其的植物的提取物、其浓缩物或这些精制物等。作为这种植物提取物，例如可以列举从向日葵籽、苹果未熟果、咖啡豆、番薯叶、松科植物的球果、松科植物的种子壳、马铃薯、甘薯、甘蔗、小麦、南天竹的叶、牛蒡、胡萝卜、卷心菜、生菜、洋蓟、西红柿、台湾黄麻(Mulukhiyya)、茄子皮、梨、李子、桃子、杏、樱桃、梅子的果实、款冬、葡萄科植物等中提取的物质。其中，从绿原酸类含量等方面考虑，优选咖啡豆提取物，可以为深烘焙咖啡豆(L值：16.8以下)，更优选为中烘焙咖啡豆(L值：超过16.8且为24.2以下)、浅烘焙咖啡豆(L值：超过24.2且为30.2以下)、微烘焙咖啡豆(L值：超过30.2)或生咖啡豆，进一步优选生咖啡豆。这里，“L值”是指将黑设为L值0、另外将白设为L值100，用色差计测定烘焙咖啡豆的明度所得的值。作为咖啡的树的种类，可以为阿拉比卡种、罗布斯塔种、利比瑞卡种及阿拉巴斯塔种(Arabusta)中的任意种。

咖啡豆提取物优选除去了咖啡因的物质，但从风味的观点考虑，优选咖啡因和绿原酸类的质量比(咖啡因/绿原酸类)为0.05以下，更优选为0.03以下，进一步优选为0.02以下，进一步优选为0.005以下，进一步优选为0.003以下，进一步优选为0.001以下。予以说明，咖啡因/绿原酸类的比的下限没有特别限定，可以为0。

就咖啡豆提取物而言，从风味的观点考虑，优选钾(K)和钠(Na)之和与绿原酸类的质量比[(K+Na)/绿原酸类]为0.18以下，进一步优选为0.14以下，进一步优选为0.1以下，尤其进一步优选为0.06以下。予以说明，质量比[(K+Na)/绿原酸类]的下限没有特别限定，可以为0，从生产效率的观点考虑，优选为0.0001，进一步优选为0.001。

作为本发明中所使用的咖啡豆提取物的优选的实例，可以列举咖啡因与绿原酸类的质量比(咖啡因/绿原酸类)为0.02以下、且绿原酸类总量中的5-咖啡酰奎宁酸的含量(5-CQA/全绿原酸类)为40质量％以上的生咖啡豆提取物。作为更优选的实例，可以列举(咖啡因/绿原酸类)为0.001以下、并且(5-CQA/全绿原酸类)为40质量％以上的生咖啡豆提取物。

本发明的绿原酸类或其盐的提取、浓缩、精制的方法、条件没有特别限定，可以采用公知的方法和条件。其中，优选利用抗坏血酸水溶液、柠檬酸水溶液或热水进行提取。

另外，可以使用市售的含绿原酸类的制剂作为绿原酸类或其盐的原料，例如可以列举Flavor holder(フレーバーホルダー)RC(长谷川香料(株))、生咖啡豆提取物P(Oryza油化公司生产)、SVETOL(Nurex Inc.生产)、OXCH100(东洋发酵公司生产)等。

如后述的实施例所示，绿原酸类具有凝集淀粉样蛋白β的分解作用，并且在海马体中，增强淀粉样蛋白β排出输送体基因(LRP1基因和p-gp基因)的表达，抑制淀粉样蛋白β的脑内蓄积。进而确认，绿原酸类在阿尔茨海默病模型动物中发挥记忆学习能力改善效果。

因此，绿原酸类或其盐可以成为淀粉样蛋白β分解排出促进剂、阿尔茨海默病的预防、治疗或改善剂，能够使用于促进淀粉样蛋白β的分解和排出，能够使用于预防、治疗或改善阿尔茨海默病，另外，可以在制造淀粉样蛋白β分解排出促进剂、阿尔茨海默病的预防、治疗或改善剂中使用。

这里，“使用”可以为对人或非人动物的给药或摄取，另外，可以为治疗的用途，也可以为非治疗性用途。另外，“非治疗性”是不包括医疗行为的概念，即不包括对人进行手术、治疗或诊断的方法的概念，更具体而言，是不包括医师或受到医师的指示的人对人实施手术、治疗或诊断的方法的概念。

本发明中，“淀粉样蛋白β的分解排出促进”意指：促进蓄积于脑内的凝集淀粉样蛋白β蛋白质的分解，且促进淀粉样蛋白β蛋白质从脑内排出而抑制脑内蓄积。

另外，本发明中，“阿尔茨海默病”意指：起因于脑内的淀粉样蛋白β的增加/蓄积的认知障碍(记忆障碍、迷失障碍、学习障碍、注意障碍、空间认知功能等)和人格的变化、另外呈现社会上不能适应等的症状的痴呆性疾病。

本说明书中，“预防”是指：个体中的疾病或症状的发病的防止或延缓、或使个体的疾病或症状的发病的危险性降低。

另外，“改善”是指：疾病、症状或状态的好转、疾病、症状或状态的恶化的防止或延缓、或疾病或症状的进展的逆转、防止或延缓。

另外，在“治疗”中，除疾病的完全治癒之外，还包含改善症状。

本发明的淀粉样蛋白β分解排出促进剂和阿尔茨海默病的预防、改善或治疗剂可以为其自身、用于淀粉样蛋白β的分解排出促进、或预防、改善或治疗阿尔茨海默病的医药品、医药部外品、增补品或食品，或者可以是配合在该医药品、医药部外品或食品中而使用的原材料或制剂。

在该食品中，包含以淀粉样蛋白β的分解排出促进或阿尔茨海默病的预防或改善为概念、根据需要显示其主旨的食品、功能性食品、病人用食品、特定保健用食品、增补品。这些食品为许可功能显示的食品，因此，可以与一般的食品进行区别。

作为上述医药品(也包含医药部外品)的给药形态，例如可以举出：片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的经口给药、或注射剂、栓剂、吸入药等的非经口给药。另外，这些种的剂型的制剂可以将本发明的绿原酸类或其盐单独、或适当组合其它药学上可接受的赋形剂、粘结剂、增量剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、矫味剂、香料、被膜剂、载体、稀释剂、本发明的绿原酸类或其盐以外的药效成分等而制备。这些给药形态中，优选的形态为经口给药。

作为上述食品的形态，除清涼饮料水、茶系饮料、咖啡饮料、果汁饮料、碳酸饮料、果冻、薄酥饼、饼干、面包、面、香肠等饮食品或营养食品等各种食品之外，还可以列举与上述的经口给药制剂同样的形态(片剂、胶囊剂、糖浆等)的营养补给用组合物。

各种形态的食品可以将本发明的绿原酸类或其盐单独、或适当组合其它食品材料、或溶剂、软化剂、油、乳化剂、防腐剂、酸味料、甜味料、苦味料、香科、稳定剂、着色剂、抗氧化剂、保湿剂、增粘剂、绿原酸类或其盐以外的有效成分等而制备。

上述的医药品(包含医药部外品)或食品中的本发明的绿原酸类或其盐的含量根据其使用形态而不同，通常，作为绿原酸类在总量中优选为0.001质量％以上，更优选为0.01质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，另外，优选为90质量％以下，更优选为60质量％以下，进一步优选为30质量％以下。另外，优选为0.001～90质量％，更优选为0.01～60质量％，进一步优选为0.1～30质量％。

上述医药品(也包含医药部外品)和食品的给药量或摄取量可以适当确定，通常对于成人(60kg)，每1天作为绿原酸类优选为100mg以上，更优选为300mg以上，另外，优选为3000mg以下，更优选为1000mg以下。在本发明中，优选以1次给药或摄取所述的量。

上述制剂按照任意的计划给药或摄取，给药或摄取期间没有特别限定，优选反复并连续地给药或摄取，更优选连续7天以上给药或摄取，进一步优选连续28天以上给药或摄取。

作为给药或摄取对象，只要是需要或希望预防或改善认知功能降低的人或非人动物，就没有特别限定，对人的给药或摄取是有效的。这里所说的认知功能的降低是指以阿尔茨海默病为代表的认知功能障碍中所看到的症状，例如是指伴随记忆/学习障碍(获得新的信息并停留于记忆的能力的障碍)、或推论、复杂的工作的操作的障碍或缺乏的判断力、视空间认知障碍、语言障碍、人格、行动或举止的变化等，对工作或日常活动带来障碍、或完成功能降低的状态。另外，需要或希望预防这样的认知功能的降低的人例如是指在国际上最广泛使用的认知功能测试的简易精神状态检查(MMSE)中27～30分的健康人，另外，需要或希望改善认知功能的降低的人包含在上述的检查中有22～26分的疑似有轻度认知障碍的人、以及21分以下的认知症等认知障碍的可能性高的人。

关于上述的实施方式，本发明中公开以下的方式。

＜1＞一种淀粉样蛋白β分解排出促进剂，其以绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物为有效成分。

＜2＞一种阿尔茨海默病的预防、治疗或改善剂，其以绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物为有效成分。

＜3＞一种淀粉样蛋白β分解排出促进用食品，其以绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物为有效成分。

＜4＞一种阿尔茨海默病的预防或改善用食品，其以绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物为有效成分。

＜5＞绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物在制造淀粉样蛋白β分解排出促进剂中的用途。

＜6＞绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物在制造阿尔茨海默病的预防、治疗或改善剂中的用途。

＜7＞绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物在制造淀粉样蛋白β分解排出促进用食品中的用途。

＜8＞绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物在制造阿尔茨海默病的预防或改善用食品中的用途。

＜9＞如＜5＞或＜6＞所述的用途，其中，上述剂为经口给药制剂。

＜10＞一种用于淀粉样蛋白β的分解排出促进的绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物。

＜11＞一种用于阿尔茨海默病的预防、治疗或改善的绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物。

＜12＞如＜10＞或＜11＞的绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物，其被经口给药。

＜13＞绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物在分解排出促进淀粉样蛋白β中的非治疗性用途。

＜14＞绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物在预防或改善阿尔茨海默病中的非治疗性用途。

＜15＞如＜13＞或＜14＞所述的非治疗性用途，其中，上述绿原酸或其盐、或含有其的植物提取物被经口给药。

＜16＞一种淀粉样蛋白β的分解排出促进方法，其中，将绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物以有效量给药或摄取至需要它们的对象。

＜17＞一种阿尔茨海默病的预防、治疗或改善方法，其中，将绿原酸类或其盐、或含有其的植物提取物以有效量给药或摄取至需要它们的对象。

＜18＞如＜16＞或＜17＞所述的方法，其中，所述给药为经口给药。

＜19＞在＜1＞～＜18＞中，绿原酸类至少含有5-咖啡酰奎宁酸。

＜20＞在＜1＞～＜19＞中，含有绿原酸类或其盐的植物提取物为咖啡豆提取物，优选为生咖啡豆提取物。

＜21＞在＜20＞中，生咖啡豆提取物优选咖啡因与绿原酸类的质量比(咖啡因/绿原酸类)为0.02以下，并且绿原酸类总量中的5-咖啡酰奎宁酸的含量(5-CQA/全绿原酸类)为40质量％以上，更优选(咖啡因/绿原酸类)为0.001以下，并且(5-CQA/全绿原酸类)为40质量％以上。

＜22＞在＜1＞和＜5＞所述的淀粉样蛋白β分解排出促进剂、＜2＞和＜6＞所述的阿尔茨海默病的预防、治疗或改善剂、＜3＞和＜7＞所述的淀粉样蛋白β分解排出促进用食品、＜4＞和＜8＞所述的阿尔茨海默病的预防或改善用食品中，所述有效成分的含量作为绿原酸类在总量中优选为0.001质量％以上，更优选为0.01质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，另外，优选为90质量％以下，更优选为60质量％以下，进一步优选为质量30％以下。另外，优选为0.001～90质量％，更优选为0.01～60质量％，进一步优选为0.1～30质量％。

＜23＞在＜10＞～＜18＞中，每成人1人的1天的给药量作为绿原酸类优选为100mg以上，更优选为300mg以上，另外，优选为3000mg以下，更优选为1000mg以下。

实施例

制造例1含绿原酸类的组合物的制备

1)用热水提取罗布斯塔种咖啡生豆，将得到的提取液用喷雾干燥器进行干燥，得到含粗绿原酸类的组合物。该含粗绿原酸类的组合物的组成为：绿原酸类32.3质量％、咖啡因9.8质量％、质量比(咖啡因/氯原类)为0.303、质量比((K+Na)/绿原酸类)为0.24。

2)通过将该含粗绿原酸类的组合物189g与乙醇浓度52.4质量％的乙醇水溶液756g、酸性白土(MIZUKA ACE#600、水泽化学公司生产)94.5g、过滤助剂(Solka Flock、新日矿Procurement公司制)10.7g混合而得到含绿原酸类的浆料1051g。该含绿原酸类的浆料的pH为5.7。

3)利用作为预涂剂堆积硅藻土而成的2号滤纸过滤该含绿原酸类的浆料1051g，接着通液乙醇浓度52.4质量％的乙醇水溶液189g，回收过滤液1054g。

4)接着，将填充有活性炭(白鹭WH2C、日本环境化学公司生产)132mL的柱和填充有H形阳离子交换树脂(SK1BH、三菱化学株式会社生产)105mL的柱连结，其中，通液该过滤液1019g，接着通液乙醇浓度52.4质量％的乙醇水溶液231g，回收洗脱的柱处理液1072g。活性炭相对于过滤液中的绿原酸类的使用量为0.81质量倍(g/g)。相对于含粗绿原酸类的组合物中的固体成分含量，离子交换树脂的使用量为0.74(mL/g)。

5)将该柱处理液1038g用0.2μm薄膜过滤器过滤之后，用旋转式蒸发器蒸馏除去乙醇，得到含绿原酸类的液225g。该含绿原酸类的液的组成为：绿原酸类22.6质量％、咖啡因0.29质量％、质量比(咖啡因/绿原酸类)为0.013、乙醇浓度0质量％、且其pH为3.1。

6)将该含绿原酸类的液用蒸馏水进行稀释，将绿原酸类的浓度调整为3质量％。在离心管中取样得到的稀释液10g之后，在3000rpm、15℃、60分钟的条件下进行离心分离，将上清液进行冻结干燥处理，得到含绿原酸类的精制咖啡多酚(CPP)。该CPP中，绿原酸类总量中的5-CQA的含量为45.6％。将CPP中的绿原酸类的组成比示于表1。

[表1]

(％)

CQA：咖啡酰奎宁酸、FQA：阿魏酰奎宁酸

实施例1绿原酸产生的凝集淀粉样蛋白β的分解作用

使用硫黄素T(ThT)荧光测定法研究绿原酸(5-CQA)产生的直接的凝集淀粉样蛋白的分解活性。

将淀粉样蛋白β肽(Human，1-42，(株)肽研究所)用二甲基亚砜(DMSO)溶解为2.5mM，进一步用灭菌水调整为250μM之后，在37℃下孵育7天而促进凝集反应。反应后，在凝集的淀粉样蛋白β(10质量％)中以终浓度1、10、100μM的各浓度添加绿原酸(5-CQA,CaymanChemical)，在37℃下进一步孵育7天。另外，在对照中加入用作绿原酸的溶剂的0.5％DMSO。反应结束后，在96孔板(赛默飞世尔科技)中加入溶解于50mM甘氨酸缓冲剂(pH8.5)的ThT(Sigma、终浓度5μM)，一边在遮光下轻轻地搅拌，一边在室温下反应15分钟。反应结束后，使用荧光酶标仪(Fluorescent plate reader)(Ensight3400，Perkin Elmer)检出450nm(激发)/480nm(发光)的荧光，测定淀粉样蛋白β的凝集度。由图1可知：绿原酸其用量依赖性地具有凝集淀粉样蛋白的分解活性。

实施例2绿原酸类继续摄取产生的淀粉样蛋白β排出输送体增加作用

使用12周龄的雄性C57BL/6小鼠，实验组摄取配合有制造例1中制备的含绿原酸类的精制咖啡多酚(CPP)0.5质量％和1质量％的标准食物4周，对照组仅给予标准食物(各n＝8)。另外，标准食物的组成为：10质量％玉米油、20质量％酪蛋白、4质量％纤维素、3.5质量％混合矿物质、1质量％混合维生素、61.5质量％马铃薯淀粉，CPP配合食物通过将所配合的CPP相当量的马铃薯淀粉替换为CPP而制作。摄取期间结束后，在深麻醉下摘除海马体，从摘除的脑组织中使用RNeasy universal mini kit(QIAGEN)提取总RNA。由总RNA通过使用了High Capacity RNA-to-cDNA kit(赛默飞世尔科技)的逆转录反应(37℃、60分钟)合成cDNA。在合成的cDNA(100ng)中混合利用TaqMan(注册商标)Fast Universal PCR MasterMix(赛默飞世尔科技)和TaqMan(注册商标)Gene Expression Assay(赛默飞世尔科技)而购入的预先设计的引物和探针，利用实时PCR法分析作为淀粉样蛋白β排出输送体的Lowdensity lipoprotein receptor-related protein 1(LRP1)、p-glycoprotein(p-gp)的基因表达量。研究的2种的淀粉样蛋白β排出输送体基因的表达量均在海马体中与对照组相比，在摄取了CPP的情况(实验组)下显著增加(图2)。

实施例3绿原酸类继续摄取产生的淀粉样蛋白β的脑内蓄积抑制作用

在作为将淀粉样蛋白β高表达的阿尔茨海默病模型小鼠的APP/PS2双转基因小鼠(APP/PS2WTg)的制作中，使用全身具有以B6；SJL为遗传背景的人淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)的K670N和M671L突变(瑞典型突变)的APP-Tg小鼠(Taconic Biosciences)、和全身具有以C57BL/6J小鼠为遗传背景的人早老素2(PS2)的N141突变的PS2-Tg小鼠(东方酵母)。将从雄性APP-Tg小鼠(10周龄以上)中采取的***和雌性PS2-Tg小鼠(4周龄以上)的***供于体外受精，制作APP/PS2WTg小鼠。在试验中使用5周龄的雄性APP/PS2WTg，实验组摄取与配合有制造例1中制备的含绿原酸类的精制咖啡多酚(CPP)1质量％的实施例2记载同样的标准食物20周，在对照组中仅给予标准食物(各n＝6-8)。摄取期间结束后，在深麻醉下用冰冷下的生理食盐水(20mL)和4％对甲醛·磷酸缓冲液(PFA、20mL)灌流之后，摘除全脑，浸渍于4％PFA，在4℃下进行固定。接着制作石蜡块，关于背侧海马区域，制作4μm厚的石蜡切片。脑切片进行脱石蜡化，在室温下浸渍于90％甲酸5分钟，接着在室温下浸渍于在甲醇中加入了0.1％过氧化氢水的溶液30分钟，使内因性过氧化物酶失活。用PBS/Tween20(PBS-T)清洗之后，使用抗Human淀粉样蛋白β抗体(1：200、(株)免疫生物研究所)，在室温下进行60分钟的一次抗体反应。反应后用PBS-清洗，滴加HRP标识链酶亲和素，在室温下反应5分钟后，在DAB试剂盒(DAKO)中进行显色反应。用苏木素进行核染色后，用流水清洗并脱水、澄清、封入，制作玻片样本(slide sample)。使用荧光显微镜(BZ-X710：(株)基恩士)进行观察，用附属的分析软件(BZ-II应用(application))算出含染色面积(淀粉样蛋白蓄积比例)。每1个体制作4张切片，将4张切片的平均含染色面积值设为其个体的值。

由观察像(图3)得知：与对照组相比，脑内的淀粉样蛋白β蓄积在CPP摄取组(实验组)中明显减少，另外，由淀粉样蛋白蓄积比例的算出，特别是在对记忆起到重要作用的海马体中可看到显著的蓄积减少(图4)。

实施例4绿原酸类继续摄取产生的记忆学习能力改善作用

使用与实施例3同样的5周龄的雄性APP/PS2WTg、和作为其遗传背景动物的同周龄的C57BL/6(健康对照组)，实验组摄取配合有制造例1中制备的含绿原酸类的精制咖啡多酚(CPP)1质量％的标准食物，在对照组和健康对照组中仅给予标准食物(各n＝12-15)。从试验食摄取开始第18周实施新奇物体认识试验和莫里斯水迷路试验来测定对记忆、学习能力的影响。在评价视觉的认知功能(长期记忆)的新奇物体认识试验中，在塑料制笼(W：220×D：320×H：130mm)中放入小鼠，在环境中驯化10分钟(驯化试行)。第二天，在设置有物体(积木：A1和A2)的笼内放入小鼠，将10分钟的行动记录在视频中(训练试行)。在训练试行的2小时后仅1个物体更换为新的物体(高尔夫球：B)，再次将小鼠放入笼中，将5分钟的行动记录在视频中(保持试行)。

使用记录的动画，将训练试行、保持试行中的小鼠对各物体的接触次数作为探索次数，使用计数器进行计测。算出对各物体的探索次数相对于对物体的总探索次数的比例(％)。

关于保持试行时的对新奇物体的探索比例，与健康对照组相比，在阿尔茨海默病模型APP/PS2WTg对照组中显著低，可认为记忆、学习能力(视觉的认知功能)降低。与此相对，得知：摄取有1质量％CPP的实验组与对照组相比，记忆、学习能力(视觉的认知功能)显著提高，另外，保持与健康对照组大致同程度的记忆、学习能力(视觉的认知功能)(图5)。

接着，在评价长期记忆的空间认知功能的莫里斯水迷路试验中，在直径148cm的圆形池中设置视觉上不能识别的透明的平台(直径12cm)，使用以平台用水隐藏的方式装入水的池(水温18℃)。平台设置在将池进行4分割之后的1处(以下，第4象限)的中央，在池的周围设置电灯泡作为空间提示。向池的壁投入小鼠的头，直至到达平台最长游泳90秒。无法达到平台的情况下，在平台上放置30秒之后返回到饲养笼。将其1天3次进行4天(计12次)(学***台的池中向池的壁投入小鼠的头，将在90秒内小鼠滞留在第4象限(在学***台的象限)的时间(第4象限游泳时间)记录在视频中(探针试行)。

记录的动画使用分析软件(EthoVision XT：诺达思)，算出探针试行中的第4象限游泳时间。

与健康对照组相比，探针试行中的第4象限游泳时间在阿尔茨海默病模型APP/PS2WTg对照组中显著短，可看到记忆、学习能力(长期记忆的空间认知功能)的降低。得知：与此相对，摄取了1质量％CPP的实验组与对照组相比，显著提高记忆学习能力(长期记忆的空间认知功能)，另外，保持与健康对照组大致同程度的记忆、学习能力(长期记忆的空间认知功能)(图6)。