具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本发明实施例一种柯乐猪的保种方法，以原位保种和异位保种相结合，采微卫星标记技术分析群体内遗传多样性及保种效果的监测，或者利用SNP芯片分析技术对柯乐猪保种群进行各世代间的群体遗传结构和遗传多样性分析，为该品种资源的保护和利用提供分子水平上的科学依据。

本发明整体以“核心产区小群体活体保种+多场联合保种+生物技术保种”的保护体系，将柯乐猪的保种、选育与开发利用有机结合，以实现柯乐猪生态养业可持续发展，适应于当前的柯乐猪保种繁育，具有较好的实用性和可推广性。

本发明实施例中，原位保种包括小群体规模保种和多场联合保种，其中，

所述小群体规模保种包括以下步骤：

1)确定小群体规模

保种群在100～200头之间，公猪只有4～6个血统的群体，公母留种比例为1∶5，猪的每世代近交系数增量不超过0.5％～1.0％，留种方式采用各家系等量留种；

2)增加猪小群体内的遗传多样性

为增加猪小群体内的遗传多样性，可以在同一猪品种内的不同类群间相互杂交或轮回杂交，例如不同毛色柯乐猪之间的杂交；或者可以适当引入部分母猪外血，用外血(包括：同一品种的其他类群，与本品种相近的其他品种，或外种猪)进行杂交，F1代再与本品种回交或再回交，根据性能决定引入外血的比例；选出优秀的公猪或母猪，再与群内其他猪杂交。由此来缓解小群体因近交而引起退化的问题。

所述多场联合保种包括：设立多个保种点及扩繁场，建立保种选育核心群、保种扩繁群、生产基地三级良繁体系，对柯乐猪进行商品化选育，提高生产性能，保护柯乐猪种质资源，确保资源不丢失，并对柯乐猪种活体及其遗传材料进行质量检测，使柯乐猪达到品种标准。具体而言，多场联合保种包括：1)设立多个保种点及扩繁场，建立保种选育核心群、保种扩繁群、商品生产基地三级良繁体系，因地制宜制定保护规划，建立良种场、良种扩繁场及商品生产场，有计划、有目标的对柯乐猪进行商品化选育，提高生产性能，保护柯乐猪种质资源，确保资源不丢失；2)选择当地养殖条件达标、养殖技术好、责任心强的养殖专业户联合保种，按照保种场的规范要求对专业户进行统一管理、统一配种、统一防疫、统一建档、统一饲养技术指导。避免保种场因感染非洲猪瘟病毒而造成全场覆没，降低柯乐猪保种风险，使得该地方优质种质资源得到更加充分的利用、保存和开发；3)建立种畜禽监督检验中心,对柯乐猪种活体及其遗传材料(受精卵、精液、胚胎等)进行质量检测,严格对柯乐猪质量进行管理,提高品质，使柯乐猪达到品种标准。

本发明实施例中，异位保种方法为，对柯乐猪的精液、卵母细胞、体细胞及胚胎的进行冷冻保存，协同体细胞核移植的方法克隆出大量与供体遗传信息一致的个体；根据不同组织细胞建立各自细胞系或细胞株进行低温长期保存，并建立DNA文库。

具体而言，异位保种方法包括：1)精液、卵母细胞及胚胎冷冻保存技术：精液冷冻：精液采集后进行品质检查，包括颜色、状态、味道、活率、形态和密度检查，根据精子密度和活率进行精液稀释，放入17℃冰箱中平衡40分钟，平衡后需要添加适当营养物质(葡萄糖)、缓冲剂(磷酸盐、柠檬酸钠)、抗氧化剂(维生素E、谷胱甘肽)、抗冻剂(甘油、乙酰胺)以及其他添加剂，再通过逐步降温，最后装管和封口，置于液氮中保存；卵母细胞和胚胎冷冻保存：主要以玻璃化法，将胚胎或卵母细胞含高浓度冷冻保护剂的冷冻液里，直接投入液氮快速冷冻保存；2)超数排卵、胚胎移植等繁殖技术，对于7～8月龄的母猪，在发情周期的15～18天，采用国产PMSG(1000IU～1250IU)配合hCG(1000IU～1250IU)肌肉注射，可获得良好的超排效果，配合胚胎移植技术，鉴定优秀种猪的胚胎，提高繁殖效率,加快优良种畜的扩繁速度,使得保种群的规模不断扩大；3)体细胞的冷冻保存与体细胞克隆技术，在不影响生产的情况下大批量地采集公、母畜的体细胞，经培养、构建细胞库和冷冻保存，在需要的时候解冻体细胞后采用体细胞核移植的方法克隆出大量与供体遗传信息一致的个体；4)DNA文库保种：根据不同组织细胞建立各自细胞系或细胞株进行低温长期保存，并建立DNA文库，即用限制性内切酶对柯乐猪总DNA进行酶切，运用重组DNA技术，将柯乐猪细胞的总DNA或染色体DNA的所有片断随机地连接到合适的基因载体上，然后转移到合适的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片断的无性繁殖系。本发明实施例中，为微卫星标记技术方法为，采用ISAG/FAO联合推荐的30对微卫星标记对柯乐猪保种群体的遗传多样性进行检测。本发明实施例中，还可利用分子标记辅助保种法，根据在染色体上已知位置的分子遗传标记来确定留种的柯乐猪后代，对保种群中的基因进行跟踪，从而达到保存群体中所有优良基因的目的；

具体而言，微卫星标记法具体包括以下步骤：

1)采用常规苯酚-氯仿法抽提基因组DNA,测定基因组DNA的OD值,计算其浓度并稀释至终浓度为100ng/μL；

2)选用ISAG-FAO推荐的30对猪微卫星引物,引物生物公司合成；按照扩增体系和扩增程序将其扩增，PCR扩增体系(20μL):10×Buffer 2.0μL,25mmol/LMg2+2.2μL,10mmol/L dNTPs 0.8μL,10μmmol/L上、下游引物各1μL,100ng DNA模板1μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL,ddH2O 11.8μL；PCR扩增反应程序:94℃预变性10min；94℃变性1min,50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共31个循环；72℃再延伸10min；4℃保存。扩增产物用29∶1的10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染法定影和显色,UVI凝胶成像系统分析结果,采用pBR322DNA/BsuRⅠ/Marker作为分子质量的标准对照。

3)通过ONE-Dscan软件分析基因片段大小,采用PopGen32和Excel软件计算有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)、PIC等。本发明实施例中，SNP芯片分析技术对柯乐猪保种群进行各世代间的群体遗传结构和遗传多样性分析的方法包括以下步骤：

1)采集柯乐猪的耳组织，提取基因组DNA；

2)对所述柯乐猪的DNA进行SNP芯片分型，筛除不合格的样本和SNP位点，只使用常染色体上的位点，得到质控数据；

3)对所述质控数据采用Plink(V1.90)软件进行分析；其中，分别计算柯乐猪保种群体的最小等位基因频率、期望杂合度、观察杂合度、多态信息含量和多态性标记比例，分析可乐猪保种群体的遗传多样性；

4)采用Plink(V1.90)软件分析连续性纯合片段(runs of homozygosity,ROH),计算基于ROH的近交系数。采用Plink(V1.90)和Gmatix(V2)软件分别构建状态同源(identityby state,IBS)距离矩阵和G矩阵，并绘制热图，分析保种群体的亲缘关系。

5)去除所述质控数据中的强连锁位点，计算柯乐猪个体间的遗传距离，构建状态同源矩阵和种公猪的群体进化树。

具体而言，SNP芯片分析技术包括：1)柯乐猪共140个样本，来自毕节市产区保种厂，包括25头公猪，115头母猪，采集的样品均为耳组织,置于装有95％酒精的2mL离心管中,低温保存。2)SNP芯片分型：DNA提取采用酚氯仿抽提，经Nanodrop 2000仪器和0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，DNA浓度调整至50ng/μL。所有合格的DNA样品Illumina CAUPorince50K SNP芯片进行基因型分型，然后按照以下标准进行质控：先去除性染色体上的位点，再选择SNP检出率大于0.9和最小等位基因频率大于0.01的位点，得到质控数据；3)种群亲缘关系分析利用Plink(V1.90)软件分析连续性纯合片段(runs of homozygosity,ROH),统计每头柯乐猪ROH的分布、长度和数目，计算每个个体中ROH片段总长度与常染色体基因组总长度的比值，此比值即为基于ROH的近交系数；4)遗传距离分析在质控后的基础上，进一步去除强连锁(r2>0.15)位点。使用Plink1.9b软件计算个体间的遗传距离(cluster-distance-matrix)，构建状态同源(identity-bystate，IBS)矩阵。采用Gmatix(v2)软件构建群体G矩阵，并绘制热图展现种猪之间的遗传亲缘关系；5)采用Mega X(V10.0)软件对质控后的SNP位点进行分析并绘制群体进化树，分析柯乐猪保种群体中种公猪的家系结构，统计不同家系种公猪的数量。

本发明以原位保种和易位保种相结合，其中，原位保种体现在小群体规模保种和多场联合保种，确定小群体规模，适当增加世代间隔，各家系等量留种，有计划的杂交体系，多个保种扩繁基地和统一的生产管理；易位保种体现为精液、卵母细胞、体细胞及胚胎的冷冻保存，协同体细胞核移植的方法克隆出大量与供体遗传信息一致的个体；根据不同组织细胞建立各自细胞系或细胞株进行低温长期保存,并建立DNA文库；采用分子标记辅助保种有效保存群体优良基因，利用AFLP技术检测柯乐猪两个近缘品系的遗传变异，检测与猪的屠宰性状有关的数量性状遗传位点；利用微卫星技术对柯乐猪的染色体进行多态性检测，研究不同品种之间的遗传差异，并绘制遗传连锁图谱；此外，还利用SNP芯片分析技术对柯乐猪保种群进行各世代间的群体遗传结构和遗传多样性等分析，为该品种资源的保护和利用提供分子水平上的科学依据。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。