具体实施方式

本发明涉及一种处理尿液样本以分析尿液中的代谢物的方法。

根据本发明的一种实施方式，为了尽可能多地可重现地提取尿液样本中的代谢物而不改变代谢物，可以不用尿素酶处理而直接从尿液样本中提取代谢物。

进一步地，根据本发明的另一实施方式，为了提出一种基于尿液样本的代谢物区分不同组并寻找生物标志物的研究方法，基于不用尿素酶处理而从尿液样本中提取的代谢物对不同组进行比较和分析。

根据本发明的另一个实施方式，可以可重现地提取尿液中尽可能多的代谢物，其中可以使用纯甲醇或甲酸和甲醇的混合溶剂作为提取溶剂，该提取溶剂能够尽可能多地提取尿液中的代谢物并适当沉淀蛋白质。

为了找到确认尿液样本中两个生物样本组之间的区别的生物标志物，本发明人使用纯甲醇或甲酸和甲醇的混合溶剂而不用尿素酶处理，对代谢物进行提取，并根据尿液代谢物的性别和预处理方法通过GC/TOF/MS对代谢物谱的差异进行比较分析，然后进行研究，以利用基于代谢物的上述差异发现区分性别的所需的生物标志物。

结果，确定了107和/或113种代谢物，包括胺、氨基酸、糖和糖醇、脂肪酸、磷酸、有机酸等。

当比较来自不同预处理方法获得的尿液样本的生物样本时，通过PLS-DA确认了根据不同预处理方法的代谢物谱存在明显差异(图1)，并且还明确确认了代谢物谱的与性别相关的差异(图2)。其中，在性别辨别模型方面，根据PLS-DA模型对每种代谢物的VIP值，选出排前十的代谢物，可作为新的性别辨别候选生物标志物(表4)。

因此，本发明可包括一种用于性别鉴定的试剂盒，该试剂盒包括针对一种或多种代谢物的定量装置，所述代谢物选自由琥珀酸盐、富马酸盐、天冬酰胺二水合物、棕榈酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸、乳酸盐、酪氨酸、甘氨酸和硬脂酸组成的组。

进一步地，男性的代谢物中，富马酸盐、天冬酰胺二水合物、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和酪氨酸呈升高的趋势，而硬脂酸、琥珀酸盐、棕榈酸、乳酸和甘氨酸呈降低的趋势。

进一步地，女性的代谢物中，琥珀酸盐、棕榈酸、乳酸盐、硬脂酸和甘氨酸呈升高的趋势，而富马酸盐、天冬酰胺二水合物、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和酪氨酸呈降低的趋势。

升高或降低的趋势是指代谢物浓度的升高或降低，术语“代谢物浓度升高”是指男性相比女性的尿液代谢物浓度或女性相比男性的尿液代谢物浓度以可测量的程度显著升高。同样，在本说明书中，术语“代谢物浓度降低”是指女性相比男性的尿液代谢物浓度或男性相比女性的尿液代谢物浓度以可测量的程度显著降低。

本发明的试剂盒中包含的定量装置可以是色谱仪/质谱仪。

本发明中使用的色谱法可以包括例如气相色谱法、液-固色谱法(LSC)、纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、气-固色谱法(GSC)、液-液色谱法(LLC)、泡沫色谱法(FC)、乳液色谱法(EC)、气-液色谱法(GLC)、离子色谱法(IC)、凝胶过滤色谱法(GFC)或凝胶渗透色谱法(GPC)，但不限于此。事实上，可以使用本领域通常使用的所有定量色谱方法。优选地，本发明中使用的色谱法是气相色谱/飞行时间质谱法(GC/TOF MS)。

关于本发明中的代谢物，通过气相色谱法分离各成分，利用TOF MS获得的信息，通过结构信息(元素组成)和准确的分子量信息来鉴定其构成成分。

本发明还可包括用于分析尿液中代谢物差别性以区分不同组的方法。

根据一种实施方式，本发明可以提供一种分析尿液样本中代谢物差别性以区分不同组(例如，性别、疾病等)的方法。

具体地，提供了一种用于分析不同组间尿液样本中代谢物差异的方法，包括通过使用纯甲醇或甲酸和甲醇的溶剂混合物而不用尿素酶处理来从尿液样本中提取代谢物来对代谢物采样。

代谢物差别性的分析方法可以是分析不同组间尿液样本中代谢物差别性的方法，该方法包括代谢物采样步骤，该步骤包括：淬灭过程；和代谢物提取过程。

代谢物采样过程可包括使用以下物质而不用尿素酶处理从尿液样本中提取代谢物：纯甲醇；纯乙醇；乙腈:水的混合物；水:2-丙醇:甲醇的混合物；或甲酸:甲醇的混合物。具体而言，更优选使用甲酸:甲醇的混合溶剂。甲酸和甲醇的混合比更优选为(0.05至0.5):(99.5至99.95)的体积比。

在这方面，尿液和提取溶剂优选以1:(8至10)的体积比处理，以减少实验中的误差。

在代谢物采样步骤中提取的代谢物可能经历以下分析阶段：

通过气相色谱仪/飞行时间质谱仪(GC/TOF MS)分析提取的代谢物；

将GC/TOF MS分析结果转换为能统计处理的数值；和

使用转换后的值统计验证不同组之间的区别。

接下来，为了比较代谢物的分析差异，进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)以选择在不同组之间显示显著差异的代谢物生物标志物，以便进行分析和验证。

根据一种实施方式，关于本发明的分析方法，将GC/TOF MS分析结果转换为可统计处理的值可以包括将总分析时间除以单位时间间隔，并将单位时间内出现的色谱峰的面积或高度中的最大值确定为单位时间的代表值。

使用转换后的值统计验证两个生物样本组之间的区别可以包括通过偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)分析和验证在两个生物样本组之间显示显著差异的代谢物生物标志物。

根据本发明实施方式的代谢物生物标志物可以区分男性和女性的性别。

代谢物生物标志物可包括琥珀酸盐、富马酸盐、天冬酰胺二水合物、棕榈酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸、乳酸盐、酪氨酸、甘氨酸和硬脂酸。

偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)的正载荷值表示代谢物生物标志物的升高，而负载荷值表示代谢物生物标志物的降低。

根据本发明的一种实施方式，本文中用于区分性别的生物标志物可包括选自由琥珀酸盐、富马酸盐、天冬酰胺二水合物、棕榈酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸、乳酸盐、酪氨酸、甘氨酸和硬脂酸组成的组。

在生物标志物中，富马酸盐、天冬酰胺二水合物、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和酪氨酸在男性中呈升高的趋势，而琥珀酸盐、棕榈酸、乳酸盐、硬脂酸和甘氨酸在男性中呈降低的趋势。

另一方面，在生物标志物中，琥珀酸盐、棕榈酸、乳酸盐、硬脂酸和甘氨酸在女性中呈升高的趋势，而富马酸盐、天冬酰胺二水合物、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和酪氨酸在女性中呈降低的趋势。

发明的优选实施方式详述

在下文中，将通过根据本发明的实施例更详细地描述本发明，但本发明的范围不受以下实施例的限制。

[实施例]

实施例1：使用PLS-DA对68个尿液样本进行代谢物谱分析

将从68名健康成人(表1)中获得的尿液样本如下划分并处理：在37℃进行尿素酶处理1小时的静置培养组(UI)；在37℃非尿素酶处理1小时的静置培养组(WI)；以及非尿素酶处理的非静置培养组(DE)，然后使用已广泛用作提取溶剂的纯甲醇提取代谢物，然后进行GC/TOF MS分析。

在胺、氨基酸、糖和糖醇、脂肪酸和有机酸的化学类别中鉴定了107种代谢物(表2)。

为了比较代谢物的分析差异，基于除尿素之外的106种代谢物进行了PLS-DA。对于尿素酶处理且静置培养组、非尿素酶处理且静置培养组以及非尿素酶处理且非静置组，分别观察到不同的代谢模式(图1、表3和表4)。换句话说，就得分图中的t[1]和t[2]值来说，尿素酶处理且静置培养组的代谢物谱对于大多数样本为负数。同样，就得分图中的t[1]和t[2]值来说，非尿素酶处理且静置培养组对大多数样本是正数，而非尿素酶处理且非静置培养组对大多数样本的t[1]为正数，t[2]为负数。简而言之，证实了根据处理方法，完全地区分了代谢物谱(表3)。因此，可以证明诸如尿素酶处理或静置培养的处理方法可能会改变或更改尿液的其他原始代谢物以及尿素。

下表1示出了68人的尿液样本信息。

下表2示出了使用纯甲醇从68份尿液样本中提取的107种代谢物。

下表3示出了利用PLS-DA得出的t[1](PC1)和t[2](PC2)值，其代表以下组之间的代谢物谱中的平均值和标准偏差(SD)：在37℃进行尿素酶处理1小时的静置培养组(UI)；在37℃非尿素酶处理1小时的静置培养组(WI)；非尿素酶处理的非静置培养组(DE)。

下表4示出了利用PLS-DA得出的以下组之间的代谢物谱中代谢物的载荷值：在37℃进行尿素酶处理1小时的静置培养组(UI)；在37℃非尿素酶处理1小时的静置培养组(WI)；和非尿素酶处理的非静置培养组(DE)。

[表1]

[表2]

[表3]

表3显示代谢物的类型和量可能因处理而异。可以假设可在没有任何预处理的情况下从DE组中提取代谢物，从而保持尿液中代谢物的原始类型和量。37℃1小时尿素酶处理且静置培养组(UI)和37℃1小时非尿素酶处理且静置培养组(WI)的t[1]值或t[2]值在大多数样本中发生变化，从而证明了代谢物的类型和量的变化(图1，表3)。发现通过这种处理引起的代谢物的类型和数量的变化导致用于疾病诊断的生物标志物物质的类型或量发生变化，降低了发现生物标志物的能力，从而可能选择错误的生物标志物。

因此，由于尿素酶处理改变了代谢物谱(表3)，生物标志物的发现能力低于具有原有的代谢物谱的非尿素酶治疗组DE的发现能力。

[表4]

实施例2：68份尿液样本中主要代谢物的选择

利用来自实施例1的PLS-DA分析，参考VIP(变量投影重要性指标)得分值选择了排前十的主要代谢物，这些代谢物对68个尿液样本分类为以下3个组具有很大贡献：在37℃进行尿素酶处理1小时的静置培养组(UI)；在37℃非尿素酶处理1小时的静置培养组(WI)；和非尿素酶处理的非静置培养组(DE)。

下表5，示出了利用PLS-DA得到的以下组之间的代谢物谱中具有很大差异的10种主要代谢物的VIP得分值：在37℃进行尿素酶处理1小时的静置培养组(UI)；在37℃非尿素酶处理1小时的静置培养组(WI)；非尿素酶处理的非静置培养组(DE)。

[表5]

实施例3：使用PLS-DA区分68份尿液样本中的男性和女性的代谢物谱分析

在从68名健康成人获得的尿液样本中(表1)，提取31份男性尿液样本和37份女性尿液样本而不进行尿素酶处理，用之前使用的纯甲醇作为提取溶剂提取代谢物，然后通过GC/TOF MS进行分析。此后，使用除尿素外的106种代谢物制备PLS-DA模型，以区分性别(图2、表6和7)。

如图2所示，男性和女性尿液中的代谢物具有不同的模式，基于PLS-DA模型显示出统计学上的显著差异。也就是说，就t[1]和t[2]值来说，得分图中大多数样本的男性分类代谢物谱为正数，就t[1]和t[2]值来说，得分图中大多数样本的女性分类代谢物谱为正数，从而证明与性别相关的代谢物谱得以完全区分(表7)。为了选择在代谢物谱中表现出差异的主要代谢物，选择了表8中载荷1和载荷2具有相同趋势的代谢物。

下表6示出了利用PLS-DA得出的代谢物谱中每个样本的t[1]和t[2]值的平均值和标准偏差，该代谢物谱示出了从68个尿液样本中区分男性和女性的代谢物谱分析中的差异。

下表7示出了利用PLS-DA得出的代谢物谱中每个代谢物的载荷值，该代谢物谱示出了从68个尿液样本中区分男性和女性的代谢物谱分析中的差异。

[表6]

[表7]

实施例4：利用PLS-DA从68个尿液样本中选择主要代谢物，该主要代谢物在区别男性和女性的代谢物谱分析中显示差异

利用来自实施例3的PLS-DA分析，证实分离了每个性别组，并选择了显示高VIP值的排前10的主要代谢物，VIP值是模型中对性别分离的贡献程度(表8)。进一步地，10种代谢物的量以箱形图表示，以将其与不同性别的代谢物的量进行比较(图3)。

下表8示出了利用PLS-DA得到的代谢物谱中具有显著差异的10种主要代谢物的VIP(变量投影重要性指标)得分值，该代谢物谱示出了在从68个尿液样本中区分男性和女性的代谢物谱分析中的差异。

[表8]

实施例5：选择用于分析尿液样本代谢物的最佳提取溶剂

为了从尿液样本中获得代谢物样本，将68份尿液样本按等比例混合形成尿液混合物，然后将100μl尿液混合物直接用900μl提取溶剂处理而不用尿素酶处理，该提取溶剂分别如下：纯甲醇(MeOH)；纯乙醇(EtOH)；乙腈:水的混合物(50乙腈；1:1，v/v)；以及水:2-丙醇:甲醇的混合物(WiPM；2:2:5，v/v/v)；以及甲酸:甲醇的混合物(AM；0.125:99.875，v/v)，从而提取代谢物，然后进行GC/TOF-MS分析，比较分析其提取效率。

在尿液混合物中，鉴定出113种代谢物，包括胺、氨基酸、糖和糖醇、脂肪酸和有机酸(表9)。

如图4和5所示，证实了提取率和提取可重现性根据提取溶剂而不同。可以看出，定性和相对定量分析的峰强度在AM中最高，从而表明AM中综合代谢物的提取率最高(图4)。进一步地，关于根据提取溶剂的可重现性，发现两个AM中％CV值均记录了最低值，从而证明最高的可重现性(图5)。此外，AM中蛋白质沉降率记录了的第二高值，从而证明AM具有适当的蛋白质沉降能力(图6)。根据上述结果，根据提取率、可重现性和蛋白质沉淀率，在提取代谢物进行尿液代谢物分析时，选择AM作为最佳溶剂。

下表9示出了从人尿液混合物样本中提取的113种代谢物，分别使用的是：纯甲醇；纯乙醇；乙腈:水的混合物；水:2-丙醇:甲醇的混合物；和甲酸:甲醇的混合物。

[表9]