聚酮化合物及其制备方法和用途

文档序号:1667285 发布日期:2019-12-31 浏览:38次 >En<

阅读说明:本技术 聚酮化合物及其制备方法和用途 (Polyketide compound and preparation method and application thereof ) 是由 李力 高扬乐 张明亮 张怀东 于翠 于 2019-10-18 设计创作,主要内容包括:本发明公开了一种聚酮化合物及其制备方法和用途。该聚酮化合物具有抑制分枝结核杆菌的作用。该聚酮化合物采用微生物发酵的方法而制备得到,制备工艺简单,便于工业化生产。该聚酮化合物可以用于制备具有抑制分枝结核杆菌作用的药物。(The invention discloses a polyketide and a preparation method and application thereof. The polyketide has effect of inhibiting Mycobacterium tuberculosis. The polyketide is prepared by adopting a microbial fermentation method, the preparation process is simple, and the industrial production is facilitated. The polyketide can be used for preparing medicine with effect of inhibiting Mycobacterium tuberculosis.)

聚酮化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种聚酮化合物及其制备方法和用途,尤其涉及一种具有抑制分枝结核杆菌作用的聚酮化合物及其制备方法和用途。

背景技术

结核病由经常感染肺部的细菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)所引起。结核病目前仍是世界范围内的十大死亡原因之一,并且是单一传染源最广的疾病。据估计,2017年结核病引起1千3百万人的死亡,同时还是30万艾滋病患者的死亡原因(2018,全球结核病报告,WHO)。

目前治疗结核病的一线药物包括异烟肼(isoniazid)、利福平(rifampicin)、乙胺丁醇(ethambutol)和吡嗪酰胺(pyrazinamide)等。这些一线药物已经使用了几十年,目前已有多种耐药菌株流行。

CN109020943A公开了一种抗结核聚酮类化合物及其制备方法和用途,同时涉及该聚酮类化合物在治疗结核杆菌感染中的用途;该聚酮类化合物可通过真菌HDN51010(保藏编号:CGMCC 15889)发酵培养来获取含有该类化合物的发酵产物,然后采用正相硅胶柱层析、Sephadex LH20凝胶柱层析、中压MPLC和半制备HPLC等方法分离纯化得到;该聚酮类化合物的结构式为:

因此,寻找新的具有抑制分枝结核杆菌的聚酮化合物,这是十分必要的。

发明内容

有鉴于此,本发明的一个目的在于提供一种聚酮化合物,其具有抑制分枝结核杆菌的作用。

本发明的另一个目的在于提供上述聚酮化合物的制备方法,其采用微生物发酵的方法而制备得到,制备工艺简单,便于工业化生产。

本发明的再一个目的在于提供上述聚酮化合物在制备具有抑制分枝结核杆菌作用的药物的用途。

本发明采用如下技术方案实现上述目的。

一方面,本发明提供一种聚酮化合物,其具有如式(I)所示结构:

其中,R选自氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C6烷氧基。

根据本发明的聚酮化合物,优选地,R选自氢原子、C1-C4烷基或C3-C4环烷基。

根据本发明的聚酮化合物,优选地,R为氢原子。

另一方面,本发明提供上述聚酮化合物的制备方法,其包括使用丝状真菌FJNU001(Cordyceps sp.FJNU001)的步骤,所述丝状真菌FJNU001的保藏编号为CGMCC NO.18145。本发明的生物材料的分类名称为丝状真菌FJNU001,拉丁文学名为Cordyceps sp.FJNU001,保藏单位的全称及简称为中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC),保藏单位的地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2019年7月18日,保藏编号为CGMCCNO.18145。

根据本发明的聚酮化合物的制备方法,优选地,包括如下具体步骤:

(1)丝状真菌FJNU001发酵培养获得发酵液的步骤;

(2)将发酵液提取得到提取物的步骤;和

(3)将提取物分离纯化得到所述聚酮化合物的步骤;

其中,R为氢原子。

根据本发明的聚酮化合物的制备方法,优选地,在步骤(1)中,将丝状真菌FJNU001斜面菌种接种于马铃薯液体培养基中活化,活化条件为转速100~350r/min,培养温度20~30℃,培养时间2~6天;再进行大批量的液体发酵5~50L,采用马铃薯液体培养基,0.01~1MPa,110~135℃灭菌,置于20~30℃,100~350r/min恒温摇床中培养5~15天,得到发酵液。

根据本发明的聚酮化合物的制备方法,优选地,在步骤(1)中,所述马铃薯液体培养基中每升水中含马铃薯100~300g、葡萄糖10~30g。

根据本发明的聚酮化合物的制备方法,优选地,在步骤(2)中,将发酵液中的菌体除去,然后将除去菌体的发酵液用乙酸乙酯萃取1~5次,将萃取液合并,合并后的萃取液经脱水、浓缩得到提取物。

根据本发明的聚酮化合物的制备方法,优选地,在步骤(3)中,将提取物进行正相硅胶柱层析,采用第一洗脱剂进行洗脱,将得到的洗脱液浓缩得到亚组分;用甲醇将亚组分溶解,进行反相层析,采用第二洗脱剂进行洗脱,得到所述聚酮化合物。

再一个方面,本发明提供上述聚酮化合物用于制备具有抑制分枝结核杆菌作用的药物的用途。

本发明的聚酮化合物具有抑制分枝结核杆菌的作用。本发明采用微生物发酵的方法而制备得到聚酮化合物,上述制备工艺简单,便于工业化生产。本发明的聚酮化合物用于制备具有抑制分枝结核杆菌作用的药物的用途。

保藏说明

本发明的生物材料的分类名称为丝状真菌FJNU001,拉丁文学名为Cordycepssp.FJNU001,保藏单位的全称及简称为中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC),保藏单位的地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2019年7月18日,保藏编号为CGMCCNO.18145。

附图说明

图1为聚酮化合物和溶剂对照组的抑菌浓度图;其中,1A表示溶剂对照组;1B表示0.01μg/mL聚酮化合物;1C表示0.02μg/mL聚酮化合物;1D表示0.1μg/mL聚酮化合物。

图2为利福平和溶剂对照组的抑菌浓度图;其中,2A表示溶剂对照组;2B表示0.02μg/mL利福平;2C表示0.05μg/mL利福平;2D表示0.1μg/mL利福平。

图3为实施例1得到的式(Ⅱ)所示的聚酮化合物的基本结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但本发明的保护范围并不限于此。

<聚酮化合物>

本发明提供一种聚酮化合物,该聚酮化合物具有如式(I)所示结构:

其中,R选自氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C6烷氧基。优选地,R选自氢原子、C1-C4烷基或C3-C4环烷基;更优选地,R为氢原子。

本发明中,所述烷基是直链或支链烷基。直链或支链烷基的例子是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基或异己基等。所述环烷基根据其性质,必须具有至少三个碳原子,其例子是环丙基、环丁基、环戊基或环己基;所述环烷基还可以另外携带一个或多个,例如1、2、3或4个(C1-C4)-烷基。所述烷氧基中的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基或异己基中的任一种。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。C3-C4环烷基的实例包括但不限于环丙基或环丁基。

根据本发明的一个具体实施方式,聚酮化合物具有如下式(Ⅱ)所示的结构式:

本发明的聚酮化合物的主体结构(当取代基R为氢原子时)可以通过常规化学合成方法或微生物发酵的方法而制备得到。优选地,本发明的聚酮化合物的主体结构(当取代基R为氢原子时)通过微生物发酵的方法而制备得到。

<聚酮化合物的制备方法>

本发明还提供上述聚酮化合物的制备方法,包括使用丝状真菌FJNU001(Cordyceps sp.FJNU001)的步骤,所述丝状真菌FJNU001的保藏编号为CGMCC NO.18145。

本发明的聚酮化合物的制备方法包括如下具体步骤:

(1)丝状真菌FJNU001发酵培养获得发酵液的步骤;

(2)将发酵液提取得到提取物的步骤;和

(3)将提取物分离纯化得到所述聚酮化合物的步骤;

其中,R为氢原子。

在本发明中,当R选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C6烷氧基时,聚酮化合物的主体结构(当取代基R为氢原子时)可以通过上述制备方法得到,而后聚酮化合物的主体结构可通过常规化学合成方法得到如式(I)所示结构的聚酮化合物。

在步骤(1)中,将丝状真菌FJNU001斜面菌种接种于马铃薯液体培养基中活化,活化条件为转速100~350r/min,培养温度20~30℃,培养时间2~6天;再进行大批量的液体发酵5~50L,采用马铃薯液体培养基,0.01~1MPa,110~135℃灭菌,置于20~30℃,100~350r/min恒温摇床中培养5~15天,得到发酵液。活化条件优选为转速150~300r/min,培养温度22~28℃,培养时间3~5天。活化条件更优选为转速180~250r/min,培养温度24~26℃,培养时间3.5~4.5天。马铃薯液体培养基的体积可以为50~300mL,优选为80~250mL,更优选为100~200mL。大批量的液体发酵的体积优选为10~40L,更优选为15~30L。大批量的液体发酵时压力优选为0.05~0.5MPa,更优选为0.08~0.3MPa。灭菌温度优选为115~130℃,更优选为120~125℃。大批量的液体发酵的条件优选为22~28℃,150~300r/min恒温摇床中培养7~13天。大批量的液体发酵的条件优选为24~26℃,180~250r/min恒温摇床中培养8~12天。所述马铃薯液体培养基优选为马铃薯液体培养基中每升水中含马铃薯100~300g、葡萄糖10~30g。所述马铃薯液体培养基更优选为马铃薯液体培养基中每升水中含马铃薯100~300g、葡萄糖10~30g。所述马铃薯液体培养基可以为自然PH,无需额外添加调节剂进行调节。

在步骤(2)中,将发酵液中的菌体除去,然后将除去菌体的发酵液用乙酸乙酯萃取1~5次,将萃取液合并,合并后的萃取液经脱水、浓缩得到提取物。萃取的次数优选为2~4次。浓缩可以采用旋转蒸发器进行。每次萃取所用的乙酸乙酯的量可以为发酵液的体积的0.5~2倍,优选为0.8~1.5倍,更优选为0.9~1.1倍。根据本发明的一个具体实施方式,将发酵液中的菌体除去,然后将除去菌体的发酵液用0.9~1.1倍体积的乙酸乙酯萃取3~4次,将萃取液合并,合并后的萃取液经脱水、浓缩得到提取物。

在步骤(3)中,将提取物进行正相硅胶柱层析,采用第一洗脱剂进行洗脱,将得到的洗脱液浓缩得到亚组分;用甲醇将亚组分溶解,进行反相层析,采用第二洗脱剂进行洗脱,得到所述聚酮化合物。

在步骤(3)中,正相硅胶柱层析时,优选将提取物采用干法上样进行正相硅胶柱层析。正相硅胶柱层析时,第一洗脱剂优先为体积比为1:1~10的不同梯度的正己烷与丙酮溶液;更优选为体积比为1:1~5的不同梯度的正己烷与丙酮溶液;进一步优选为体积比为5:1、2:1、1:1、1:2、1:5的不同梯度的正己烷与丙酮溶液。用甲醇将亚组分溶解时,甲醇与亚组分的用量配比并没有特别限制。反相层析时,第二洗脱剂优选为10~100vol%的乙腈的水溶液;更优选为30~80vol%的乙腈的水溶液;进一步优选为50~70vol%的乙腈的水溶液。根据本发明的一个具体实施方式,将提取物采用干法上样进行正相硅胶柱层析,采用第一洗脱剂进行洗脱,第一洗脱剂为体积比为5:1、2:1、1:1、1:2、1:5的不同梯度的正己烷与丙酮溶液,将含有目标组分的洗脱液浓缩得到亚组分;用甲醇将亚组分溶解,进行反相层析,采用第二洗脱剂进行洗脱,第二洗脱剂为50~70vol%的乙腈的水溶液,得到式(Ⅱ)所示的聚酮化合物。

根据本发明的一个具体实施方式,聚酮化合物的制备方法包括如下具体步骤:

(1)将丝状真菌FJNU001斜面菌种接种于马铃薯液体培养基中活化,活化条件为转速100~350r/min,培养温度20~30℃,培养时间2~6天;再进行大批量的液体发酵5~50L,采用马铃薯液体培养基,0.01~1MPa,110~135℃灭菌,置于20~30℃,100~350r/min恒温摇床中培养5~15天,得到发酵液;其中,所述马铃薯液体培养基中每升水中含马铃薯100~300g、葡萄糖10~30g;

(2)将发酵液中的菌体除去,然后将除去菌体的发酵液用乙酸乙酯萃取1~5次,将萃取液合并,合并后的萃取液经脱水、浓缩得到提取物;

(3)将提取物进行正相硅胶柱层析,采用第一洗脱剂进行洗脱,将得到的洗脱液浓缩得到亚组分;用甲醇将亚组分溶解,进行反相层析,采用第二洗脱剂进行洗脱,得到所述聚酮化合物。

<聚酮化合物的用途>

本发明的聚酮化合物具有抑制分枝结核杆菌作用,可以用于制备具有抑制分枝结核杆菌作用的药物。聚酮化合物如上所述,在此不再赘述。

本发明中,所述具有抑制分枝结核杆菌作用的药物可以聚酮化合物作为唯一活性成分;也可以包含其他具有抑制分枝结核杆菌作用的活性成分,或者包含本身不具有抑制分枝结核杆菌作用、但能够辅助聚酮化合物发挥抑制分枝结核杆菌作用的活性成分。

本发明中,所述具有抑制分枝结核杆菌作用的药物可以为原料药,也可以为药物制剂。

根据本发明的一些实施方式,本发明的聚酮化合物具有如下式(Ⅱ)所示的结构式:

上述式(Ⅱ)所示的聚酮化合物具有抗结核分枝杆菌(TB菌)活性,且最低抑制浓度为0.02μg/mL。

<测试方法>

核磁共振:将产物溶于氘代二甲基亚砜中,进行核磁分析,分析类型有氢谱(1HNMR),碳谱(13C NMR)。核磁共振仪为瑞士Bruker公司AVANCE NEO 600/(14.1T/600MHz)。

实施例1聚酮化合物的制备

聚酮化合物的结构式如下式(Ⅱ)所示:

式(Ⅱ)所示的聚酮化合物的制备方法包括如下步骤:

(1)丝状真菌Cordyceps sp.FJNU001发酵培养获得发酵液的步骤

将丝状真菌Cordyceps sp.FJNU001斜面菌种接种于装有150mL马铃薯液体培养基的500mL三角瓶中活化,活化条件为转速220r/min,培养温度25℃,培养时间4天;再进行大批量的液体发酵20L,采用马铃薯液体培养基,0.1MPa,121℃灭菌30min,置于25℃,220r/min恒温摇床中培养10天,得到发酵液。所述马铃薯液体培养基中每升水中含马铃薯200g、葡萄糖20g。

(2)将发酵液提取得到提取物的步骤

将发酵液中的菌体除去,然后将除去菌体的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次,将萃取液合并,合并后的萃取液经脱水、浓缩得到提取物。

(3)将提取物分离纯化得到式(Ⅱ)所示的聚酮化合物的步骤

将提取物采用干法上样进行正相硅胶柱层析,采用第一洗脱剂进行洗脱,第一洗脱剂为体积比为5:1、2:1、1:1、1:2、1:5的不同梯度的正己烷与丙酮溶液,将含有目标组分的洗脱液浓缩得到亚组分;用甲醇将亚组分溶解,进行反相层析,采用第二洗脱剂进行等度洗脱,第二洗脱剂为60vol%的乙腈的水溶液,得到式(Ⅱ)所示的聚酮化合物。

实施例2聚酮化合物的MIC抑菌试验

1.实验材料

培养基Middlebrook 7H11购自Sigma公司。

利福平即为rifampicin,购自Sigma公司。

结核分枝杆菌为ATCC 25177(Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC25177)。

2.实验过程及结果

采用固体平板法进行实施例1中式(Ⅱ)所示的聚酮化合物的MIC抑菌试验,如下:

无菌操作下,当培养基Middlebrook 7H11冷却至约65℃时加入0.2%甘油和10%牛血清,同时加入10μL含有不同浓度实施例1中式(Ⅱ)所示的聚酮化合物的样品,所述的聚酮化合物的终浓度分别为0.01μg/mL、0.02μg/mL和0.1μg/mL,设3个平行实验,同时设添加等体积DMSO为溶剂对照组,设利福平为阳性对照组(浓度为0.02μg/mL、0.05μg/mL和0.1μg/mL),倒平板,等平板凝固后,在平板上面加入100μL终浓度为103CFU/ml的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC 25177)菌液。置37℃恒温箱内培养25天,观察结核分枝杆菌生长情况。聚酮化合物和溶剂对照组的抑菌浓度图如图1所示。利福平和溶剂对照组的抑菌浓度图如图2所示。

由图1、2可知,所述聚酮化合物的浓度为0.02μg/mL时,结核杆菌完全不生长;利福平的浓度为0.05μg/mL时,结核杆菌完全不生长;这表明所述聚酮化合物具有抗结核分枝杆菌(TB菌)活性,且最低抑制浓度为0.02μg/mL。

实验例

将实施例1得到的式(Ⅱ)所示的聚酮化合物进行结构鉴定。

式(Ⅱ)所示的聚酮化合物为浅黄色,可溶于甲醇,HR-ESI-Q-TOF MS:m/z484.3013([M+H]+,calculated for C29H42NO5,484.3063)。

由核磁共振的氢谱(1H NMR)、核磁共振的碳谱(13C NMR)以及DEPT谱,表明式(Ⅱ)所示的聚酮化合物的不饱和度为10,含有5个甲基,5个亚甲基,14个次甲基(其中7个为烯碳),5个季碳(其中2个为碳基,2个为烯碳);12个前场13C信号表明所述化合物含有2个酮基,1个酰胺键或者羰基以及5个双键,表明所述化合物有3个环;根据1H–1H COSY和1H–13CHMBC以及NH和OH信号表明所述化合物有一个5-羟基-1H-吡咯-2(5H)-酮结构单元(C1’-C6’);HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation,异核多重键相关谱)实验中观察到甲基H22与C20/C21有碳氢远程相关信号,甲基H12与C9/C10/C11/C13有碳氢远程相关信号,甲基H7与C4/C5/C6/C8有碳氢远程相关信号,甲基H23与C1/C2/C13有碳氢远程相关信号以及从1H-1HCOSY(氢氢二维谱)实验中观察到的H5与H6,H6与H7,H8与H9,H14与H15,H15与H16,H16与H17,H17与H18,H18与H19,H19与H20,H21与H22之间的氢氢相关,以及核磁共振的碳谱(13C NMR)实验中C14(δC 134.44)、C15(δC 132.72)、C16(δC133.97)、C17(δC131.94)、C18(δC133.20)、C19(δC 131.68)化学位移值。综合以上数据,可以推测出所述化合物的基本结构如图3所示。

核磁共振的氢谱(1H NMR):3号碳为CH,化学位移为1.72,多重重叠峰;4号碳为CH2,一个化学位移为1.10,双峰,耦合常数10.4,另外一个化学位移2.01,多重峰;5号碳为CH2,化学位移分别为1.80,1.12,都是多重重叠峰;6号碳为CH2,化学位移分别为1.54,0.95,都是多重重叠峰;7号碳为CH3,化学位移为1.58,四重峰,耦合常数为2.4和3.2;8号碳为CH2,都是二重峰,化学位移分别为0.88,1.86,耦合常数分别为11.8和13.4;9号碳为CH,化学位移为1.86,四重峰,耦合常数为13.4和12.2;10号碳为CH,化学位移为1.86,双重峰,耦合常数为10.2;12号碳为CH3,化学位移为0.94,双重峰,耦合常数为6.5;13号碳为CH,化学位移为3.75,多重峰;14号碳为CH,化学位移为5.34,多重峰;15号碳为CH,化学位移为6.03,多重重叠峰;16号碳为CH,化学位移为6.03,多重重叠峰;17号碳为CH,dd峰,化学位移为5.85,耦合常数为14.9和9.6;18号碳为CH,dq峰,化学位移为5.67,耦合常数为14.6和7.2;19号碳为CH,化学位移为6.03,多重重叠峰;20号碳为CH2,都是dt峰,化学位移分别为2.17,2.24,耦合常数分别为14.0,6.8和13.7,6.8;21号碳为CH,化学位移为3.75,多重峰;22号碳为CH3,化学位移为1.13,双重峰,耦合常数为6.2;23号碳为CH3,化学位移为1.45,双重峰,耦合常数为7.6;3’号碳为CH3,化学位移为3.02,单峰;5’号碳为CH3,化学位移为3.35,单峰;6’号碳为CH2,化学位移分别为3.95,3.86,前者为dd峰,耦合产物为12.1,2.8,后者为多重峰。

核磁共振的碳谱(13C NMR):1号碳化学位移为201.69,2号碳的化学位移为49.85,3号碳的化学位移为41.19,4号碳的化学位移为29.35,5号碳的化学位移为37.00,6号碳化学位移为34.82,7号碳的化学位移为22.60,8号碳的化学位移为43.84,9号碳的化学位移为40.53,10号碳化学位移为127.35,11号碳的化学位移为134.22,12号碳的化学位移为22.95,13号碳的化学位移为51.00,14号碳化学位移为134.44,15号碳的化学位移为132.72,16号碳的化学位移为133.97,17号碳的化学位移为131.94,18号碳化学位移为133.20,19号碳的化学位移为131.68,20号碳的化学位移为43.51,21号碳的化学位移为68.52,22号碳化学位移为22.99,23号碳的化学位移为14.47,1’号碳的化学位移为102.20,2’号碳的化学位移为177.81,3’号碳的化学位移为27.37,4’号碳的化学位移为192.92,5’号碳的化学位移为68.49,6’号碳的化学位移为59.88。

由此推测该化合物的化学结构式如下所示:

本发明并不限于上述实施方式,在不背离本发明的实质内容的情况下,本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

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