阅读说明：本技术 一种遗传性耳聋基因的检测方法 (Detection method of hereditary hearing loss gene ) 是由 车万里 于 2019-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种遗传性耳聋基因的检测方法,属于基因检测的技术领域。其技术方案要点是,PCR扩增反应条件为：35-37℃保温3-5min,94-95℃预变性3-5min,95-96℃变性30-32s,55-58℃退火30-32s,68-72℃延伸42-46s,35-38次循环,60-65℃延伸8-12min,该检测方法通过改变扩增反应的条件,减少基因芯片假阳性的结果,提高PCR产物的特异性程度,降低后期PCR扩增产物与探针杂交过程中假阳性出现的概率,提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性。(The invention discloses a detection method of a hereditary hearing loss gene, belonging to the technical field of gene detection. The technical scheme is characterized in that the PCR amplification reaction conditions are as follows: the detection method comprises the steps of preserving heat at 35-37 ℃ for 3-5min, pre-denaturing at 94-95 ℃ for 3-5min, denaturing at 95-96 ℃ for 30-32s, annealing at 55-58 ℃ for 30-32s, extending at 68-72 ℃ for 42-46s, circulating for 35-38 times, and extending at 60-65 ℃ for 8-12 min.)

一种遗传性耳聋基因的检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测的技术领域，特别涉及一种遗传性耳聋基因的检测方法。

背景技术

耳聋是中国第一大残疾，其中遗传因素所致的耳聋约占60％。遗传性耳聋主要是指基因异常所致的耳聋，是人类最常见的感觉神经系统缺陷。这种疾病通过常染色体隐性，常染色体显性，X-连锁遗传和线粒体遗传方式遗传给下一代。国内耳聋分子流行病学研究表明，大部分非综合征型耳聋由以下4个基因突变引起：GJB2(35delG、176dell6、235delC及299del AT)、GJB3(538C>T)、SLC26A4(IVS7—2A>G、2168A>G)和线粒体DNA12SrRNA(1555A>G、C1494C>T)。

随着分子遗传学技术的快速发展和基因芯片技术的广泛应用，耳聋芯片成为NSHL基因诊断的主要检测方法。通过对基因的识别可以预防先天性耳聋出生缺陷，控制药物致聋风险，预防或者延缓耳聋的发生发展。但目前运用基因芯片技术对耳聋基因进行检测时，PCR扩增过程中往往容易出现非特异性扩增，引起检测结果的假阳性，容易对后期的基因芯片杂交过程产生影响，影响了该检测技术的检测准确性。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的在于：提供一种遗传性耳聋基因的检测方法，以达到提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性的效果。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的：一种遗传性耳聋基因的检测方法，包括以下步骤：

(a)提取待测样本基因组DNA；

(b)PCR扩增杂交产物：扩增反应条件为：35-37℃保温3-5min，94-95℃预变性3-5min，95-96℃变性30-32s，55-58℃退火30-32s，68-72℃延伸42-46s，35-38次循环，60-65℃延伸8-12min；

(c)PCR产物与基因芯片杂交：制备磁珠、磁珠纯化、磁珠富集PCR产物、PCR产物变性、制备杂交反应混合物、芯片杂交；

(d)基因芯片的洗涤与干燥；

(e)基因芯片的结果分析；

所述基因芯片含有遗传性耳聋突变基因的特异性探针。

将人类的待测样本(如血液、血清或组织等)采用本领域通用的DNA提取方法提取基因组DNA，然后将待测样本提取的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，扩增得到的PCR产物经过磁珠吸附纯化后进行基因芯片杂交，以检测待测样本的DNA基因组中是否有突变的耳聋基因与探针结合，以此来确定被检侧的人体是否有耳聋的风险。

通过采用上述方案，通过改变扩增反应的条件，先将待扩增的混合物保温一定的时间，使PCR扩增体系在适宜的温度稳定一段时间，使其中的DNA聚合酶在适宜的温度下激发活性，以便于后期扩增期间保持较高的活性，提高PCR扩增的效率。而且优化扩增中预变性和变性的温度和时间，可以明显地减少假阳性的结果；优化退火和延伸的时间和温度，使PCR的非特异性扩增降低，提高引物与模板的结合效率，提高PCR扩增的效率，提高PCR产物的特异性程度，降低后期PCR扩增产物与探针杂交过程中假阳性出现的概率，提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性。

本发明进一步设置为：所述步骤(b)中，变性到退火之间的降温速率为0.4-0.8℃/s，退火到延伸之间的升温速率为0.2-0.6℃/s。

通过采用上述方案，在变性过程中DNA双链打开完成之后，逐渐将温度以特定的速率降低至退火的温度，使引物更好地与解旋的DNA链结合；然后再升温至延伸的温度，使引物结合后DNA聚合酶按照模板合成新的链。优选降温和升温的速率，可以进一步提高PCR扩增反应的速率。

本发明进一步设置为：所述步骤(b)中，PCR扩增体系包括：5×Buffer为5.0μl，上游引物为1.0μl，下游引物为2.0μl，dNTP为2.0μl，模板DNA为1.0μl，Prime STAR为0.3μl，ddH₂O为13.7μl，总体积为25μl。

通过采用上述方案，按照各组分的体积大小依次加入混合后配置成PCR扩增体系，其中5×Buffer有助于Prime STAR DNA聚合酶的稳定，为DNA聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件；上下游引物的功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链；dNTP可以提供核酸链组成的核苷酸原料。优化PCR扩增体系中各组分的配比，可以提高PCR扩增反应的效率。

本发明进一步设置为：所述步骤(c)中，磁珠富集PCR产物的步骤包括：

(i)将纯化后的磁珠与PCR产物吹吸5-10次混匀，静置5-8min，得到PCR产物-磁珠混合物；

(ii)将产物-磁珠混合物用磁力吸附至溶液澄清，弃去溶液。

通过采用上述方案，磁珠为纳米级磁珠微珠，其表面标记了一种官能团，可以与核酸DNA发生吸附反应，然后在磁场条件下可以发生聚集或分散。采用磁珠富集PCR产物，可以更好地将核酸DNA与蛋白质、多糖、脂肪等其它杂质分离，提高PCR产物的纯度，减少杂质对后续基因芯片检测结果的影响。

本发明进一步设置为：所述步骤(c)中，基因芯片杂交的温度为45-55℃，时间为50-70min。

通过采用上述方案，优选基因芯片的杂交温度和杂交时间，可以大大提高探针与待测样本的杂交效率，减少荧光染料在空气中被氧化的几率，提高杂交信号，进而提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性。

本发明进一步设置为：所述步骤(d)中，基因芯片洗涤采用洗涤液进行洗涤；洗涤液包括洗涤液I和洗涤液II；

洗涤液I，按体积百分比包括以下组分：ddH₂O 96-98％，20×SSC 1.2-1.6％，10％SDS0.8-1.2％；洗涤液II，按体积百分比包括以下组分：ddH₂O 99-99.9％，20×SSC按照0.2-0.5％。

本发明进一步设置为：所述步骤(d)中，基因芯片洗涤的洗涤程序包括以下步骤：(i)洗涤液I的洗涤条件：温度35-38℃，时间130-140s；

(i)洗涤液II的洗涤条件：温度35-38℃，时间100-110s。

通过采用上述方案，优选洗涤液和洗涤的条件，可以更好地洗去未结合的荧光物质，减少未结合的荧光物质对检测结果的影响，还能减少检测信号的损失。

本发明进一步设置为：所述基因芯片至少包含一个阳性对照和一个阴性对照。

本发明进一步设置为：所述阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为ddH₂O。

通过采用上述方案，基因芯片上设置至少一个阳性对照和阴性对照，优选阳性对照和阴性对照的种类，可以通过阳性对照的结果和阴性对照的结果对比，减少基因芯片可以减少环境和人为因素造成的错误的诊断。

本发明进一步设置为：所述上游引物和下游引物的0.1-0.5μM。

通过采用上述方案，优选上游引物和下游引物的浓度在相同的浓度范围内，可以避免上游引物和下游引物浓度差距过大而造成的低效率的不对称扩增，进一步提高PCR扩增反应的效率。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

上述遗传性耳聋基因的检测方法，通过改变扩增反应的条件，减少假阳性的结果，提高PCR产物的特异性程度，降低后期PCR扩增产物与探针杂交过程中假阳性出现的概率，提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性。

具体实施方式

以下对本发明作进一步详细说明。

下述待测样本为人的血液样品。

实施例1

一种遗传性耳聋基因的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本的基因组DNA，采用市售的基因组提取按照说明书操作进行提取；

(2)PCR扩增杂交产物：

PCR扩增体系包括：5×Buffer为5.0μl，上游引物为1.0μl，下游引物为2.0μl，dNTP为2.0μl，模板DNA为1.0μl，Prime STAR为0.3μl，ddH₂O为13.7μl，总体积为25μl；上游引物和下游引物的浓度均为0.5μM；

扩增反应条件为：37℃保温5min，95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，70℃延伸45s，35次循环，60℃延伸10min，得到PCR产物；

变性到退火之间的降温速率为0.4℃/s，退火到延伸之间的升温速率为0.2℃/s；

(3)PCR产物与基因芯片杂交：

制备磁珠：取200μl离心管，加入30μl结合缓冲液，再加入9μl磁珠，涡旋混匀，置于磁力架上，吸附15s，待溶液澄清，去除溶液；将离心管撤离磁力架，再加入30μl结合缓冲液，漩涡混匀，得到磁珠悬液；

磁珠纯化和富集PCR产物：先将纯化后的磁珠与PCR产物吹吸5-10次混匀，静置5-8min，得到PCR产物-磁珠混合物；再将产物-磁珠混合物用磁力吸附至溶液澄清，弃去溶液，撤离磁板；

PCR产物变性：加入新配制的0.1M NaOH 120μl，将聚集在离心管壁上的磁珠吹吸混合均匀，静置10min；然后将离心管置于磁板上，吸附15s，待溶液澄清，弃去溶液，不撤离磁力板；制备杂交反应混合物：向变性结束后的离心管中加入温浴后并充分混匀的杂交缓冲液40μl，置于磁板上吸附5s，待溶液澄清，吸弃溶液，撤离磁板；向上述管中加入杂交缓冲液20μl，将聚集在离心管壁上的磁珠吹吸打散，充分混匀，准备杂交；

基因芯片杂交：吸取15μl杂交混合物经加样孔加入芯片点阵中，密封好杂交盒后，温度45-55℃，杂交时间50-70min；阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为ddH2O；

(4)基因芯片的洗涤与干燥；

洗涤液I，按体积百分比包括以下组分：ddH₂O 97.5％，20×SSC 1.5％，10％SDS 1％；洗涤条件：温度37℃，时间140s；

洗涤液II，按体积百分比包括以下组分：ddH₂O 99.7％，20×SSC按照0.3％；洗涤条件：温度37℃，时间110s；

洗涤完成后干燥：基因芯片采用本领域常规的方式进行干燥；

(5)基因芯片的结果分析：将基因芯片***扫描仪中根据点样位置进行扫描，并使用软件分析杂交结果。扫描结果显示检测监控系统中阳性对照有荧光信号；阴性对照没有荧光信号，再在疾病诊断系统中根据信号的有无来判断待测样品是阴性还是阳性。

实施例2

与实施例1的区别之处在于，步骤(2)中上游引物和下游引物的浓度均为0.1μM。

实施例3

与实施例1的区别之处在于，步骤(2)中扩增反应条件为：35℃保温3min，95℃预变性3min，95℃变性32s，55℃退火32s，68℃延伸46s，38次循环，65℃延伸8min，得到PCR产物；变性到退火之间的降温速率为0.4℃/s，退火到延伸之间的升温速率为0.2℃/s。

实施例4

与实施例1的区别之处在于，步骤(2)中扩增反应条件为：37℃保温3min，94℃预变性5min，96℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸42s，3次循环，60℃延伸12min，得到PCR产物；变性到退火之间的降温速率为0.8℃/s，退火到延伸之间的升温速率为0.6℃/s。

实施例5

与实施例1的区别之处在于，步骤(3)中基因芯片杂交的温度45℃，杂交时间70min。

实施例6

与实施例1的区别之处在于，步骤(3)中基因芯片杂交的温度55℃，杂交时间50min。

实施例7

与实施例1的区别之处在于，步骤(4)中洗涤液I的洗涤条件：温度35℃，时间130s。

实施例8

与实施例1的区别之处在于，步骤(4)中洗涤液II的洗涤条件：温度35℃，时间100s。

实施例9

与实施例1的区别之处在于，步骤(4)中洗涤液I，按体积百分比包括以下组分：ddH₂O98％，20×SSC 1.2％，10％SDS 0.8％。

实施例10

与实施例1的区别之处在于，步骤(4)中洗涤液II，按体积百分比包括以下组分：ddH₂O99％，20×SSC按照1％。

对比例1

与实施例1的区别之处在于，步骤(2)中扩增反应条件不包括保温的过程。

对比例2

与实施例1的区别之处在于，步骤(2)中扩增反应条件中变性到退火之间的降温速率为2℃/s，退火到延伸之间的升温速率为1℃/s。

准备120份患耳聋病的人类血液待测样品，分成12组，每组10份检测样品，每组按照实施例1-10与对比例1-2的检测方法对待测样本的GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体DNA12SrRNA基因是否突变进行检测，对检测率进行统计，检测结果见表1：

表1

注：上述GJB2/阳性/阴性指的是每组中10份待测样本检测出GJB2基因突变的概率，阳性对照检测出GJB2基因突变的概率，阴性对照中检测出GJB2基因突变的概率。

由表1的结果可知，实施例1-10中待测样本中于常见的四种GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体DNA12SrRNA耳聋突变基因的检出率分别在75％以上、70％以上、62％以上和52％以上。每个组中的阳性对照的检出率达100％，阴性对照的检出率为0％。

与实施例1相比，实施例2中调整了PCR扩增反应中的引物浓度，引物浓度减小且在优选的范围内；实施例3和实施例4中调整了PCR扩增中的反应条件，调整后的参数依然在优选的范围内；实施例5和实施例6中调整了基因芯片的杂交温度，调整后的参数依然在优选的范围内；实施例7和实施例8中调整了基因芯片洗涤过程中的洗涤条件；实施例9和实施例10中调整了基因芯片洗涤过程中使用的洗涤液的组分配比。对比例1和对比例2与实施例1相比，实施例1中去除了扩增反应中预变性之前的保温过程；对比例2中改变了扩增过程中升温和降温的速率，且不再优选的范围内。

对比实施例1和实施例9-10的结果，对比例1-2与实施例1的结果可知，本发明中提供的耳聋基因芯片的检测方法可操作性强，基因芯片中检测耳聋突变基因的准确性高和灵敏性高。

上述具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。