阅读说明：本技术 青光眼的治疗 (Treatment of glaucoma ) 是由 L·布鲁斯 A·布鲁斯 于 2018-05-16 设计创作，主要内容包括：本发明的实施方案总体上涉及一种硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐,所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于治疗、抑制或预防受试者的青光眼。所述实施方案的硫酸葡聚糖实现眼内压的降低和标准化,这是在保存视网膜神经节细胞和视网膜神经纤维层方面的神经保护作用,并且所述硫酸葡聚糖溶解已建立的小梁网瘢痕元素。(Embodiments of the present invention generally relate to a dextran sulfate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in treating, inhibiting, or preventing glaucoma in a subject. The dextran sulfate of the embodiments achieves a reduction and normalization of intraocular pressure, which is a neuroprotective effect in preserving retinal ganglion cells and the retinal nerve fiber layer, and dissolves established trabecular meshwork scar elements.)

青光眼的治疗

技术领域

本发明的实施方案总体上涉及青光眼的预防、治疗或抑制，并且具体地涉及硫酸葡聚糖在预防、治疗或抑制青光眼中的用途。

背景技术

青光眼描述了一组可能引起不可逆性失明的进行性视神经病变，其中主要风险因素是眼内压升高(IOP)。在原发性开角型青光眼(POAG)中，当通过小梁网(TM)流出的房水(AqH)减少时发生IOP升高，这通常是TM细胞结构、TM收缩和细胞外基质(ECM)水平异常的结果。TM中的弹性型纤维被包埋于由IV型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白构成的无定形ECM中的细小原纤维的鞘包围。TM内的管旁组织(JCT)中与弹性样纤维鞘相关的斑块物质(即所谓的鞘来源(SD)斑块)的存在也是POAG的病理特征。因此，POAG患者在其TM中具有与年龄匹配的对照的眼睛相比显著更多且更厚的SD斑块。但是，业内并不认为这些SD斑块促进流出阻力增加，因为已经显示，患有假性剥脱性青光眼的眼睛具有与健康眼睛相比时类似的SD斑块物质水平，但仍具有更高的IOP水平。然而，观察到在TM鞘周围增加的ECM水平，并且这种沉积可能促进增加的流出阻力。TM中的这些细胞和ECM变化以及改变的TM细胞收缩能力导致功能失调的TM，并最终导致失去对AqH流出的严格控制。

在POAG中导致TM功能障碍的机制可能是多因素的，但是AqH内病理性高水平的转化生长因子-β(TGF-β)被认为促进所述TM功能障碍。与取自年龄匹配的患有白内障或其他形式的青光眼的患者的AqH相比，一些POAG患者的AqH中具有升高的TGF-β水平。通过人眼灌注实验和在青光眼的啮齿动物模型中已经证明了TGF-β在增加TM ECM沉积和IOP中的作用。来自培养的人TM细胞的基因表达研究也支持以下论断：TGF-β1和TGF-β2亚型二者均诱导可能促进在青光眼中观察到的TM变化的ECM蛋白的过表达。另外，TGF-β通过增加纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的水平来抑制基质金属蛋白酶(MMP)的激活，从而防止ECM的分解。PAI-1抑制纤溶酶原转化为纤溶酶依赖型MMP激活所需的纤溶酶。TGF-β的IOP增加作用还归因于细胞因子减少TM细胞增殖和诱导TM细胞凋亡，从而减少TM细胞总数的能力。

TGF-β还通过RhoA-Rho相关蛋白激酶(ROCK)信号传导途径刺激TM细胞的收缩，其中TM收缩力显著影响IOP。使用Rho/ROCK抑制剂减少或消除RhoA介导的TM收缩的研究已经导致新类别的IOP降低剂，考虑使用所述新类别的IOP降低剂来治疗青光眼和涉及IOP增加的其他医学病症。然而，不可能仅用Rho/ROCK抑制剂来解决一些POAG患者中发生的慢性纤维化病状，所述Rho/ROCK抑制剂的功效仍在审查中。最终，IOP升高导致视神经头和视网膜的细胞中的代谢和生化变化。另外，机械轴突压缩同时影响逆行轴突运输和顺行轴突运输。代谢和生化变化与机械轴突压缩一起剥夺视网膜神经节细胞(RGC)的神经营养因子，最终导致RGC细胞凋亡和视神经盘陷凹(optic disc cupping)，这些是青光眼的诊断特征。

由于来自青光眼的视力丧失是不可逆的，因此任何青光眼治疗的目标都是预防视力丧失。当前，通过滴眼剂、丸剂、激光手术、传统手术或这些方法的组合来治疗青光眼。这些治疗方法中的大多数被设计用于降低和/或控制IOP，所述IOP可能损伤将视觉信息传递到大脑的视神经。然而，IOP控制在最好的情况下也是不完善的，仍然存在对可以限制或甚至逆转疾病进展的改良疗法的未满足的需求。

发明内容

一般目标是治疗、抑制或预防受试者的青光眼。

通过如本文所公开的实施方案实现了这个目标和其他目标。

实施方案的一个方面涉及用于治疗、抑制或预防受试者的青光眼的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

实施方案的另一个方面涉及用于治疗、抑制或预防受试者的高眼压症的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

实施方案的另一个方面涉及用于抑制患有青光眼和/或高眼压症的受试者的视网膜神经节细胞损失和视网膜神经纤维层减少的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

实施方案的又另一个方面涉及用于降低患有青光眼的受试者的眼内压的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

实施方案的其他方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于制造如下药物用途，所述药物用于治疗、抑制或预防受试者的青光眼；用于治疗、抑制或预防受试者的高眼压症；用于降低患有青光眼的受试者的眼内压；或用于患有青光眼和/或高眼压症的受试者的视网膜神经节细胞损失和视网膜神经纤维层减少。

实施方案的又另一个方面涉及治疗、抑制或预防青光眼的方法。所述方法包括将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物施用至患有青光眼的受试者。

实施方案的另一个方面涉及治疗、抑制或预防高眼压症的方法。所述方法包括将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物施用至患有高眼压症的受试者。

实施方案的另一个方面涉及抑制视网膜神经节细胞损失和视网膜神经纤维层减少的方法。所述方法包括将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物施用至患有青光眼和/或高眼压症的受试者。

实施方案的又另一个方面涉及降低患有青光眼的受试者的眼内压的方法。所述方法包括将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物施用至所述患有青光眼的受试者。

本发明实施方案的硫酸葡聚糖在患有青光眼的受试者中引起正常IOP的快速且可再现的恢复。IOP降低至健康受试者的正常范围与视网膜中RGC的保存以及视网膜神经纤维层(RNFL)的保存有关。有人提出正常IOP水平的恢复是由于已建立的TM瘢痕元素的溶解所致，如通过用硫酸葡聚糖治疗的受试者的房角中层粘连蛋白和纤连蛋白水平的显著降低所证实。

附图说明

可以通过参考结合附图的以下描述最佳地理解实施方案以及所述实施方案的其他目标和优点，在附图中：

图1说明了患有原发性开角型青光眼(POAG)并用盐水对照或根据实施方案的硫酸葡聚糖治疗的受试者的眼内压(IOP)的变化。

图2说明了患有POAG并用盐水对照或根据实施方案的硫酸葡聚糖治疗的受试者的视网膜神经节细胞(RGC)数量的变化。

图3说明了患有POAG并用盐水对照或根据实施方案的硫酸葡聚糖治疗的受试者的视网膜神经纤维层(RNFL)厚度的变化。

图4说明了患有POAG并用盐水对照或根据实施方案的硫酸葡聚糖治疗的受试者的虹膜角膜角的前段成像。

图5说明了患有POAG并用盐水对照或根据实施方案的硫酸葡聚糖治疗的受试者的房角中层粘连蛋白免疫反应性的变化。

图6说明了患有POAG并用盐水对照或根据实施方案的硫酸葡聚糖治疗的受试者的房角中纤连蛋白免疫反应性的变化。

图7说明了患有POAG并用盐水对照或根据实施方案的硫酸葡聚糖治疗的受试者的体重差异。

图8是患有POAG并用盐水对照或根据实施方案的硫酸葡聚糖治疗的受试者的代表性荧光素血管造影术图像。

图9说明了使用同工凝集素B4染色的脉络膜新血管形成。对照组(图9A)和治疗组(图9B)中新血管形成的代表性图像。(图9C)：条形图显示平均新生血管面积。

图10说明了使用IV型胶原染色的脉络膜新血管形成。对照组(图10A)和治疗组(图10B)中新血管形成的代表性图像。(图10C)：条形图显示平均新生血管面积。

图11说明了RNFL的光学相干断层成像术(OCT)分析的结果。

具体实施方式

本发明的实施方案总体上涉及青光眼的预防、治疗或抑制，并且具体地涉及硫酸葡聚糖在预防、治疗或抑制青光眼中的用途。

硫酸葡聚糖治疗导致患有青光眼、特别是原发性开角型青光眼(POAG)的受试者的青光眼患眼中正常眼内压(IOP)的迅速且可再现的恢复。正常IOP水平的恢复与硫酸葡聚糖治疗的受试者的眼睛中如通过维持的RGC计数所证实的视网膜中视网膜神经节细胞(RGC)的保存以及视网膜神经纤维层(RNFL)厚度的保存有关。硫酸葡聚糖治疗还导致在硫酸葡聚糖治疗的受试者的房角中层粘连蛋白和纤连蛋白的水平显著降低时，已建立的小梁网(TM)瘢痕元素溶解。

所述观察结果的临床意义如下。青光眼患者目前用通过限制眼液产生或增加眼液流出来降低IOP的每日滴眼剂药物来治疗。这些治疗的依从性差，因此，IOP控制不完善，导致大多数患者的进行性视力丧失。预防和逆转导致视力丧失的眼部病状并显著改善IOP控制的治疗将非常有价值。

可用于治疗青光眼的候选药物不应诱导眼睛中的血管生成或新血管形成。眼睛中的这种病理性血管生成可能会以其他方式导致严重的视觉障碍。如本文所呈现的实验数据指示，硫酸葡聚糖对所治疗受试者的眼睛没有抗血管生成或促血管生成的作用。因此，硫酸葡聚糖因此可以安全地用于眼部适应证，而没有在眼睛中发生病理性血管生成的风险。

因此，实施方案的硫酸葡聚糖可以有效地用于预防、治疗或抑制青光眼。

因此，实施方案的方面涉及用于治疗、抑制或预防受试者的青光眼的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

青光眼是一组眼部疾病，其导致视神经和视网膜受损，并伴有视力丧失。青光眼最常见的类型是开角型青光眼，较少见的类型包括闭角型青光眼和正常眼压性青光眼。开角型青光眼会随着时间缓慢发展，并且没有疼痛。如果不加以治疗，侧视力可能会开始下降，然后是中心视力丧失，从而导致失明。闭角型青光眼可能逐渐或突然出现。突然出现可能涉及严重的眼痛、视力模糊、中度瞳孔散大、眼睛发红和恶心。青光眼一旦发生视力丧失就是永久性的。

如果及早治疗，有可能通过药物、激光治疗或手术减缓或阻止青光眼疾病的进展。青光眼控制的现代目标是在最小副作用下，避免青光眼损伤和神经损伤并保护患者的视野和整体生活质量。这需要适当的诊断技术和随访检查，以及针对单独患者的慎重的治疗选择。尽管眼内压只是青光眼的主要风险因素之一，但是目前通过各种药物和/或外科技术降低眼内压是青光眼治疗的主要手段。

可用药物(通常是滴眼剂)降低眼内压。使用几个药物类别治疗青光眼，其中每个类别有几种药物。这些药物中的每一种都可能具有局部和全身性副作用。遵守药物方案可能令人困惑并且是昂贵的。对药物和随访的依从性差是青光眼患者视力丧失的主要原因。

进行激光手术和常规手术二者来治疗青光眼。手术和激光治疗通常是暂时的解决方案，因为它们不能治愈青光眼。

因此，长久以来人们认为需要提供可以用于治疗、抑制或预防受试者的青光眼的药物。

根据实施方案的硫酸葡聚糖或药学上可接受的盐在施用至患有如由青光眼引起的增加的IOP(即高眼压症)的受试者时，诱导IOP的降低。实际上，在施用硫酸葡聚糖后，IOP被标准化(即降低)至健康受试者的正常IOP范围。因此，根据实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐能够抵抗并治疗青光眼中最有害的组分之一，即异常和增加的IOP。

此外，根据实施方案施用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐向RGC提供神经保护作用。更详细地，如从所治疗受试者的眼睛中维持的RGC计数和在RNFL厚度的保存可以看出，硫酸葡聚糖的施用保护RGC免受损伤和细胞死亡。

RGC是位于眼睛视网膜内表面附近的一种类型的神经元，通常表示为神经节细胞层。RGC将图像形成和非图像形成视觉信息共同以动作电位的形式从视网膜传递到丘脑、下丘脑和中脑(“mesencephalon”或“midbrain”)中的几个区域。RGC在其大小、连接和对视觉刺激的反应方面变化显著，但它们均具有延伸到大脑中的长轴突的限定特性。这些轴突形成视神经、视交叉和视束。

RNFL有时表示神经纤维层或视神经层，是通过视神经纤维的扩张形成的。RNFL是敏感结构，并且一些过程(如高IOP)可以激发RNFL的自然细胞凋亡。

实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的神经保护作用有效地防止RGC的损伤和细胞凋亡，从而保存RNFL。

如前文所提及，TM功能障碍(如TM细胞结构异常和TM收缩异常)可能是如在患有青光眼的受试者中所见的高IOP的潜在病因。实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐分散并减弱在青光眼受试者中建立的TM瘢痕形成。这转而使通过TM的AqH流出标准化。

有人提出，实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的抗瘢痕形成作用是由硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐诱导的几种机制的结果。因此，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐诱导基质金属蛋白酶(MMP)，其是能够降解细胞外基质(ECM)蛋白的酶并抑制金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)的活性。硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐进一步诱导天然的抗瘢痕形成分子(如核心蛋白聚糖(decorin))，其转而阻断TGF-β和各种生长因子(如肝细胞生长因子(HGF)、***(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)等)。硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐即使在过量水平的TGF-β的存在下也具有对TGF-β活性的抑制作用并且抑制纤维化。硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐进一步抑制免疫细胞粘附和细胞聚集。瘢痕形成是由炎性细胞因子、特别是TGF-β驱动的，并抑制TGF-β激活的蛋白激酶1(TAK-1)的水平。硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐阻断TGF-β和其他能促进瘢痕形成及纤维化的细胞因子，并且同时刺激抗瘢痕形成分子。硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐诱导的这些机制一起通过分散和减弱TM瘢痕形成而在青光眼患眼中具有积极作用。

现有技术的抗青光眼药物通常不能治疗或治愈青光眼，也不能对抗青光眼的潜在病因，而是通过限制眼液产生或增加眼液流出来减轻青光眼的症状，如降低IOP。然而，使用此类药物治疗通常依从性差并且IOP控制不完善，从而导致大多数受试者的进行性视力丧失。这与实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐形成鲜明对比，所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐不仅使IOP降低和标准化，而且还提供对RGC和RNFL的神经保护作用并溶解已建立的TM瘢痕元素，从而使得能够实际地抑制和治疗青光眼。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐在不引起眼睛中病理性血管生成的情况下实现对青光眼的治疗、抑制或预防。因此，重要的是用于青光眼治疗、抑制或预防的药物不会在眼睛中诱导血管生成或新血管形成，否则会导致严重的视觉障碍。如本文所呈现的实验数据指示，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐在眼睛中既没有抗血管生成作用也没有促血管生成作用，因此适合应用于眼部适应证。

开角型青光眼是青光眼的最常见形式，占所有青光眼病例的至少90％。它是由于排液管堵塞导致眼压升高而引起的。开角意味着虹膜与角膜相交的角度与其本该呈现的角度一样宽且开放。开角型青光眼在本领域中也称为原发性青光眼、原发性开角型青光眼(POAG)或慢性青光眼。

在特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于治疗、抑制或预防受试者的开角型青光眼，如POAG。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐有效地将IOP从高眼压症范围降回到正常IOP范围。

因此，实施方案的另一个方面涉及用于治疗、抑制或预防受试者的高眼压症的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

在特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于降低患有高眼压症的受试者的眼内压。

因此，实施方案的方面涉及用于降低患有青光眼、优选地患有开角型青光眼(如POAG)的受试者的眼内压的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

在人类中，正常IOP范围通常在10mmHg与20mmHg之间，其中IOP的平均值为约15.5mmHg，具有约2.75mmHg的波动。将高眼压症(OHT)定义为IOP高于正常范围，即对于人通常高于20mmHg。

因此，在实施方案中，降低眼内压包括将眼内压降低至或将眼内压恢复至从10mmHg直至20mmHg的正常IOP范围内，如从12.75mmHg直至18.25mmHg的IOP范围内。

在实施方案中，受试者患有由青光眼、优选开角型青光眼(如POAG)引起的高眼压症。

尽管青光眼、特别是开角型青光眼和POAG是高眼压症的主要病因，但高眼压症存在其他可能的病因，包括例如高血压，应激，含有高盐、氢化油、酒精和糖的饮食，眼外伤，吸烟，糖尿病和心脏病。一些药物也具有在某些个体中引起高眼压症的副作用。例如，已显示用于治疗哮喘和其他病症的类固醇药物会增加高眼压症的风险。可能影响房水产生和从眼睛排液的平衡的各种眼外伤可以引起高眼压症。高眼压症还与其他眼部病症有关，所述其他眼部病症如夜间升高的IOP、IOP飙升、假性剥脱综合征、色素播散综合征和角膜弓。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐提供神经保护作用，以防止或至少降低RGC的损伤和死亡，并保存RNFL完整性和厚度。

因此，实施方案的另一个方面涉及用于抑制患有青光眼、优选开角型青光眼(如POAG)和/或高眼压症的受试者的视网膜神经节细胞损失和视网膜神经纤维层减少的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。

增加的IOP和RGC的死亡也可能直接或间接影响其他视网膜神经元(如中间神经元)和光感受器。例如，RGC的死亡可能引起萎缩，这转而诱导突触损失和其他视网膜神经元的死亡。

因此，使IOP标准化并减少RGC的损伤和死亡将可用于治疗、预防或抑制其他视网膜病症，如糖尿病性视网膜病变和与光感受器损失相关的各种遗传病症。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐是用于不仅通过降低IOP而且还同时直接保护视网膜神经元免于损伤和死亡来治疗、预防或抑制青光眼和相关视网膜病症的独特药剂。

在实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制用于全身性施用至所述受试者。在实施方案中，作为全身性施用的实例，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制用于肠胃外施用。

肠胃外施用途径的实例包括静脉内(i.v.)施用、动脉内施用、肌内施用、大脑内施用、脑室内施用、鞘内施用和皮下(s.c.)施用。

在实施方案中，优选地将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制用于静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)施用至所述受试者。因此，静脉内和皮下施用是全身性施用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的优选实例。在特定实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制用于皮下施用至所述受试者。

在实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制为水性注射溶液，优选地配制为水性静脉内或皮下注射溶液。因此，优选地将实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制为具有所选溶剂或赋形剂的水性注射溶液。所述溶剂有利地是水性溶剂，并且特别是缓冲溶液。这种缓冲溶液的非限制性实例是柠檬酸缓冲液(如柠檬酸一水合物(CAM)缓冲液)或磷酸盐缓冲液。例如，可以将实施方案的硫酸葡聚糖溶解在盐水如0.9％NaCl盐水中，然后任选地用75mM CAM缓冲，并使用氢氧化钠将pH调节至约5.9。也可以使用非缓冲溶液，包括水性注射溶液，如盐水，即NaCl(水溶液)。此外，如果需要缓冲溶液，可以使用除CAM和磷酸盐缓冲液以外的其他缓冲液体系。

实施方案不限于注射，并且可以可选地使用其他施用途径，包括眼内、玻璃体内、经小带、鼻、颊、皮肤、气管、支气管或局部施用。然后用基于特定施用途径选择的适当赋形剂、溶剂或载体配制活性化合物硫酸葡聚糖。

眼内施用是指进入受试者眼球的施用。玻璃体内施用是指通过受试者的眼睛施用，优选地直接施用至眼睛内腔中。经小带施用是指穿过睫状小带施用，所述睫状小带是连接眼睛的睫状体和晶状体的一系列纤维。

载体是指充当用于改善硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的递送效率和/或有效性的媒介物的物质。

赋形剂是指与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐组合配制的药理学惰性物质，并且包括例如增量剂、填充剂、稀释剂和用于促进药物吸收或溶解性或用于其他药代动力学考虑的产品。

硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐是指具有如本文所公开的作用并且在一种或多种所施用剂量下对其接受者无害的硫酸葡聚糖的盐。

硫酸葡聚糖优选地是所谓的低分子量硫酸葡聚糖。

在下文中，对硫酸葡聚糖的(平均)分子量和硫含量的提及也适用于硫酸葡聚糖的任何药学上可接受的盐。因此，硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐优选地具有如以下实施方案中所讨论的平均分子量和硫含量。

硫酸葡聚糖是硫酸化的多糖，并且特别是硫酸化的葡聚糖，即由许多葡萄糖分子制成的多糖。如本文所定义的平均分子量指示，单独硫酸化多糖可以具有不同于该平均分子量的分子量，而所述平均分子量代表硫酸化多糖的平均分子量。这进一步暗示，对于硫酸葡聚糖样品，在该平均分子量附近会存在自然的分子量分布。

硫酸葡聚糖的平均分子量(M_w)通常使用间接方法(如凝胶排阻/渗透色谱法、光散射或粘度)来测定。使用此类间接方法测定平均分子量将取决于许多因素，包括色谱柱和洗脱液的选择、流速、校准程序等。

平均分子量(M_w)：通常用于对分子大小而不是数值灵敏的方法，例如，光散射和尺寸排阻色谱(SEC)方法。如果假设服从正态分布，则在M_w的两侧具有相同重量，即样品中分子量低于M_w的硫酸葡聚糖分子的总重量等于样品中分子量高于M_w的硫酸葡聚糖分子的总重量。

在实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选地具有等于或小于40000Da、更优选地等于或小于20 000Da、以及特别地等于或小于10 000Da的平均分子量。

如与具有较低平均分子量的硫酸葡聚糖相比，平均分子量超过10 000Da的硫酸葡聚糖通常具有较低的作用与毒性分布。这意味着，如与平均分子量在优选范围内的硫酸葡聚糖分子相比，对于较大的硫酸葡聚糖分子(>10 000Da)，可以安全施用至受试者的硫酸葡聚糖的最大剂量较低。因此，在要将硫酸葡聚糖施用至受试者体内时，此类较大的硫酸葡聚糖分子不太适合于临床用途。

在实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量在2 000Da至10000Da的范围内。在另一个实施方案中，所述平均分子量在2 500Da至10 000Da的范围内。在特别优选的实施方案中，所述平均分子量在3 000Da至10 000Da的范围内。

在任选的但优选的实施方案中，少于40％的硫酸葡聚糖分子的分子量低于3000Da，优选少于35％(如少于30％或少于25％)的硫酸葡聚糖分子的分子量低于3 000Da。另外地或可选地，少于20％的硫酸葡聚糖分子的分子量高于10 000Da、优选少于15％(如少于10％或少于5％)的硫酸葡聚糖分子的分子量高于10 000Da。因此，在特定实施方案中，硫酸葡聚糖在平均分子量附近具有相当窄的分子量分布。

在特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量在3 500Da至9 500Da的范围内，如在3 500Da至8 000Da的范围内。

在另一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量在4500Da至7 500Da的范围内。

在另一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量在4500Da至5 500Da的范围内。

因此，在当前优选的实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量优选地是约5 000Da或至少相当接近于5 000Da，如5 000±500Da，例如5 000±400Da、优选5 000±300Da或5 000±200Da(如5 000±100Da)。因此，在实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量为4.5kDa、4.6kDa、4.7kDa、4.8kDa、4.9kDa、5.0kDa、5.1kDa、5.2kDa、5.3kDa、5.4kDa或5.5kDa。

在特定实施方案中，如上所示的硫酸葡聚糖或其药学上的盐的平均分子量是平均M_w，并且优选地通过凝胶排阻/渗透色谱法、尺寸排阻色谱法、光散射或基于粘度的方法来测定。

在特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐平均由约5个或略高于5个葡萄糖单元组成，并且每个葡萄糖单元具有至少2.0(如至少2.5)的平均硫酸根数。

硫酸葡聚糖是葡聚糖的聚阴离子衍生物并且含有硫。实施方案的硫酸葡聚糖的平均硫含量优选地是15％至20％并且更优选地是约17％，通常对应于每个葡糖基残基具有约两个或至少两个硫酸根基团。在特定实施方案中，硫酸葡聚糖的硫含量优选地等于或至少接近于相应葡聚糖分子的硫含量的最大可能程度。

在特定实施方案中，实施方案的硫酸葡聚糖具有如通过核磁共振(NMR)光谱法所测量的在1850Da至3500Da的区间内的数均分子量(M_n)。

数均分子量(M_n)：通常通过端基测定(例如NMR光谱法或色谱法)得到。如果假设服从正态分布，则可以发现在M_n的两侧具有相同的硫酸葡聚糖分子数，即样品中分子量低于M_n的硫酸葡聚糖分子数等于样品中分子量高于M_n的硫酸葡聚糖分子数。

在优选实施方案中，实施方案的硫酸葡聚糖具有如通过NMR光谱法所测量的在1850Da至2500Da的区间内、优选地在1850Da至2300Da的区间内、以及更优选地在1850Da至2000Da的区间内的M_n。

在特定实施方案中，实施方案的硫酸葡聚糖具有在2.5至3.0的区间内、优选地在2.5至2.8的区间内、以及更优选地在2.6至2.7的区间内的每个葡萄糖单元的平均硫酸根数。

在特定实施方案中，实施方案的硫酸葡聚糖具有在4.0至6.0的区间内、优选地在4.5至5.5的区间内、以及更优选地在5.0至5.2的区间内(如约5.1)的平均葡萄糖单元数。

在另一个特定实施方案中，实施方案的硫酸葡聚糖具有平均5.1个葡萄糖单元和2.6至2.7的每个葡萄糖单元的平均硫酸根数，这通常导致如通过NMR光谱法所测量的在1850Da至2000Da的区间内的数均分子量(M_n)。

可以根据实施方案使用的硫酸葡聚糖或其药学上的盐描述于WO 2016/076780中。

可以以硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐的形式提供根据实施方案的硫酸葡聚糖。此类药学上可接受的盐包括例如硫酸葡聚糖的钠盐或钾盐。

在特定实施方案中，包括Na⁺抗衡离子的硫酸葡聚糖的钠盐具有如通过NMR光谱法所测量的在2000Da至2500Da的区间内、优选地在2100Da至2300Da的区间内的M_n。

实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的合适剂量范围可以根据所述受试者的大小和体重、所述受试者的治疗所针对的病症和其他考虑而变化。特别是对于人类受试者，可能的剂量范围可以是1μg/kg至150mg/kg体重，优选地是10μg/kg至100mg/kg体重。

在优选实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制为以以下剂量范围来施用：0.05mg/kg至50mg/kg受试者体重，优选0.05mg/kg或0.1mg/kg至40mg/kg受试者体重，以及更优选0.05mg/kg或0.1mg/kg至30mg/kg、或0.1mg/kg至25mg/kg、或0.1mg/kg至15mg/kg、或0.1mg/kg至10mg/kg受试者体重。

实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的施用优选地在发生原本可能在受试者中引起青光眼、高眼压症和/或对RGC和RNFL的损伤的事件或病症后尽可能快地开始。

硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的施用不一定必须限于青光眼的治疗，而是可以可选地或另外地用于预防。换句话说，可以将实施方案的硫酸葡聚糖施用至具有增加的发展青光眼、高眼压症和/或对RGC和RNFL的损伤的风险的受试者。

如本文所用的对青光眼、高眼压症和/或RGC损失和RNFL减少的抑制暗示，即使不一定发生100％的治疗或治愈，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐也会减小症状和病症的影响。例如，对高眼压症的抑制涉及IOP降低，可能甚至降低至正常IOP范围，如等于或低于20mmHg。对RGC损失的抑制涉及减少原本可能受损或损失的RGC数，包括直至防止出现超过在健康受试者中所观察到的任何正常RGC损失的任何RGC损失。相应地，抑制RNFL减少涉及阻止或至少降低RNFL厚度的任何减少，包括直至防止出现超过在健康受试者中所观察到的任何正常RNFL减少的任何RNFL减少。对青光眼的抑制包括减少或至少减轻由青光眼引起的症状和病症，如降低IOP、减少RGC损失、降低RNFL减少和/或溶解TM瘢痕元素。

实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可以在单一施用时机施用，如以单次注射或推注注射的形式来施用。可以将该推注剂量极快地注射至患者，但是有利地经一段时间输注，使得硫酸葡聚糖溶液经几分钟时间(如在5至10分钟或更长时间期间)输注至患者。

可选地，实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可以在治疗阶段期间内在多个(即，至少两个)时机施用。因此，作为说明性实例，实施方案的硫酸葡聚糖可以每天一次或多次、每周一次或多次、每个月一次或多次施用。

在特定实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制用于以一周多次(如2-14次、优选2-7次)施用持续一周或连续多周，如至少连续2-5周。在特定实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制用于以一天一次或两次施用持续多天(如连续多天，例如2-14天)。

在实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者，优选地是灵长类动物，以及更优选地是人受试者。尽管所述实施方案特别针对治疗、抑制或预防人受试者的青光眼，但是所述实施方案可以另外地用于或者可选地用于兽医应用。动物受试者的非限制性实例包括灵长类动物、猫、狗、猪、马、小鼠、大鼠。

实施方案的其他方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于制造如下药物的用途，所述药物用于治疗、抑制或预防受试者的青光眼；用于治疗、抑制或预防受试者的高眼压症；用于降低患有青光眼的受试者的眼内压；或用于患有青光眼、优选开角型青光眼和/或高眼压症的受试者的RGC损失和RNFL减少。

实施方案的又另一个方面涉及治疗、抑制或预防青光眼的方法。所述方法包括将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物施用至患有青光眼、优选开角型青光眼的受试者。

实施方案的另一个方面涉及治疗、抑制或预防高眼压症的方法。所述方法包括将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物施用至患有高眼压症的受试者。

实施方案的另一个方面涉及抑制视网膜神经节细胞损失和视网膜神经纤维层减少的方法。所述方法包括将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物施用至患有青光眼、优选开角型青光眼和/或高眼压症的受试者。

实施方案的又另一个方面涉及降低患有青光眼的受试者的眼内压的方法。所述方法包括将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物施用至所述患有青光眼的受试者。

实施例

实施例1-硫酸葡聚糖对青光眼患眼的作用

结果

眼内压(IOP)

通过在28天的整个时间段内每周两次眼房内注射炎性细胞因子TGF-β诱导升高的IOP。截至第14天，这诱导小梁网(TM)排液口的瘢痕形成，并伴有相关的IOP升高。在第14天开始每天进行皮下硫酸葡聚糖/盐水治疗。

在两个组中IOP都在第14天升高，其中在接受皮下盐水注射的动物中IOP继续升高。然而，在硫酸葡聚糖治疗7天后升高的IOP开始降低，并且截至第24天，硫酸葡聚糖组中存在与对照相比显著较低(P<0.001)并且标准化的IOP。在第28天实验结束时，IOP仍显著低于(P>0.001)对照组(图1)。

视网膜神经节细胞(RGC)数

在第28天，硫酸葡聚糖治疗显著防止(P>0.001)视网膜中存在的RGC数量下降(图2)，这表明硫酸葡聚糖具有神经保护作用。这种神经保护作用可以通过由于降低的IOP所致的直接或间接作用来实现。

视网膜神经纤维层(RNFL)的光学相干断层成像术(OCT)分析

RNFL包括属于RGC的轴突，并且伴随RGC细胞体的损失而损失。与盐水治疗相比，在硫酸葡聚糖治疗后RNFL得到保存(图3和图11)，这表明硫酸葡聚糖具有神经保护作用。这种神经保护作用可以通过由于降低的IOP所致的直接或间接作用来实现。

房角的前段成像

在盐水和硫酸葡聚糖治疗的眼睛中，虹膜角膜角均保持‘开放’，这表明IOP升高并非由于房角关闭所致，参见图4。

小梁网(TM)瘢痕形成

硫酸葡聚糖治疗显著减弱TM瘢痕形成，如房角中显著降低的(层粘连蛋白P<0.001；纤连蛋白P<0.01)免疫反应性层粘连蛋白(图5)和纤连蛋白(图6)水平所证明的。

体重

硫酸葡聚糖治疗组中的大鼠更活跃。由于硫酸葡聚糖治疗的动物在治疗阶段内的体重增加少于盐水治疗的动物的体重增加，因此当在两组中测量体重时存在小但不显著的差异(图7)。

结论

硫酸葡聚糖治疗导致青光眼患眼中正常IOP的快速且可再现的恢复。正常IOP水平的恢复与来自硫酸葡聚糖治疗的大鼠的眼睛中如通过维持的RGC计数所证实的视网膜中RGC的保存以及RNFL厚度的保存有关。IOP下降可能是由于已建立的TM瘢痕元素的溶解所致，因为在硫酸葡聚糖治疗的大鼠的房角中层粘连蛋白和纤连蛋白的水平显著较低。

所述观察结果的临床意义如下。青光眼患者目前用通过限制眼液产生或增加眼液流出来降低IOP的每日滴眼剂药物来治疗。这些治疗的依从性差，因此，IOP控制不完善，导致大多数患者的进行性视力丧失。逆转导致视力丧失的眼部病状并显著改善IOP控制的治疗将非常有价值。根据实施方案的硫酸葡聚糖使得能够进行这种导致标准化IOP、RGC和RNFL保存以及TM瘢痕元素溶解的治疗。

材料和方法

研究设计

在成年雄性Sprague Dawley大鼠中通过每周重复两次眼房内(IC)注射转化生长因子-β(TGF-β)以增加眼内压(IOP)来诱导青光眼。IOP的持续增加(在两周后)导致视网膜神经节细胞死亡(30％-40％)。从实验开始起通过每天皮下注射以15mg/kg施用硫酸葡聚糖(Tikomed AB，瑞典，WO 2016/076780)以评估与对照相比的RGC保护。

第1组，n＝12只大鼠；在第0天与第28天之间24只眼睛IOP+IC TGF-β(每周两次，持续28天)+从第14天到第28天每天皮下施用硫酸葡聚糖。

第2组，n＝8只大鼠；在第0天与第28天之间16只眼睛IOP+IC TGF-β(每周两次，持续28天)+从第14天到第28天每天皮下施用媒介物(盐水)。

第3组，n＝8只大鼠；8只眼睛IOP+完整(未受伤的眼睛)和8只眼睛IOP+每天IC磷酸盐缓冲盐水(PBS)持续28天。

测量的终点

·从第0天到第28天在整个研究期间每周两次的IOP；

·在第28天的免疫组织化学，用于计数对脑特异性同源异型框/POU结构域蛋白3A(Brn3a)具有免疫反应性的RGC(RGC存活率)；

·在第28天针对层粘连蛋白和纤连蛋白的免疫组织化学，用于评估第1组和第2组中小梁网中的瘢痕形成；

·在第28天的前段和OCT成像，用于检查房角和包括RGC轴突的视网膜神经纤维层的厚度；和

·第28天的体重。

动物和手术

在这些实验中使用十六只在12h的暗/明周期下以自由获取食物和水的方式饲养的8至10周龄175-200g雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River，英国肯特)。手术是根据1986年动物法(1986Animal Act，英国)中陈述的内政部指南(Home Office guideline)和ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明(ARVO Statement for the Use ofAnimals in Ophthalmic and Vision Research)在伯明翰大学生物医学服务部门进行的。所有眼部外科手术和IOP测量都是在以1.5L/min流速使用2％-5％异氟烷/95％O₂(National Vet Supplies，英国斯托克)进行的吸入麻醉下完成的。密切监测所有大鼠的术后福利。

在第0天，使用15°一次性刀片通过角膜进入双眼前房以制造一个自闭式切口，从而使得能够通过使用自制的一次性无菌玻璃微量移液器(Harvard Apparatus，英国肯特)生成的通道一周两次(每周两次)重复进行活性人重组TGF-β1(5ng/μl；Peprotech，英国伦敦)的3.5μl IC注射(每周一和周四)，持续28天。

IOP测量结果

使用iCare Tonolab回弹式眼压计(Icare，芬兰赫尔辛基)，在每个实验的持续时间内每周两次在上午9时至11时之间记录IOP，以避免昼夜节律变化混淆读数。用5％异氟烷诱导麻醉后立即在每个测量时机使用眼压计从中央角膜采集六个回弹测量结果，以得出总体平均IOP测量结果(mmHg)，并且所有图形数据点均表示连续采集的3个读数(各有6个回弹)的平均值±SEM，以确保准确的测量结果。

OCT和前段成像

光学相干断层成像术允许体内测量视网膜厚度，其中RNFL是RGC密度的替代量度。在第28天使用Spectralis HRA3共焦扫描激光检眼镜(Heidelberg Engineering)在吸入麻醉下对所有大鼠进行OCT视网膜神经纤维层分析。房角上的前段图像与视神经头周围视网膜的OCT图像一起拍摄。使用内置软件分割图像并量化RNFL厚度。

免疫组织化学(IHC)的组织准备

将大鼠通过暴露于增加浓度的CO₂中处死，然后用100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)穿心灌注以洗出血液，之后再用100ml的在pH 7.4的PBS中的4％多聚甲醛(PFA)灌注。将用于IHC的解剖的眼睛通过在4℃下在PBS中的4％PFA中沉浸2h进行后固定，之后通过在递增浓度的蔗糖溶液(含有10％、20％和30％蔗糖的PBS；全部来自Sigma，英国普尔)中各自在4℃下沉浸24h进行冷冻保护，然后将其包埋于可剥离模具容器(Agar Scientific，英国艾塞克斯)中的最佳切割温度包埋介质(Thermo Shandon，英国朗科恩)中。将沉浸于最佳切割温度包埋介质中的眼睛在碎干冰中迅速冷冻，然后在-80℃下储存，随后使用Bright恒冷箱切片机(Bright，英国亨廷顿)在-22℃下在通过视神经头的旁矢状平面中以15μm厚度进行切片。将切片封固在带正电的载玻片(Superfrost plus；Fisher Scientific，美国匹兹堡)上，在37℃下静置2h以干燥，并且在-20℃下储存。

免疫组织化学

将冷冻的切片静置以解冻30min，之后在PBS中洗涤3×5min，然后用0.1％TritonX-100(Sigma)进行20min的渗透化处理。将切片在PBS中的0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.3％Tween-20(均来自Sigma)中封闭30min，并与一级抗体(表1)一起孵育过夜，然后在PBS中洗涤3×5min，并在室温(RT；20℃-25℃)下与二级抗体(表1)一起孵育1h。然后将切片在PBS中洗涤3×5min，并封固在含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(VectorLaboratories)的Vectorshield封固介质中。仅与二级抗体一起孵育的对照组织切片均被负染色(未显示)。

表1.免疫组织化学中使用的抗体

*具有多个剪接的RNA结合蛋白

免疫组织化学的量化

在免疫荧光染色后，在Zeiss Axioplan 2落射荧光显微镜(Carl Zeiss Ltd)上观察切片，并使用Zeiss AxioCam HRc对每种抗体使用相同的曝光时间捕捉图像。根据先前所述方法[1]对IHC进行量化。简而言之，用于TM纤维化的量化的目标区域是由TM内对于所有眼睛/治疗相同的规定大小的象限限定的，并且ECM沉积是在TM的这个限定象限内量化的，并且高于标准化背景阈值的免疫荧光像素％是使用ImageJ软件(National Institutes ofHealth，美国)来计算的。对于每种抗体，使用完整未治疗的眼睛切片来设置TM区域中亮度的阈值水平，以限定像素强度的测试组分析的参考水平。为图像随机分配编号，以确保评估者在量化过程中对治疗组不知情。

对于视网膜切片中的RGC的量化，在来自视神经任一侧的神经节细胞层中250μm线性部分的视网膜的15μm厚的旁矢状面切片中计数RPBMS+/DAPI+RGC。将对照组和治疗组中每只眼睛的四个视网膜切片进行量化。为图像随机分配编号，以确保评估者在量化过程中对治疗组不知情。

统计学

所有统计分析均使用SPSS 20(IBM，美国)进行。进行正态分布检验以确定最适合于比较治疗的统计分析。以p<0.05确定统计显著性。对于>2组比较±SEM，使用学生t检验或单因素方差分析检验IOP数据、TM纤维化和RGC存活率的显著差异，并将其作为平均值±SEM在文本中给出或以图形展示。

实施例2-在新生血管性老年性黄斑变性(nAMD)的小鼠模型中研究硫酸葡聚糖的血管作用

眼睛的病理性血管生成可以导致严重的视觉障碍。因此，坚决禁忌诱导新血管形成或增强新生血管性病状的药物。

激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)小鼠模型已经是新生血管性老年性黄斑变性(AMD)研究的重要支柱模型。通过将靶向激光损伤施用至视网膜色素上皮(RPE)和布鲁赫膜(Bruch's membrane)，所述程序诱导血管生成，从而对在新生血管AMD中观察到的标志性病状进行建模。最早在非人灵长类动物中研发的激光诱导的CNV模型现已应用于许多其他物种，最近应用的是小鼠。所述模型可以应用于研究眼部新生血管生物学的许多方面，如分子机制、遗传操纵的作用和药物治疗作用。

结果

眼底荧光素血管造影术中脉络膜新生血管膜的可视化

在眼底荧光素血管造影术中视网膜血管被清晰地可视化。脉络膜新血管形成显示为高荧光斑。图8显示来自每只小鼠的代表性荧光素血管造影术图像。不同眼睛中CNV的大小存在差异。有时将两个CNV合并在一起时伴有密集的荧光素漏出，因此将这些CNV从量化分析中排除。眼底荧光素血管造影术图像的目测检查未显示两组之间CNV大小的显著差异。

CNV分析

在每组中实施七十二个激光烧伤光斑。将由两个激光光斑合并或者由于视网膜下出血或严重炎症而尺寸过大(>100000μm²)的CNV从最终数据分析中排除。表2总结了最终数据分析中包括的CNV数。

表2.每个实验组中的CNV

组	治疗	激光光斑数	用于数据分析的CNV数
				第1组	硫酸葡聚糖	72	58
第2组	盐水	72	56

使用同工凝集素B4量化新血管形成

由于同工凝集素B4(加纳籽(Griffonia simplicifolia)凝集素I-同工凝集素B4)在内皮细胞中表达，因此已经将其用作视网膜血管的标记物。异凝集素B4也在视网膜中的激活的小神经胶质细胞和浸润性巨噬细胞中表达。同工凝集素B4阳性平均面积在测试化合物治疗组中为43972±2302μm²，并且在盐水对照组中为42432±2015μm²(图9)。两组的凝集素B4⁺病灶之间无统计学差异。

使用IV型胶原量化新生血管区域

IV型胶原形成血管基质的薄片层。因此，已经将IV型胶原用于显示新血管。在硫酸葡聚糖治疗组中，新血管的面积平均值为54681±2378μm²，相比之下，在媒介物(盐水)治疗对照组中为58215±2293μm²(图10)。两组之间无统计学上显著的差异。

结论

结果指示，在每天0.6mg/ml的剂量下，硫酸葡聚糖对激光诱导的CNV既没有抗血管生成作用，也没有促血管生成作用。这指示硫酸葡聚糖适用于眼部适应证。

材料和方法

小鼠

从贝尔法斯特女王大学的生物服务部购买二十四只10至12周龄的C57BL/6J小鼠。通过自由获取水和饲料的方式饲养所有小鼠，并将其暴露于12小时暗/明周期中。这项研究中涉及动物使用的所有程序都是根据视觉和眼科研究协会(Association for Researchin Vision and Ophthalmology，ARVO)关于眼科和视觉研究中使用动物的声明以及1986年动物(科学程序)法(英国)来进行的。所述方案是由贝尔法斯特女王大学的动物福利与伦理委员会(Animal Welfare&Ethics Board of Queen’s University Belfast)批准的。

测试化合物

测试化合物硫酸葡聚糖(Tikomed AB，瑞典，WO 2016/076780)是以6mg/ml的浓度提供的。使用无菌盐水(购自Aqupharm)将化合物稀释至工作浓度(0.6mg/ml)。

CNV诱导

通过腹膜内注射75mg/kg***和7.5mg/kg赛拉嗪来麻醉小鼠。用1％阿托品和2.5％苯肾上腺素(Bausch&Lomb)使瞳孔散大。为了诱导CNV，通过使用HGM Elite 532绿色激光器(Litechnica Ltd，英国米德尔塞克斯)以100μm的光斑大小、250mW功率和100msec的持续时间进行激光光凝术来实现布鲁赫膜-脉络膜的破裂。将激光光斑置于视网膜血管之间并且距视神经盘2至3个盘直径。在激光施加位点形成气泡指示布鲁赫膜成功破裂。这项研究中仅包括产生气泡的激光烧伤。另外，将在CNV诱导过程中显示严重视网膜下出血的激光烧伤从研究中排除。对每个视网膜施加三次激光烧伤。

药物施用

在CNV诱导后立即向所有小鼠皮下注射500μl硫酸葡聚糖或盐水。在激光-CNV诱导后每天重复一次所述注射，持续9天。详细治疗显示于表3中。

表3.实验组

荧光血管造影术

在CNV诱导后第10天，从每组中随机选择3只小鼠进行眼底荧光素血管造影术。通过腹膜内注射75mg/kg***和7.5mg/kg赛拉嗪来麻醉小鼠。用1％阿托品和2.5％苯肾上腺素使瞳孔散大。腹膜内注射100μl的1％钠荧光。使用Micron IV视网膜成像显微镜(Phoenix Research Labs)捕捉眼底图像。在荧光素血管造影术后处死小鼠并收集眼睛。

样品收集

在CNV诱导后第10天，处死所有小鼠，并小心地取出眼睛。将所有眼睛在室温下在2％多聚甲醛/PBS(Sigma-Aldrich，英国多塞特)中固定2h，然后在4℃下在PBS中洗涤并储存。使用所述方案[2，3]制备RPE-脉络膜-巩膜的全标本封片(wholemount)。简而言之，取出包括角膜、睫状体、虹膜和晶状体在内的眼的前段。在眼杯中制造五个竖直切口，然后小心地取出视网膜组织。从眼杯(含有RPE/脉络膜/巩膜)中小心地取出眼外组织，其包括结膜和眼肌。将RPE/脉络膜/巩膜的全标本封片进一步处理用于加纳籽凝集素I-同工凝集素B4和IV型胶原免疫染色。

RPE/脉络膜/巩膜的全标本封片的免疫染色

使用完善的同工凝集素B4和IV型胶原标记技术检测CNV。同工凝集素B4标记浸润性巨噬细胞和血管内皮细胞二者。IV型胶原标记血管的基底层。两种标记物已被广泛用于检测CNV。

将RPE/脉络膜/巩膜的全标本封片在室温下用0.5％Triton X-100/PBS渗透化处理1h。然后将样品用在0.5％Triton X-100/PBS中的10％BSA封闭1h，并与生物素化的加纳籽凝集素I-同工凝集素B4(GSL同工凝集素B4，1:50，Vector Laboratories Ltd，英国)和IV型胶原(1:50，BIO-RAD，英国)在4℃下一起孵育过夜。在PBS中彻底洗涤(10分钟x 3)后，将样品与链霉亲和素-异硫氰酸荧光素(FITC)(1:100，Vector laboratories，英国)和山羊抗兔AF594(1:100，Invitrogen，英国)在室温下一起孵育两小时。将样品用Vectashield封固介质(Vector Laboratories Ltd，英国)扁平封固在载玻片上，并通过荧光显微术观察。

图像采集和分析

使用Lecia荧光显微镜从上文所制备的RPE-脉络膜/巩膜的全标本封片样品采集图像。使用10倍物镜以允许捕捉CNV的全部区域。使用成像软件ImageJ分析图像。为了测量CNV的大小，手动绘制CNV的边界轮廓，并使用Image J软件自动计算大小。

统计分析

所有数据(每组中CNV的大小)均表示为平均值±SEM。使用学生t检验比较硫酸葡聚糖组与盐水对照组之间的差异。

研究设计

这项研究中使用24只C57BL/6J小鼠(10-12周龄)。将小鼠随机化为两组(每组12只小鼠)。

·第1组：硫酸葡聚糖治疗(500μl的在盐水中的0.6mg/ml硫酸葡聚糖)，在CNV诱导后每天一次皮下注射，持续9天。

·第2组：媒介物治疗(500μl盐水)，在CNV诱导后每天一次皮下注射，持续9天。

在CNV诱导后第10天，从每组中随机选择3只小鼠进行眼底荧光素血管造影术。在CNV诱导后第10天处死所有小鼠。收集眼睛并处理用于免疫组织化学研究。

实施例3-对许旺细胞(Schwann cell)中由硫酸葡聚糖诱导的基因表达的变化进行分析

结果

许旺细胞的表达分析

在数据分析之前，将未在许旺细胞中表达的基因去除。对于log2转换的表达值，将‘低于表达’水平设置为5。这留下了15,842个独特探针用于在许旺细胞培养物中进行分析。在下一步分析中，分析三组数据(D0对照与D2对照样品的比较；D0对照与D2硫酸葡聚糖处理的样品的比较；D2对照与D2硫酸葡聚糖处理的样品的比较)以确立CM对所述细胞的作用以及由硫酸葡聚糖诱导的相对变化。

在比较D0对照与D2对照样品时，585种基因在许旺细胞培养物中差异性地表达。受这些基因影响的分子功能涉及细胞运动(1.14E-07-2.49E-03)；细胞形态(5.56E-07-2.36E-03)；细胞发育(7.3E-06-2.48E-03)；细胞生长和增殖(7.3E-06-2.48E-03)；细胞组装和组织(1.23E-05-2.36E-03)；细胞功能和维持(1.23E-05-2.47E-03)；细胞死亡和存活(1.53E-05-2.51E-03)；脂质代谢(8.14E-05-1.6E-03)；小分子生物化学(8.14E-05-1.6E-03)；分子输送(1.18E-04-2.29E-03)；蛋白质运输(1.62E-04-1.6E-03)；碳水化合物代谢(3.22E-04-1.78E-03)；基因表达(3.98E-04-2.2E-03)；细胞信号传导(4.39E-04-2.25E-03)；细胞间信号传导和相互作用(5.05E-04-2.48E-03)；细胞损害(7.69E-04-1.58E-03)；细胞周期(1.12E-03-1.8E-03)；氨基酸代谢(1.6E-03-1.6E-03)；和核酸代谢(1.6E-03-1.6E-03)。

上文所呈现的值是代表这些基因与不同途径的关联的统计显著性的p值。两个p值代表观察到的统计显著性的下限和上限(p<0.05是显著的)。

如在比较D0对照与D2硫酸葡聚糖处理的样品时所评估的，硫酸葡聚糖在许旺细胞培养物中诱导1244种基因的差异性表达。受这些基因影响的分子功能涉及细胞形态(1.43E-08-8.39E-04)；细胞运动(1.4E-07-9.6E-04)；翻译后修饰(3.93E-07-6.71E-05)；蛋白质合成(3.93E-07-1.08E-04)；蛋白质运输(3.93E-07-1.26E-06)；细胞死亡和存活(2.13E-06-8.65E-04)；细胞组装和组织(7.46E-06-8.24E-04)；DNA复制、重组和修复(7.46E-06-7.46E-06)；细胞功能和维持(9.53E-06-6.46E-04)；基因表达(1.27E-05-4.92E-04)；细胞发育(1.29E-05-9.06E-04)；细胞生长和增殖(1.29E-05-9.06E-04)；细胞间信号传导和相互作用(1.97E-05-8.81E-04)；氨基酸代谢(4.22E-05-8.24E-04)；小分子生物化学(4.22E-05-8.24E-04)；脂质代谢(4.81E-05-3.64E-04)；分子输送(3.64E-04-3.64E-04)；和细胞周期(4.53E-04-4.86E-04)。

如在比较D2对照与D2硫酸葡聚糖处理的样品时所评估的，硫酸葡聚糖在许旺细胞培养物中诱导700种基因的差异性表达。受这些基因影响的分子功能涉及细胞形态(1.49E-07-5.62E-03)；细胞组装和组织(1.49E-07-5.95E-03)；细胞运动(7.24E-07-6.06E-03)；细胞死亡和存活(9.41E-06-5.95E-03)；氨基酸代谢(2.56E-05-3.7E-03)；翻译后修饰(2.56E-05-1.05E-03)；小分子生物化学(2.56E-05-3.7E-03)；细胞间信号传导和相互作用(5.05E-05-5.76E-03)；基因表达(7.18E-05-4.94E-03)；细胞周期(1.06E-04-5.95E-03)；细胞发育(1.06E-04-5.95E-03)；细胞功能和维持(1.96E-04-5.95E-03)；细胞生长和增殖(2.35E-04-5.95E-03)；DNA复制、重组和修复(2.75E-04-5.95E-03)；细胞信号传导(5.92E-04-2.54E-03)；细胞损害(6.26E-04-6.26E-04)；脂质代谢(6.26E-04-1.85E-03)；分子输送(6.26E-04-5.95E-03)；蛋白质合成(1.05E-03-1.93E-03)；对治疗剂的细胞反应(1.85E-03-1.85E-03)；蛋白质运输(2.66E-03-5.95E-03)；和RNA转录后修饰(4.32E-03-4.32E-03)。

机械分子网络模型模拟通过硫酸葡聚糖实现的差异性调控分子的作用，从而使得能够评估这些变化的功能后果。所述电脑模拟模型指示，硫酸葡聚糖抑制神经元细胞死亡；细胞凋亡；和蛋白质的合成，并且激活血管生成；细胞迁移；细胞活力；细胞存活；细胞运动；细胞增殖；细胞分化；细胞内稳态；细胞周期进程；细胞转化；和RNA表达。

表4总结了培养的许旺细胞中基因表达变化的结果。

表4-许旺细胞中基因表达变化的总体模式

在两天内在对照培养物中具有改变的表达的21种基因在相同的两天内在硫酸葡聚糖处理的培养物中完全未显示任何变化。在对照培养物中具有增加的表达的1种基因在相同的两天内在硫酸葡聚糖处理的培养物中下调。在对照培养物中下调的13种基因在所述两天内在硫酸葡聚糖处理的培养物中上调。122种基因在培养基中被生长因子显著下调，并且这种下调在硫酸葡聚糖处理的培养物中甚至更强。441种基因在对照培养物中上调，并且添加硫酸葡聚糖使得这种上调显著更强。

硫酸葡聚糖对细胞粘附的作用

硫酸葡聚糖的一种强烈的明显表型作用是对细胞粘附的作用。

基因表达的分析指示，这是由于硫酸葡聚糖对调节细胞附着的酶(包括金属肽酶，也称为基质金属蛋白酶(MMP))的表达的作用所致，参见表5。

这些分子对调节许旺细胞的细胞运动和附着的途径的聚集作用(17种分子，参见表5)使得在激活细胞运动时细胞粘附将被抑制。

表5-调节许旺细胞的细胞运动和附着的途径的分子

这个发现导致重新评估影响细胞附着和粘附相关分子及所述分子对许旺细胞的细胞附着的作用的所有分子相互作用。217种附着相关分子(197种基因和20种药物)的完整列表呈现于下文中：

ACE2、ACP1、ADAM15、ADGRB1、ADGRE2、ADIPOQ、AG490、AMBN、ANGPT1、ANTXR1、ARAP3、ARMS2、巴马司他、BCAM、BCAP31、BCAR1、苄氧羰基-Leu-Leu-Leu-醛、BMP2、BMP4、BTC、C1QBP、Ca²⁺、CA9、CADM1、CALR、花萼海绵诱癌素A、半胱天冬酶、CBL、CD209、CD36、CD44、CD46、CDH13、西立伐他汀、氯霉素、硫酸软骨素、CLEC4M、秋水仙素、I型胶原、一种或多种胶原、COMP、CRK、CRP、CSF1、CSF2RB、CTGF、姜黄素、CXCL12、环AMP、DAB2、DAG1、DCN、DDR1、去铁外螯素772SM、DOCK2、DSG2、DSG4、硬羟基磷灰石、Efna、EFNA1、EFNB、EFNB1、EGF、EGFR、EGR1、ELN、ENG、EP300、Eph受体、EPHA8、EPHB1、依替巴肽(eptifibatide)、乙二胺四乙酸、ETS1、F11R、F3、FBLN5、FBN1、Fc受体、FCN2、FERMT2、FES、FGF2、FGFR1、纤维蛋白、FN1、粘着斑激酶、FSH、FUT3、FUT6、FUT7、FYN、HACD1、肝素、组蛋白h3、组蛋白h4、HRAS、HSPG2、HTN1、透明质酸、氢化可的松、过氧化氢、ICAM1、ICAM2、IGF1R、IgG、Igg3、IL1、IL1B、IL6、ILK、整联蛋白、整联蛋白α4β1、整联蛋白α、IPO9、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA5、ITGA6、ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB5、JAK2、Jnk、KP-SD-1、LAMC1、层粘连蛋白、层粘连蛋白1、左甲状腺素、LGALS3、LIF、脂多糖、LOX、LRP1、LRPAP1、MAD1L1、甘露糖、MAPK7、MBL2、MERTK、甲硝唑、MGAT5、MMP2、Mn²⁺、NCK、NEDD9、NRG1、冈田酸、OLR1、P38 MAPK、PDGF BB、磷脂酰肌醇、PKM、血小板激活因子、PLD1、PLG、PMP22、PODXL、POSTN、PRKCD、PTAFR、PTEN、PTGER2、PTK2、PTK2B、PTN、PTPN11、PTPRZ1、吡咯烷二硫代氨基甲酸、Rac、RALB、RANBP9、RHOA、RHOB、RPSA、SDC3、SELE、选择蛋白、SELL、SEMA3A、辛伐他汀、SIRPA、SPARC、鞘氨醇-1-磷酸、SPI1、SPP1、SPRY2、SRC、STARD13、SWAP70、TEK、TFPI、TFPI2、TGFA、TGFB1、TGFBI、TGM2、THBS2、THY1、甲状腺激素、TIMP2、替罗非班(tirofiban)、TLN1、TLN2、TNF、TP63、维甲酸、VAV1、VCAM1、VCAN、Vegf、VHL、VTN、VWF和WRR-086。

在197种调节细胞附着的基因中，有17种分子在许旺细胞培养物中差异性地表达，导致附着总体上略有增加。

所述结果与硫酸葡聚糖通过减少组织纤维化和免疫细胞粘附的信号而具有的抗瘢痕形成作用有关(参见实施例1)。

受硫酸葡聚糖影响的上游调节子途径

在许旺细胞中，上游调节子分析揭示，硫酸葡聚糖通过在体系中增加几种生长因子的激活或降低所述生长因子的抑制来调节所述生长因子的作用，如表6中所示。

表6-许旺细胞中上游调节子的比较

硫酸葡聚糖上调核心蛋白聚糖基因

有趣的是，基因表达数据显示，硫酸葡聚糖激活了称为核心蛋白聚糖的天然瘢痕减少分子的产生，所述天然瘢痕减少分子通过‘清除(mopping up)’刺激成纤维细胞产生瘢痕的生长因子来进一步阻断瘢痕产生。

核心蛋白聚糖是平均具有90-140kD分子量的糖蛋白。它属于富含亮氨酸的小蛋白聚糖(SLRP)家族，并且由含有亮氨酸重复序列的蛋白核心和由硫酸软骨素或硫酸皮肤素组成的葡糖胺聚糖(GAG)链组成。它通过核心蛋白聚糖I型胶原结合区域与I型胶原原纤维结合。

核心蛋白聚糖充当转化生长因子β1/2(TGF-β1/2)拮抗剂并减少瘢痕形成。报道显示，在急性瘢痕形成中，核心蛋白聚糖的主要作用是通过中和TGF-β1/2抑制炎性纤维化来抵抗纤维发生。核心蛋白聚糖还直接与胶原结合，并且核心蛋白聚糖的功能之一是在伤口愈合期间影响胶原的组织。

先前已经在大脑病灶、脑积水和慢性脊髓伤口的模型中的瘢痕形成的抑制中描述了核心蛋白聚糖。核心蛋白聚糖还在青光眼模型中诱导现有小梁网瘢痕的纤维化。

硫酸葡聚糖诱导核心蛋白聚糖表达的增加，其中倍数变化为1.242。

结论

在许旺细胞中，具有高营养素含量和葡萄糖的对照培养物重演许旺细胞的激活。硫酸葡聚糖处理的培养物模拟在神经胶质细胞激活24小时后添加的硫酸葡聚糖的作用。

从这些结果可以清楚地看出，在许旺细胞中观察到的分子作用支持硫酸葡聚糖在以下中的作用：防止细胞凋亡；诱导血管生成；增加细胞迁移和运动；增加细胞活力和存活率；和诱导细胞分化。

硫酸葡聚糖在许旺细胞中促进细胞脱离和运动。对细胞粘附的作用主要是由于金属蛋白酶型酶的表达所致，但其他粘附分子的调节也促进了这种作用。

这种发现还可以解释如在实施例1中所观察到的硫酸葡聚糖的抗瘢痕形成作用。结果表明，在实施例1中所观察到的抗瘢痕形成作用是通过硫酸葡聚糖激活降解酶介导的，所述降解酶在受损组织中帮助组织重塑并阻断纤维发生(瘢痕形成)信号。

作为病理学反应的瘢痕形成是由TGF-β驱动的。TGF-β诱导171种分子的大型互连网络，从而引起免疫细胞粘附、细胞激活、细胞运动、细胞聚集、纤维化和TGF-β的诱导。硫酸葡聚糖的施用完全消除了TGF-β在免疫细胞粘附、细胞激活、细胞聚集、纤维化和TGF-β的自激活中诱导的作用。硫酸葡聚糖对许旺细胞中由TGF-β驱动的分子网络的这些失活作用即使在激活TGF-β时，也就是即使在过量TGF-β的存在下也是可见的。

对硫酸葡聚糖调节的基因的上游调节子的分析指示，硫酸葡聚糖增强了现有生长因子对细胞的作用，这类似于肝素的作用。一种假设是，硫酸葡聚糖与生长因子分子结合并促进与所述生长因子分子的受体的结合。

硫酸葡聚糖的抗瘢痕形成作用指示用于治疗包括青光眼在内的纤维增生(瘢痕形成)病症的潜在用途。实验结果支持硫酸葡聚糖在预防纤维增生(瘢痕形成)病症发展和使此类纤维增生(瘢痕形成)病症中已经建立的纤维化瘢痕消退中的作用。

因此，具有抗瘢痕形成作用的硫酸葡聚糖在组织重塑中将是有效的，其中需要溶解已经建立的瘢痕。硫酸葡聚糖的这种抗瘢痕形成作用被认为是先前描述的硫酸葡聚糖的作用机制的结果，所述作用机制包括例如抑制细胞粘附、诱导细胞动员、诱导金属蛋白酶和瘢痕溶解酶以及通过诱导核心蛋白聚糖来抑制TGF-β(特别是TGF-β1)。用硫酸葡聚糖获得的该后一种作用还与通过诱导核心蛋白聚糖来预防或至少抑制纤维化和瘢痕形成有关。

材料和方法

实验设计

设置n＝8x 25cm²培养瓶。在处理当天(接种后24小时)收获两个烧瓶。这代表第0天时间点。在其余烧瓶中，将三个烧瓶用对照培养基处理，并将三个烧瓶用含有硫酸葡聚糖的培养基(CM)处理，以得到0.01mg/ml的最终浓度。在48小时后收集来自经处理***细胞。因此，收集的数据代表：(a)未处理的细胞(第0天对照和第2天对照)和(b)用硫酸葡聚糖处理48小时的细胞(第2天硫酸葡聚糖处理的)。

针对所有细胞涂布组织培养板

将25cm²烧瓶通过以下方式来涂布：每瓶添加2ml的在Hank平衡盐溶液(HBSS)中的50μg/ml聚-d-赖氨酸的溶液，并在黑暗中于37℃下孵育过夜。用细胞培养水洗涤烧瓶，并在黑暗中风干30min。通过以下方式涂布烧瓶：每瓶添加1ml的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的25μg/ml层粘连蛋白的溶液，并在黑暗中于37℃下孵育2小时。在铺板细胞之前，用PBS将层粘连蛋白烧瓶洗涤三次。

人许旺细胞

通过将10％的胎牛血清(FBS)添加至高葡萄糖DMEM中来制备许旺细胞生长培养基，并预热至37℃。将细胞在37℃水浴中解冻不超过2min。

将来自12个小瓶的细胞各自温和地转移至含有10ml高葡萄糖DMEM培养基的管中，并在400相对离心场(RCF)下离心10min。使沉淀物重悬于培养基中。将来自12个小瓶的细胞混合并平均分配至预先涂布的25cm²烧瓶(n＝8)中。在37℃和5％CO₂下孵育细胞。允许细胞沉降24小时，之后进行硫酸葡聚糖处理。

药物处理

以20mg/ml的原液浓度提供硫酸葡聚糖(Tikomed AB，瑞典，WO 2016/076780)，并将其保持在4℃的温度监测冰箱中。在无菌DMEM-F12中制备新鲜的100X硫酸葡聚糖原液(1.0mg/ml)。将浓缩的药物原液无菌过滤并添加至相应的培养基(19.6ml CM和0.4ml硫酸葡聚糖原液)中。使用19.6ml CM和0.4ml DMEM-F12制备对照。将硫酸葡聚糖和CM添加至相应烧瓶中(各5ml)，以在每个培养皿中达到0.01mg/ml的硫酸葡聚糖浓度，并且使每个培养皿具有总共10ml CM。

培养物收集和细胞裂解。

将CM抽吸到洁净且有标签的15ml Falcon管中。将烧瓶(无培养基)置于-80℃冷冻器中持续30分钟。将Falcon管中的CM以3000×g旋转5分钟。去除上清液，并将小沉淀物在室温(RT，约22)下重悬于2.5ml Trizol:水(4:1)溶液中。

将冷冻的烧瓶逐一从冷冻器取出，并将Trizol-水从适当的管移至所述烧瓶中。将烧瓶在室温下静置5分钟，然后将内容物抽吸回至15ml Falcon管中(在用溶液彻底洗涤烧瓶底部之后)。在显微镜下检查烧瓶，以确保完全去除细胞。将15ml Falcon管中的收集的裂解物置于-80℃冷冻器中。

RNA提取

从冷冻器取出含有匀浆的Falcon管，并在室温下储存5分钟，以允许核蛋白复合物完全解离。

从每个样品中取出两个等份的1ml裂解物，并将200μl氯仿添加至每个等份(每1ml的在细胞裂解步骤期间使用的TRIzol试剂添加0.2ml氯仿)，并剧烈摇动所述管。将样品在室温下储存2-3分钟，然后在4℃下以12,000×g离心15分钟。

将混合物分离为三层：下层红色酚-氯仿相、中间相和无色上层水相。RNA保留在顶部水相中，DNA保留在白色中部相(中间相)中，并且蛋白质保留在粉红色底部(有机)相中。将水相的顶部的3/4转移至新的洁净的Eppendorf管中。

通过添加等量的100％乙醇从水相沉淀出RNA。将沉淀的RNA固定至旋转柱上，洗涤两次并干燥。将RNA在50μl温热的无RNA酶的水中洗脱。通过Nanodrop测量纯化的RNA的量和质量。将RNA在-80℃下储存，之后转移至Source Bioscience以供阵列分析。

表达数据的分析计划

将表达数据下载至每个细胞系的单独文件中。‘背景校正的’表达是来自阵列的“gProcessedSignal”的数据，所述数据是从相关探针的实际信号减去背景信号的结果。这是阵列分析中最常用的变量。将所有样品的背景校正信号进行log2转换用于统计分析。为了降低样品中的错误发现率，去除低于‘表达水平’的信号。对于log2转换的表达值，将‘低于表达’水平设置为5。

统计分析

基于每个阵列上的对照探针的表达模式，决定在分析前对所有阵列进行中位数中心化(Median Centering)，以减少结果的变化性。使用以下算法分析数据：

·D0对照与D2对照样品的比较-在正常培养物的细胞中观察到的表达变化

·D0对照与D2硫酸葡聚糖处理的样品的比较-在硫酸葡聚糖处理的培养物的细胞中观察到的表达变化

·D2对照与D2硫酸葡聚糖处理的样品的比较-硫酸葡聚糖在培养物中诱导的差异性表达。

进行初步分析以筛选出在三个数据集的任何组合之间没有差异性表达的基因。进行简单的不严格的方差分析(p<0.05)以寻找表达模式。消除在三个数据集之间没有变化的探针。使用火山图(Volcano plot)分析其余探针组的倍数变化和显著性。首先将超过20％(FC≥1.2或FC≤0.84)的探针表达变化视为重要的以允许检测表达模式。

质量参数

根据从许旺细胞的细胞原液检索的细胞计数计算接种密度。

阵列服务提供商的其他质量控制指示，RNA具有高质量(无降解)并且数量在来自Agilent的低输入RNA微阵列的参数内。

对原始数据的分析指示，正如所预期的，阵列之间存在显著差异。但是，这些差异(通过所有阵列上包括的相同对照样品中的差异所反映的)易于通过标准化技术来消除。消除阵列间变化的数据的所选中位数中心化没有影响预期会在代表不同RNA浓度的对照之间观察到的整体差异。

上述实施方案应被理解为本发明的几个说明性实施例。本领域技术人员应当理解，可以在不背离本发明的范围的情况下对实施方案做出各种修改、组合和改变。具体地，在技术上可能的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可以组合为其他配置。然而，本发明的范围是由所附权利要求书限定的。

参考文献

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