阅读说明：本技术 基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法及其用途 (Method for analyzing sn isomer in phosphatidylcholine based on mass spectrum and application thereof ) 是由 瑕瑜 赵雪 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法及其用途。其中,解析方法包括：配制含有碳酸氢盐的脂质样品溶液,以得到脂质碳酸氢根加合物；对脂质样品/脂质碳酸氢根加合物进行质谱分析,以确定脂质样品中磷脂酰胆碱的碳原子总数与不饱和度；对脂质碳酸氢根加合物进行串联质谱分析,以使磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物在低能量碰撞下引发自由基诱导的碎裂,使位于sn-2位置的脂肪酸链断裂并形成与sn-1位置相关的离子sn-1 fragment,从而确定磷脂酰胆碱中两条脂肪酸链的组成和sn位置。该方法可结合液相色谱对含有磷脂酰胆碱的脂质样品进行高通量分析,简单高效,无需对现有仪器进行改造即可实现高灵敏、高通量和高精细的结构解析。(The invention discloses a method for analyzing sn isomers in phosphatidylcholine based on mass spectrum and application thereof. The analysis method comprises the following steps: preparing a lipid sample solution containing bicarbonate to obtain a lipid bicarbonate adduct; performing mass spectrometry on the lipid sample/lipid bicarbonate adduct to determine the total number of carbon atoms and the degree of unsaturation of phosphatidylcholine in the lipid sample; tandem mass spectrometry of lipid bicarbonate adducts is performed to cause the phosphatidylcholine bicarbonate adduct to initiate free radical induced fragmentation under low energy collisions, breaking the fatty acid chains at the sn-2 position and forming ions sn-1 fragments associated with the sn-1 position, thereby determining the composition and sn position of the two fatty acid chains in phosphatidylcholine. The method can be used for carrying out high-throughput analysis on a lipid sample containing phosphatidylcholine by combining with liquid chromatography, is simple and efficient, and can realize high-sensitivity, high-throughput and high-precision structural analysis without modifying the existing instrument.)

基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法及其用途

技术领域

本发明属于质谱分析技术领域，具体而言，涉及利用磷脂酰胆碱的新的碎裂行为来对其精细结构进行高通量的质谱检测分析，包括基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法及其用途。

背景技术

磷脂酰胆碱是甘油磷脂的一个子类，在哺乳动物中尤其丰富，约占哺乳动物总脂质含量的30％左右。磷脂酰胆碱的主要生物学作用是作为细胞膜以及各种细胞器膜的主要组成成分，此外它也参与细胞中一些重要的生理过程如信号的传递以及基因的调控。磷脂酰胆碱的异常也与疾病有关，相关研究表明阿尔兹海默症患者血液中八个潜在脂质生物标志物都是和磷脂酰胆碱分子相关的。磷脂酰胆碱生物学功能的多样性源于其结构的多样性。它由甘油骨架连接两条脂肪酸链和一个胆碱磷酸头部基团构成。脂肪酸链的组成，连接位置以及双键的位置及立体构型使得磷脂酰胆碱分子中存在大量的异构体。然而目前在一种特定生物样本中检测到的磷脂酰胆碱的数目是非常有限的，这主要是因为很多方法没有对异构体进行区分。

质谱作为一种检测手段已经被广泛应用，它的高灵敏度，高选择性以及高通量使得它在脂质组学的分析上受到越来越多的关注。特别是随着直接进样的“鸟枪法脂质组学”和基于分离的“液相色谱-质谱方法”的发展，脂质的精确结构解析以及精确结构所引起的生物学作用逐渐成为研究的热点。尽管高分辨质谱的脂质分析便于得到脂质分子的精确分子组成进而确定脂质的类别，但脂质更深层次的结构表征还是依赖串联质谱。传统的低能量诱导碎裂是最常用的串联质谱技术，磷脂酰胆碱在正离子模式下的低能量诱导碎裂产生的m/z 184离子是其头部基团的特征离子，用于区分磷脂酰胆碱和其他甘油磷脂子类。磷脂酰胆碱阴离子加合物的低能量诱导碎裂又可以用来确定它的脂肪酸链的组成。但是磷脂酰胆碱中细微结构的解析如：双键的位置，脂肪酸链的位置等对于传统的串联质谱分析还是一个挑战。然而目前相关研究显示，双键异构体在生物组织中的分布存在着显著性的差异，sn位置异构体在神经元突触前膜中的分布也不尽相同。

为了对生物体内普遍存在的脂质异构体进行鉴定，越来越多新的质谱方法发展起来。Paternò-Büchì(PB)反应和环氧化反应等衍生化手段与质谱相结合实现了脂质中双键的精准定位。有机物离子的电子激发解离(EIEIO)，臭氧诱导解离(OzID)以及紫外光诱导解离(UVPD)都用于对脂质中的双键位置和sn位置进行解析。但是这些方法都需要复杂的仪器改造过程。最近，也有相关研究利用脂质分子与二价金属离子在紫外光解离下的特殊碎裂行为来对脂质分子中的sn位置进行鉴定，但该方法仍难以实现脂质异构体的高通量结构解析。由此可见，利用脂质异构体的一些特殊碎裂行为来对脂质中的精细结构进行简单，快速以及高通量的鉴定是目前脂质分析的难点与方向。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法及其用途。该方法可以结合液相色谱对含有磷脂酰胆碱的脂质样品进行高通量分析，简单高效，无需对现有仪器进行改造即可实现高灵敏、高通量和高精细的结构解析。

本发明是基于发明人的以下发现提出的：碳酸氢根与磷脂酰胆碱三甲胺基团的强相互作用形成阴离子加合物相比于其他阴离子加合物更加稳定，磷脂酰胆碱的碳酸氢根加合物在低能量碰撞下会引发自由基诱导的碎裂，产生特异于sn位置的诊断离子，由此可以确定脂肪酸链的组成以及脂肪酸链在sn位置的连接关系；进一步地，该加合物的光化学反应产物的多级碎裂可以用于确定特异于sn位置的脂肪酸链上的碳碳双键，由此，通过将碳酸氢根引入到液相色谱的流动相中，可以实现复杂样品中磷脂酰胆碱高通量、高灵敏、精细的结构解析。而sn-异构体含量在正常组织和疾病组织中的显著性差异，为临床诊断寻找生物标志物提供了新的方向。

根据本发明的第一个方面，本发明提出了一种基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)配制含有碳酸氢盐的脂质样品溶液，以便得到脂质碳酸氢根加合物，其中，所述脂质样品中具有磷脂酰胆碱；

(2)对所述脂质样品/所述脂质碳酸氢根加合物进行质谱分析，以便确定脂质样品中磷脂酰胆碱的碳原子总数与不饱和度；

(3)对所述脂质碳酸氢根加合物进行串联质谱分析，以便使磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物在低能量碰撞下引发自由基诱导的碎裂，使位于sn-2位置的脂肪酸链断裂并形成与sn-1位置相关的离子sn-1fragment，从而确定所述磷脂酰胆碱中两条脂肪酸链的组成和sn位置，其中，所述sn-1fragment的结构式如式(I)所示，R1为脂肪酸链，

根据本发明上述实施例的基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法，发明人发现，磷脂酰胆碱的碳酸氢根加合物在低能量碰撞下会引发自由基诱导的碎裂，参考图3，在碰撞过程中，磷脂酰胆碱中的C-N键发生均裂，中性丢失120Da(Da为碳原子质量的十二分之一)形成自由基，C-N键均裂产生的自由基更倾向于夺取甘油骨架3号碳上的氢，导致2号碳位置(即sn-2位置)的脂肪酸链以自由基的形式离开，而1号碳位置(即sn-1位置)的脂肪酸链保留并形成如式(1)所示的离子“sn-1fragment”。由此，通过对脂质样品/磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物进行质谱分析，可以确定脂质样品中磷脂酰胆碱的种类以及磷脂酰胆碱中的碳原子总数和不饱和度，通过对磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物进行串联质谱分析，可以确定sn-1fragment的碳原子总数和不饱和度，从而确定磷脂酰胆碱中两条脂肪酸链的组成，以及两条脂肪酸链与sn-1位置和sn-2位置的连接关系。综上，该方法可以结合液相色谱对含有磷脂酰胆碱的脂质样品进行高通量分析，不仅简单高效，而且无需对现有仪器进行改造即可实现对磷脂酰胆碱中sn位置异构体的高灵敏、高通量和高精细的结构解析。

另外，根据本发明上述实施例的基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，所述低能量碰撞使用的碰撞能量为30±5eV，优选30±2eV。

在本发明的一些实施例中，基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法进一步包括：将所述串联质谱分析与PB反应或环氧化反应联用，以便确定特定sn位置的脂肪酸链中碳碳双键的位置。

在本发明的一些实施例中，所述脂质样品为含有胆碱磷酸头部基团的脂质和/或经衍生化反应后形成的含有胆碱磷酸头部基团的脂质。

在本发明的一些实施例中，基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法进一步包括：根据不同质核比的“sn-1fragment”百分比对所述磷脂酰胆碱sn异构体的相对含量进行分析；引入内标并建立sn异构体标准品的定量曲线，以便对所述磷脂酰胆碱sn异构体进行绝对定量分析。

在本发明的一些实施例中，所述质谱分析的进样方式为鸟枪法、直接进样法或液相色谱-质谱联用法。

在本发明的一些实施例中，所述质谱分析采用的仪器为三重四级杆质谱仪或beam-type CID质谱仪。

在本发明的一些实施例中，所述脂质样品为磷脂酰胆碱标准品或含有磷脂酰胆碱的复杂生物样品。

根据本发明的第二个方面，本发明提出了上述基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法在疾病样品脂质生物标志物筛查中的用途。发明人发现，磷脂酰胆碱的sn-异构体含量在正常组织和疾病组织中会存在有显著性差异，这为临床诊断寻找生物标志物提供了新的方向，而上述基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法可以通过磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的串联质谱图来确定磷脂酰胆碱中sn异构体的相对含量，例如可以根据不同质核比的“sn-1fragment”百分比分析磷脂酰胆碱sn异构体的相对含量，并且可以进一步引入内标建立sn异构体标准品的定量曲线，实现对磷脂酰胆碱sn异构体进行绝对定量分析。由此，上述基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法可以为临床样品的生物诊断提供脂质解析。

在本发明的一些实施例中，所述脂质生物标志物具有磷脂酰胆碱的sn位置异构体，或具有磷脂酰胆碱的sn位置异构体和特定sn位置的脂肪酸链的C＝C位置异构体。由此可以实现对疾病样品脂质生物标志物更精确的筛查。

在本发明的一些实施例中，所述疾病样品包括乳腺癌组织样品和阿尔兹海默症血液样品，用于所述乳腺癌组织的脂质生物标志物的磷脂酰胆碱为选自“PC 16:0_17:0”、“PC15:0_18:1”、“PC 16:0_17:1”和“PC 16:0_18:1”中的至少一种。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为PC 16:0/18:1(2μM)分别在相同浓度的甲酸根(5mM)和碳酸氢根(5mM)溶液中的一级质谱图；

图2a为PC 16:0/18:1碳酸氢根加合物的beam type CID谱图(碰撞能量在30ev左右)；

图2b为PC 16:0/18:1的sn异构体PC 18:1/16:0的碳酸氢根加合物的beam typeCID谱图(碰撞能量在30ev左右)；

图2c为PC 16:0/18:1碳酸氢根加合物的可能结构及其对应的“sn-1fragment”；

图3为磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物自由基引导的碎裂形成“sn-1fragment”的碎裂途径；

图4为PC 16:0/18:1碳酸氢根加合物的ion trap CID谱图；

图5a为PC 18:1/16:0(10μM)碳酸氢根加合物PB反应8s后的一级质谱图；

图5b为图5a中PB反应产物(m/z 878)的二级质谱图；

图5c为图5b中“sn-1fragment”PB反应产物(m/z 503)的三级质谱图；

图5d为图5c中sn-1位置的脂肪酸链对应的PB反应产物(m/z 339)的四级质谱图；

图6为六组磷脂酰胆碱sn异构体标准品在酶解法和“sn-1fragment”方法下测得的纯度；

图7a为利用不同质核比的“sn-1fragment”百分比和sn异构体百分比作出的PC16:0/18:1与PC 18:1/16:0sn异构体的相对定量曲线；

图7b为利用sn异构体与内标的浓度比和sn异构体与内标的信号强度比作出的sn异构体的绝对定量曲线；

图8为液相色谱-质谱分析复杂生物样品的流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的第一个方面，本发明提出了一种基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)配制含有碳酸氢盐的脂质样品溶液，以便得到脂质碳酸氢根加合物，其中，脂质样品中具有磷脂酰胆碱；(2)对脂质样品/脂质碳酸氢根加合物进行质谱分析，以便确定脂质样品中磷脂酰胆碱的碳原子总数与不饱和度；(3)对脂质碳酸氢根加合物进行串联质谱分析，以便使磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物在低能量碰撞下引发自由基诱导的碎裂，使位于sn-2位置的脂肪酸链断裂并形成与sn-1位置相关的离子sn-1fragment，从而确定磷脂酰胆碱中两条脂肪酸链的组成和sn位置，其中，sn-1fragment的结构式如式(I)所示，R1为脂肪酸链，

下面对本发明上述实施例的基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法进行详细描述。

根据本发明的实施例，磷脂酰胆碱中甘油骨架连接两条脂肪酸链和一个胆碱磷酸头部基团，脂肪酸链的组成、连接位置、脂肪酸链中碳碳双键的位置及立体构型使得磷脂酰胆碱分子中存在大量的异构体。如式(II)和式(III)所示，R1和R2代表两条脂肪酸链，R1和R2分别独立地包含多个碳原子且均可能存在一个或多个C＝C，并且，两条脂肪酸链分别连接在甘油骨架1号碳上(即sn-1位置)和甘油骨架2号碳上(即sn-2位置)，若两条脂肪酸链不同，则式(II)和式(III)分别为磷脂酰胆碱sn位置的两类异构体，其中，两条脂肪酸链的sn位置即为两条脂肪酸链与sn-1位置和sn-2位置的连接关系，

本发明中利用碳酸氢根与磷脂酰胆碱三甲胺基团的强相互作用形成阴离子加合物，该阴离子复合物相比于其他阴离子加合物(例如甲酸根阴离子/乙酸根阴离子)更加稳定，主要表现为磷脂酰胆碱与相同浓度的阴离子结合时，在相同条件下，碳酸氢根加合物的质谱检测强度比甲酸根/乙酸根高10-20倍，如图1所示。基于磷脂酰胆碱的阴离子加合物的气相碎裂行为高度依赖于阴离子的特性，发明人将甲酸根磷脂酰胆碱加合物的碎裂与磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的碎裂进行对照后发现，两者在低质量端的碎裂行为相似，而在中质量端和高质量端的碎裂行为表现出了差异。通过对碳酸氢根加合物中质量端碎裂离子的精确分子质量，MS³ CID(三级质谱)以及OzID分析，发明人提出了中质量端碎裂离子的结构。发明人在与sn异构体的碎裂谱图对照后发现，磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物中质量端的碎裂离子是一个和sn-1位置脂肪酸链相关的离子，我们将其命名为“sn-1fragment”(如PC16:0/18:1碳酸氢根加合物CID谱图中的m/z 419，参考图2a和图2c，其中PC代表磷脂酰胆碱，“16:0”和“18:1”分别代表磷脂酰胆碱中甘油骨架1号和2号位置上连接的两条脂肪酸链的组成，“16:0”中“16”表示脂肪酸链的碳原子数为16，“0”表示该脂肪酸链中不存在碳碳双键，同样，“18:1”中“18”表示脂肪酸链的碳原子数为18，“1”表示脂肪酸链中含有一个碳碳双键，本发明具体实施例中的磷脂酰胆碱均采用此种表述方式)；并且，通过对高质量端碎裂离子的碎裂行为的研究，我们发现“sn-1fragment”来源于高质量端的一个自由基离子(例如PC 16:0/18:1碳酸氢根加合物CID谱图中的m/z 700)，该自由基离子的产生归因于碳酸氢根与磷脂酰胆碱的强相互作用，如图3所示，在碰撞过程中，磷脂酰胆碱中的C-N键发生均裂，中性丢失120Da(Da为碳原子质量的十二分之一)形成自由基(C₃₉H₇₃O₈P^·)。C-N键均裂产生的自由基更倾向于夺取甘油骨架3号碳上的氢，导致sn-2位置的脂肪酸链以自由基的形式离开并形成“sn-1fragment”。

根据本发明上述实施例的基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法，通过对脂质样品/磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物进行质谱分析，可以确定脂质样品中磷脂酰胆碱的种类以及磷脂酰胆碱中的碳原子总数和不饱和度；通过对磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物进行串联质谱分析，可以确定sn-1fragment的碳原子总数和不饱和度，从而确定磷脂酰胆碱中两条脂肪酸链的组成，以及两条脂肪酸链与sn-1位置和sn-2位置的连接关系。显然，该方法可以结合液相色谱对含有磷脂酰胆碱的脂质样品进行高通量分析，不仅简单高效，而且无需对现有仪器进行改造即可实现对磷脂酰胆碱中sn位置异构体的高灵敏、高通量和高精细的结构解析。

根据本发明的一个具体实施例，步骤(3)中，低能量碰撞使用的碰撞能量可以为30±5eV，优选低能量碰撞优化后使用的碰撞能量为30±5eV。发明人发现，自由基引导的碎裂产生的“sn-1fragment”在高能量碰撞下更容易被激发，比如在beam type CID中产生的“sn-1fragment”在ion trap CID中几乎不产生，其中，图4为PC 16:0/18:1碳酸氢根加合物的ion trap CID谱图，对比图2a和图4可知，在ion trap CID谱图中m/z 419位置强度极低；进一步地，发明人发现，Beam type CID的碰撞能量在30ev左右时“sn-1fragment”的强度达到峰值，再随着能量的提高，“sn-1fragment”被碎裂成其他离子，该自由基引导的碎裂途径在不同链长和不同不饱和度的磷脂酰胆碱的碳酸氢根加合物中均能发生。由此，本发明中通过控制低能量碰撞的能量为30±5eV，可以使“sn-1fragment”稳定存在并达到较高的强度，从而能够进一步提高检测的精准度。更优选地，低能量碰撞使用的碰撞能量可以为30±2eV，由此可以进一步有利于使“sn-1fragment”的强度达到峰值，从而更有利于实现对磷脂酰胆碱中sn位置异构体的高灵敏、高通量的结构解析。

根据本发明的再一个具体实施例，本发明中脂质样品的来源和组成并不受特别限制，本来领域技术人员可以根据实际需要进行选择，例如，脂质样品可以为含有胆碱磷酸头部基团的脂质和/或经衍生化反应后形成的含有胆碱磷酸头部基团的脂质；同时，脂质样品可以为磷脂酰胆碱标准品或含有磷脂酰胆碱的复杂生物样品，适用范围较广。

根据本发明的又一个具体实施例，本发明中对脂质样品或脂质碳酸氢根加合物进行质谱分析的进样方式可以为鸟枪法、直接进样法或液相色谱-质谱联用法，所采用的质谱分析仪器可以为三重四级杆质谱仪或beam-type CID质谱仪。由此可以进一步有利于实现对磷脂酰胆碱中sn位置异构体的高灵敏、高通量的结构解析。

根据本发明的又一个具体实施例，可以将磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的碎裂特点与PB反应产物/环氧化产物的碎裂特点相结合，以确定磷脂酰胆碱中特定sn位置的脂肪酸链上C＝C的精确位置，例如，参考图5，将磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物与丙酮混合进行光化学反应，使脂肪酸链上的C＝C与丙酮发生环加成反应，得到磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的PB反应产物(一级质谱分析，MS¹)，对磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的PB反应产物碎裂时(二级质谱分析，MS²)得到了“sn-1fragment”的PB反应产物，进一步对“sn-1fragment”的PB反应产物进行碎裂时(三级质谱分析MS³)得到了sn-1位置的脂肪酸链对应的PB反应产物，接着对sn-1位置的脂肪酸链对应的PB反应产物进行进一步碎裂时(四级质谱分析，MS⁴)，得到了sn-1脂肪酸链上C＝C的位置，由此通过将串联质谱分析与PB反应或环氧化反应联用，可以进一步确定磷脂酰胆碱中特定脂肪酸链上C＝C的精确位置。需要说明的是，本发明中所述的“特定sn位置”指的是sn-1位置和/或sn-2位置。

根据本发明的又一个具体实施例，基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法进一步包括：根据不同质核比的“sn-1fragment”百分比对磷脂酰胆碱sn异构体的相对含量进行分析；引入内标并建立sn异构体标准品的定量曲线，以便对磷脂酰胆碱sn异构体进行绝对定量分析，由此可以确定磷脂酰胆碱待测样品中sn异构体的绝对含量。具体地，在磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的碎裂离子中，“sn-1fragment”附近存在少量的“杂质离子”(如图2a中，PC 16:0/18:1碳酸氢根加合物CID谱图中的m/z 445)，发明人猜测，这些“杂质离子”是由于标准品中存在少量的sn异构体，参考图6，通过对比磷脂酰胆碱sn异构体标准品在金标法-PLA₂酶解法下测得的纯度和在低能量碰撞下引发自由基诱导的碎裂产生sn-1fragment的纯度发现，“sn-1fragment”测定的六组标准品的纯度和PLA₂酶解法测定的六组标准品的纯度平均偏差在±2％左右，这说明磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物碎裂谱图中的“杂质离子”是标准品不纯导致的，验证了发明人的猜测。由此可以根据“sn-1fragment”百分比和浓度百分比的关系建立了sn异构体的相对定量曲线(如图7a所示)，从而能够进一步确定磷脂酰胆碱样品中sn异构体(如式II和式III)的相对含量。进一步地，发明人发现，中性丢失121Da是磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物CID谱图中丰度最高的碎裂离子，它对胆碱磷酸头部基团具有很高的选择性，由此可以利用中性丢失扫描121Da，将复杂样品中的含胆碱磷酸头部基团的脂质挑选出来，其中检测限在10pM左右。由于sn异构体的电离效率以及中性丢失121Da的碎裂效率相似，由此可以通过引入内标，建立sn异构体的绝对定量曲线(如图7b所示)，从而能够进一步有利于确定磷脂酰胆碱样品中sn异构体(如式II和式III)的绝对含量。

根据本发明的实施例，为了实现高通量的脂质分析，参考图8，本发明中将碳酸氢根离子作为流动相引入到LC体系中，建立了复杂样品中磷脂酰胆碱结构解析的流程。脂质提取物经过HILIC柱的分离后，先经过负模式下的中性丢失扫描121Da确定脂质样品中磷脂酰胆碱的种类，再对脂质碳酸氢根加合物，优选分别对每种检测到的磷脂酰胆碱的碳酸氢根加合物做CID，确定磷脂酰胆碱中脂肪酸链的sn位置，最后正模式下PB反应产物的碎裂得到主要sn异构体上碳碳双键的位置。进一步地，发明人将该结构解析流程用于牛肝脏脂质提取物，在牛肝脏脂质提取物中共鉴定了98个磷脂酰胆碱分子，其中包括22对sn异构体，实现了磷脂酰胆碱的高灵敏，高通量以及精细结构的解析。

需要说明的是，本发明中所述的串联质谱可以包括多级串联质谱，例如二级质谱分析、三级质谱分析、四级质谱分析等。

根据本发明的第二个方面，本发明提出了上述基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法在疾病样品脂质生物标志物筛查中的用途。发明人发现，磷脂酰胆碱的sn-异构体含量在正常组织和疾病组织中会存在有显著性差异，这为临床诊断寻找生物标志物提供了新的方向，而上述基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法可以通过磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的串联质谱图确定磷脂酰胆碱中sn异构体的相对含量，例如可以根据不同质核比的“sn-1fragment”百分比分析磷脂酰胆碱sn异构体的相对含量，并且可以进一步引入内标建立sn异构体标准品的定量曲线，实现对磷脂酰胆碱sn异构体进行绝对定量分析。由此，上述基于质谱的磷脂酰胆碱中sn异构体的解析方法可以为临床样品的生物诊断提供脂质解析。

根据本发明一个具体实施例，脂质生物标志物可以包括磷脂酰胆碱的sn位置异构体，由此可以为临床样品的生物诊断提供脂质解析；进一步地，脂质生物标志物可以包括磷脂酰胆碱的sn位置异构体和特定sn位置的脂肪酸链的C＝C位置异构体，发明人发现，sn位置异构体具有显著性变化的饱和磷脂酰胆碱与C＝C位置异构体具有显著性变化的不饱和磷脂酰胆碱可以进行互补，由此可以为临床样品的生物诊断提供更全面的脂质解析。

根据本发明又一个具体实施例，疾病样品可以包括乳腺癌组织样品和阿尔兹海默症血液样品，用于乳腺癌组织的脂质生物标志物的磷脂酰胆碱为选自“PC 16:0_17:0”、“PC15:0_18:1”、“PC 16:0_17:1”和“PC 16:0_18:1”中的至少一种。发明人通过对照正常组织和疾病组织中的sn异构体的变化，发现PC 16:0_17:0、PC 15:0_18:1、PC 16:0_17:1以及PC 16:0_18:1的sn异构体相对含量的变化都表现出明显的差异，并且sn位置异构体具有显著性变化的饱和磷脂酰胆碱与C＝C位置异构体具有显著性变化的不饱和磷脂酰胆碱可以进行互补，由此采用上述种类的磷脂酰胆碱可以为临床样品乳腺癌组织的生物诊断提供更全面的脂质解析。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一般方法：

利用本发明中的工作流程对复杂生物样品中的磷脂酰胆碱进行细微结构解析(参考图8)，主要包括以下步骤：

(一)从生物样品中提取脂质样品

将70mg的组织样品置于10mL的离心管中，加入1mL的去离子水。将组织样品通过手持式匀浆机在40000Hz下均化五分钟，随后与1mL甲醇，1mL水和2mL氯仿混合用于液-液萃取，涡旋五分钟左右后，将混合物在11269g下离心八分钟。收集离心后的底层溶液并转移至新的10mL离心管中。将上述提取过程重复一次。将来自两次萃取的氯仿层合并，并在氮气流下干燥。最后将提取物复溶在1mL的甲醇溶液中，振荡均匀后在-20℃下储存用于分析。

(二)脂质样品中磷脂酰胆碱sn异构体的解析

将步骤(一)提取的脂质样品与碳酸氢铵混合配制脂质样品溶液，以便得到脂质碳酸氢根加合物；对提取的脂质样品进行LC-MS分析，先在负离子模式下进行中性丢失121Da扫描以确定脂质样品中的磷脂酰胆碱的种类和每种磷脂酰胆碱的碳原子总数及不饱和度；对脂质碳酸氢根加合物进行LC-MS/MS分析，对每一个磷脂酰胆碱分子的碳酸氢根加合物做CID，根据谱图中m/z 200–300之间的离子来确定磷脂酰胆碱(PC)的脂肪酸链的组成，根据谱图中m/z 350-500之间的离子来确定脂肪酸链的sn位置。

其中，液相色谱采用ExionLC AC system(Sciex)，液相色谱配备一个除气装置，两个泵，一个自动进样器和一个柱温箱。脂质样品中的脂质是通过亲水相互作用柱(HILIC)来进行分离的，柱子的型号为：150mm×2.1mm，silica spheres，2.7μm(Sigma-Aldrich)。柱温设置在30℃左右。流动相A：乙腈，流动相B：20mM碳酸氢铵水溶液。流动相梯度为：0-8min:90％to 85％B；8-15min:85％to 80％B；15-17min:80％to 70％B；17-23min:70％to 70％B；23-24min:70％to 90％B；24-25min 90％B。流动相的流速为0.2mL/min，每次的进样量为2μL。

采用的质谱仪为Sciex公司的QTRAP 4500。负离子模式下的中性丢失扫描的质谱参数设定为：气帘气30psi；碰撞气low；电压4500V；温度400℃；喷雾气30psi；辅助加热气30psi；去簇电压-5V；碰撞能量30ev。负离子模式下的CID，碰撞气改成medium，其余参数和上述一致。

(三)对检测到的含量较高的磷脂酰胆碱sn异构体进行特定脂肪酸链上C＝C位置的确定

对步骤(二)中检测到的不饱和脂质进行在线LC-PB-MS/MS分析，将不包含磷脂酰胆碱分子/磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物与丙酮进行PB反应，得到PB反应产物(即磷脂酰胆碱分子的丙酮加合产物/磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的丙酮加合产物)，在在正离子模式下对PB反应产物即相对于质子化的磷脂酰胆碱(碳酸氢根加合物)+58Da的分子做CID，根据谱图中m/z 500–m/z 700之间的相差26Da的离子来确定碳碳双键的位置。

具体地，将脂质提取物溶解在1:1丙酮:水中，其中水相包含20mM碳酸氢铵。将配置好的溶液在氮气流下除氧5分钟左右。再对该溶液进行离线PB反应，反应时间在6s左右。反应后的液体加载到钠喷管中，将不锈钢丝***钠喷管的液体中，钠喷管的尖端与质谱的进样小孔对齐。在负离子模式下对待测的磷脂酰胆碱碳酸氢根加合物的PB反应产物做MS⁴可以确定其sn-1及sn-2位置脂肪酸链上碳碳双键的位置。

其中，离线PB反应在微流反应装置下进行。熔融石英毛细管(外径363μm，内径100μm)作为微流反应器，它通过二通与注射器相连，注射器在注射泵的推动下来对样品的流速进行调节，进而调节反应的时间，反应在254nm的低压紫外汞灯下激发。

在线LC-PB-MS/MS分析平台由液相色谱-微流反应器-质谱三部分构成的。相比于步骤(二)中液相色谱的条件，本步骤中将流动相A替换为1:1丙酮:乙腈，其他条件相同。质谱参数设定为：气帘气30psi；碰撞气medium；电压4500V；温度400℃；喷雾气30psi；辅助加热气30psi；去簇电压50V；碰撞能量30ev。微流反应器是将特氟龙软管(0.03英寸内径，1/16英寸外径)盘绕在四个不锈钢柱和两个塑料基座制成的直径为2.5cm的支架上。特氟龙线圈的入口和出口通过不锈钢螺母固定在支柱上，并通过二通连接装置(内径1/16英寸)与液相色谱的管路连接。254nm的低压紫外汞灯(型号：80-1057-01，BHK)通过顶部基座上的孔固定在特氟龙管缠绕的线圈的中心。整个装置用铝箔纸覆盖，以防止反应器向外发射光线。微反应器的入口和出口通过二通连接装置连接液相色谱的管路和质谱，以对分离后的样品进行柱后衍生并对衍生后的脂质进行在线质谱检测。

实施例1

采用钠喷法分析磷脂酰胆碱标准品PC 16:0/18:1(9Z)和PC 18:1(9Z)/16:0的sn位置及脂肪酸链上C＝C的位置。其中，9Z表示碳碳双键位于第9个碳原子的位置，并且是顺式结构。

分析样品的制备：将10μM PC 16:0/18:1(9Z)和PC 18:1(9Z)/16:0分别溶解在1:1丙酮:水中，其中水相含有5mM的碳酸氢铵。

质谱分析(参考图5和图8的流程)：

1)将分析样品加载到钠喷管中，不锈钢丝***分析样品的液体中。

2)首先在负离子EMS模式下，确定是否形成碳酸氢根加合物(m/z 820)。质谱参数设定为：气帘气10psi；碰撞气low；电压1500V；温度50℃；喷雾气10psi；辅助加热气10psi；去簇电压-5V；碰撞能量10ev。

3)在负离子模式下对碳酸氢根加合物m/z 820做CID，确定CID谱图中高质量端是否有中性丢失62Da，121Da和147Da的峰，低质量端是否有和脂肪酸链相关的m/z 255和m/z281的峰，若存在则中质量端m/z 419(PC 16:0/18:1的CID谱图中，如图2a所示)或m/z 445(PC 18:1/16:0的CID谱图中，如图2b所示)即为PC 16:0/18:1和PC 18:1/16:0分别对应的“sn-1fragment”。质谱参数设定为：气帘气10psi；碰撞气medium；电压1500V；温度50℃；喷雾气10psi；辅助加热气10psi；去簇电压-5V；碰撞能量30ev。

4)将分析样品PC 18:1(9Z)/16:0在氮气流下除氧5分钟左右后加载到离线的微流反应装置中。反应时间控制在6s左右，反应后的液体加载到钠喷管中进行质谱检测。

5)在负离子EMS模式下确定是否形成PB反应产物(m/z 878，如图5a所示)，对m/z878做CID，CID谱图中m/z 503对应“sn-1fragment”的PB反应产物(如图5b所示)，对m/z 503做MS³，MS³谱图中m/z 339对应sn-1位置脂肪酸链18:1相应的PB反应产物(如图5c所示)，最后对m/z 339做MS⁴，MS⁴谱图中m/z 171，197对应的是sn-1位置脂肪酸链18:1上的碳碳双键(如图5d所示)。MS³和MS⁴质谱参数设定为：气帘气10psi；碰撞气high；电压1500V；温度50℃；喷雾气10psi；辅助加热气10psi；去簇电压-5V；碰撞能量30ev；AF₂ 0.1。

实施例2

液相色谱-质谱分析牛肝脏脂质提取物中磷脂酰胆碱分子的sn位置，C＝C位置

分析样品的制备：200ppm的牛肝脏脂质提取物溶于甲醇中

质谱分析：

1)负离子模式下中性丢失扫描121Da，确定其中的磷脂酰胆碱分子。质谱参数设定为：气帘气30psi；碰撞气low；电压4500V；温度400℃；喷雾气30psi；辅助加热气30psi；去簇电压-5V；碰撞能量30ev。液相色谱条件为流动相A：1:1乙腈/丙酮，流动相B：20mM碳酸氢铵水溶液。流动相梯度为：0-8min:90％to 85％B；8-15min:85％to 80％B；15-17min:80％to70％B；17-23min:70％to 70％B；23-24min:70％to 90％B；24-25min 90％B。流动相的流速为0.2mL/min，每次的进样量为2μL。

2)对检测到的磷脂酰胆碱分子的碳酸氢根加合物做CID，质谱参数中碰撞气改成medium，其余参数和上述一致。确定CID谱图中高质量端是否有中性丢失62Da，121Da和147Da的峰，低质量端是否有和脂肪酸链相关的离子，若存在则中质量端的碎裂离子对应于“sn-1fragment”。

3)对检测到的不饱和脂质进行在线LC-PB-MS/MS分析。在正离子模式下对磷脂酰胆碱分子的丙酮加合产物即相对于质子化的磷脂酰胆碱+58Da的分子做CID，根据谱图中m/z 500–m/z 700之间的相差26Da的离子来确定碳碳双键的位置。质谱参数设定为：气帘气30psi；碰撞气medium；电压4500V；温度400℃；喷雾气30psi；辅助加热气30psi；去簇电压50V；碰撞能量30ev。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。