一种基于13c代谢全位标记脂质结合同位素稀释质谱法的全脂质定量方法
阅读说明：本技术 一种基于13c代谢全位标记脂质结合同位素稀释质谱法的全脂质定量方法 (Based on13Full-lipid quantitative method of C metabolism full-position labeled lipid combined isotope dilution mass spectrometry ) 是由 魏芳 吴邦富 吕昕 陈洪 黄凤洪 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于～(13)C代谢全位标记脂质作为内标结合同位素稀释质谱法的全脂质定量方法,该方法是利用生物代谢合成～(13)C代谢全位标记脂质,并结合同位素稀释质谱法建立的一种全脂质一对一绝对定量方法。其特征在于利用～(13)C全标记底物(如CO-(2)、葡萄糖或碳酸(>99%)等)作为唯一碳源加入到诸如微生物、细胞、植物和动物培养基或膳食等中,通过生物代谢过程制备大量高标记效率的～(13)C标记(全位标记)脂质；然后将这些标记脂质作为内标,结合同位素稀释质谱法对实际生物样本中脂质进行一对一的定量分析。本发明具有制备过程简单、可操作性强、定量准确性高、线性动态范围广等优点,同时解决了目前商业化同位素标记脂质标准品缺乏且价格昂贵的难题。(The invention discloses a method based on 13 A full-lipid quantitative method using C metabolism full-position labeled lipid as internal standard and combining isotope dilution mass spectrometry is disclosed, which uses biological metabolism synthesis 13 C metabolizes the whole labeled lipid, and combines the isotope dilution mass spectrometry to establish a whole lipid one-to-one absolute quantitative method. Which is characterized by utilizing 13 C fully-labelled substrate (e.g. CO) 2 Glucose or carbonic acid: (>99%), etc.) as a sole carbon source into media or meals such as microorganisms, cells, plants and animals, producing large quantities of a high labeling efficiency by a process of biological metabolism 13 C-labeled (all-position labeled) lipids; then, the labeled lipids are used as internal standards, and the lipids in the actual biological samples are subjected to one-to-one quantitative analysis by combining isotope dilution mass spectrometry. The invention has the advantages of simple preparation process, strong operability and accurate quantificationHigh performance, wide linear dynamic range and the like, and solves the problems of lack of commercial isotope labeled lipid standard products and high price at present.)
技术领域
本发明涉及利用生物代谢合成13C代谢全位标记脂质，并结合同位素稀释质谱法建立的一种全脂质一对一绝对定量方法，属于分析检测领域。
技术背景
脂质是一类具有疏水或两亲性的复杂化合物的总称，包含多种以骨架结构、头部基团或脂肪酸酰基链为基础结构单元分类的不同类别和亚类(class/subclass)。作为最重要的生物分子之一，脂质具有多种生物学功能，如构成细胞膜的主要成分、能量储存以及参与机体各种生理生化过程的信号转导等。同时，生物体内脂质代谢异常与多种疾病息息相关，是炎症、癌症及内分泌失调等诸多疾病的潜在生物标志物。因此，对生物样本中脂质的组成及含量进行分析，监测生命体在不同生理状态或病理过程中脂质的变化对于理解脂质的生物学功能和疾病的发生和发展具有重要意义。
基于先进质谱平台的脂质组学分析技术是目前脂质分析的主流技术之一，可以实现生物样本中成百上千种脂质的组成和结构剖析。根据目的不同，脂质组学可以分为以分析少数几类确定脂质的靶向脂质组学和无偏差分析所有潜在脂质种类的非靶向脂质组学。目前，大部分非靶向脂质组学分析依然停留在相对定量层面，即只能获得实验组相对于对照组中目标化合物的相对峰强度变化，无法确定每一类脂质的具体浓度。这严重阻碍了脂质组学在更具应用价值的临床研究中疾病标志物阈值的定义和不同实验室分析数据的比较和标准化。非靶向脂质组学绝对定量难的原因主要在于非靶向鉴定脂质种类的数量众多，浓度范围广，不同脂质的质谱响应也存在差异，但对每一类脂质添加商业购买的同位素标记脂质进行绝对定量既昂贵也不现实。因此，如何获得尽可能多的同位素标记脂质是关键所在。目前，同位素标记脂质的获取方式主要是通过化学合成的方法，通过设计一系列有机化学合成反应和分离纯化方法，获得纯度很高的稳定同位素标记脂质。但这种方法费时费力，且价格昂贵。利用化学衍生引入带同位素基团的办法一定程度上可以解决部分问题，但化学衍生一般只能针对含特殊反应基团的脂质，如磷脂、脂肪酸和固醇脂等。且这些方法一般只适用于靶向分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种以代谢全位标记脂质为内标，结合同位素稀释质谱法建立的一种全脂质绝对定量方法，能够实现生物样本中脂质的一对一绝对定量分析。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
一种基于13C代谢全位标记脂质结合同位素稀释质谱法(Isotope dilution massspectrometry,IDMS)的全脂质定量方法，其特征在于利用13C全标记底物作为唯一碳源加入到生物系统中，通过生物代谢过程制备13C标记脂质；然后将所述13C标记脂质作为内标，结合同位素稀释质谱法对实际生物样本中脂质进行一对一的定量分析。
本发明所述基于13C代谢全位标记脂质结合同位素稀释质谱法的全脂质定量方法，包括如下步骤：
1)13C全位标记脂质和12C普通脂质的制备：将13C全标记底物作为唯一碳源加入生物培养基或膳食中，通过生物代谢过程制备高标记效率的13C标记(全位标记)脂质，并提取13C全位标记脂质；同时以含12C碳源的普通培养基或膳食培养生物制备12C脂质，并提取12C脂质；所述12C碳源与13C全标记底物为同一物质，区别仅在于未进行13C标记；
2)标记生物样本脂质组学数据采集：利用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(Ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)对步骤1)所提取的13C全位标记脂质、12C普通脂质进行脂质组学数据采集；
3)脂质定性分析和标记效率计算：利用数据库谱图匹配和同位素理论偏差对12C普通脂质和13C全位标记脂质定性分析和13C标记效率计算；
4)实际待测样本脂质定性分析：对实际待测样本中脂质进行提取，按照步骤2)和3) 进行数据采集和脂质定性分析，获得实际样本中脂质的种类信息。
5)建立IDMS校准曲线：以待分析实际样本和13C标记脂质中都存在的脂质的标准品(该脂质标准品中的C元素为12C，后续称之为12C脂质标准品)配置成不同浓度的梯度标准溶液，以13C全位标记脂质作为内标等量加入梯度标准溶液中，进行质谱脂质组学数据采集；然后，以12C脂质标准品的浓度为横坐标，以12C脂质标准品与相应13C全位标记脂质的提取离子色谱峰面积之比为纵坐标，建立每一类脂质的IDMS校准曲线；
6)对于实际样本中脂质的定量分析：在对实际样本中脂质定量分析时，加入与步骤 4)中等量的13C全位标记脂质作为内标，将目标脂质与对应13C全位标记脂质内标的峰面积比代入其IDMS校准曲线，从而获得实际样本中目标脂质的绝对含量。
按上述方案，利用13C全标记底物作为唯一碳源的培养生物系统包括微生物、细胞、植物和动物等，具体通过生物自身摄入这些13C全标记底物(如CO2，葡萄糖或碳酸盐等)代谢从而替换原有C元素，实现生物系统中所有脂质的13C标记，包括甘油酯、磷脂、鞘脂、糖脂、脂肪酸、固醇脂和各类脂质代谢中间产物等。
按上述方案，所使用的质谱需为高分辨质谱(如quadrupole time-of-flightmass spectrometry,Q-TOF-MS)，数据采集模式为数据依赖型采集模式(Data dependentacquisition,DDA)或SWATH(Sequential windowed acquisition of all theoreticalfragment ions)。数据采集所用质谱也可以是其他类型高分辨质谱，如Orbitrap。
按上述方案，步骤1)中，脂质提取的方法为液液萃取法。
按上述方案，所述步骤2)中，12C普通脂质和13C全位标记脂质可以分别独立进行质谱数据采集和数据分析，也可以混合后进行。当混合分析时，12C普通脂质及其对应的13C 标记脂质的同位素峰分布模式会在同一张谱图中形成特征性的对称峰，可以作为脂质定性判断的一个依据，避免前处理过程引入杂质或仪器信号残留造成的定性假阳性结果。
按上述方案，步骤3)中，对12C普通脂质定性分析时，所使用数据库为MS-DIAL内置LipidBlast脂质数据库，一级质谱(MS)分子离子及二级质谱(MS/MS)碎片离子的m/z 精密度设置为±0.01和±0.05Da，同时谱图匹配打分阈值设置为70-90％。根据精密度和谱图匹配打分阈值所得定性分析的结果，再进一步从一级分子离子m/z准确度(误差<5ppm)、保留时间(误差<5％)和同位素模式(差异<10％)三个维度进行人工筛选以提高定性准确性，避免假阳性结果。
按上述方案，步骤3)中，13C全位标记脂质的定性分析主要通过对应12C普通脂质保留时间以及13C引入导致的一级质谱分子离子和二级质谱碎片离子m/z差进行定向判断，同时m/z偏差在5ppm内。12C普通脂质和13C全位标记脂质存在一一对应的关系，且13C全位标记脂质的存在可以辅助12C普通脂质样本中的定性结果判断，排除假阳性结果。同时，12C普通脂质样本中不应存在13C全位标记脂质。
按上述方案，步骤3)中，对于13C全位标记脂质的定性分析时，由于13C标记后，脂质的MS和MS/MS碎片离子m/z都发生了变化，而MS-DIAL内置的脂质组数据库或其他商业数据库仅包含普通脂质信息，因此无法单独对13C标记样本其进行脂质数据库匹配。在此情况下，本发明利用正常培养条件得到并定性出的生物样本脂质(即12C普通脂质)，通过对其13C标记后脂质进行相应一级和二级离子m/z计算，即每增加一个13C同位素原子，则其m/z相应增加1.003355，从而得到13C全位标记后脂质的一级和二级碎片离子m/z的理论信息。结合保留时间等信息，再利用分析软件PeakView对其13C标记脂质进行检索，可以实现13C标记脂质的定性判断，根据脂质MS同位素分布模式，利用IsoPro 3.0软件进行模拟计算出13C标记效率。
按上述方案，步骤3)中，13C全位标记脂质的标记效率通过同位素模式分布模拟软件 IsoPro进行模拟计算所得，且标记效率应在95％以上。
按上述方案，步骤4)中，12C脂质标准品必须是待分析实际样本和13C全位标记脂质中共同存在的脂质，因此可以根据实际分析样本中脂质覆盖度合理选择代谢标记对象。当实际分析样本中需要定量的目标脂质不存在对应13C全标记脂质作为内标时，可以选择结构最相近、基本可以实现共洗脱的全位标记脂质作为内标。
按上述方案，步骤4)中，12C脂质标准品与相应13C全位标记脂质的提取离子色谱峰时，均选择分析物一级质谱分子离子m/z对应为单同位素峰m0的提取离子色谱峰。
按上述方案，步骤4)中，标准溶液的12C脂质标准品的梯度浓度范围覆盖步骤5)中实际样本中目标脂质的浓度。一般情况下，各脂质标准品的浓度范围优先设置为0.001-500μg/mL。脂质标准品可以单独或混合配置梯度溶液，同时，优先选择氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶剂配置。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过生物代谢标记方法获得了大量13C全位标记脂质，标记效率高，制备过程简单，可操作性强，成本比化学合成低廉，脂质覆盖度更广，解决了目前商业化同位素标记脂质标准品缺乏、价格昂贵的问题；
2、本发以制备的13C全位标记脂质作为内标，结合公认的定量方法金标准——同位素稀释质谱法可以实现对样本中脂质一对一定量分析，定量准确性高，有效克服了传统脂质定量分析中脂质内标缺乏，或需要额外化学衍生过程的限制。
附图说明
图1：普通(A)和13C标记样本(B)中脂质定性分析流程示意图；
图2：普通和13C标记脂质(DGDG 34:3)的二级质谱图；
图3：利用IsoPro计算13C代谢标记脂质(DGDG 34:3和MGDG 34:4)的标记效率；
图4：基于ID-MS脂质绝对定量方法的实验及分析流程示意图；
图5：脂质线性方程及其线性相关性对比：基于12C峰面积和基于12C和13C峰面积比(A和B)SQDG 34:3；(C和D)MGDG 34:6；(E和F)DGDG 36:0；
图6：不同条件下(正常、缺氮、缺磷)培养的三角褐指藻所含有的11种不同脂质的含量。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明中涉及的13C代谢标记培养生物可以采用：
1)解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。作为一种非常规酵母，解脂耶氏酵母能够利用多种廉价的物质作为生长所需的底物，大量合成自身生命活动所需的各种营养物质和产生各类代谢物，具有繁殖速度快，生物量大，油脂丰富的特点。
菌种种子液经LB培养基培养至对数期后，无菌条件下反复清洗离心数次后重悬，按照培养基体积的千分之一接种量接种至合成培养基中，培养至稳定期后，离心去除培养液，真空冷冻干燥收获菌体。
合成培养基组成：每1L去离子水中加入5g葡萄糖(普通或13C全标记葡萄糖)、5g(NH4)2SO4、3g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、15mg EDTA、1mL Trace Salt溶液和100μLVitamin溶液。其中Trace salt溶液：每100mL含45mg ZnSO4·7H2O、3mg CoCl2·6H2O、 10mgMnCl2·4H2O、3mg CuSO4·5H2O、45mg CaCl2·2H2O、30mg FeSO4·7H2O、4mg NaMoO4·2H2O、10mg H3BO4、1mg KI。Vitamin溶液：每50mL含2.5mg生物素biotin、50mg泛酸钙、50mg烟酸、1250mg肌醇、50mg烟酸硫胺素、50mg盐酸吡啶和50mg对氨基苯甲酸。溶解好的培养基，用6MHCl溶液和KOH溶液调节pH＝6。在121℃下灭菌 20min，葡萄糖单独115℃灭菌，Trace salt溶液和Vitamin溶液过0.22μm滤器灭菌后与主体溶液混合。
2)钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)。作为一种进行光合作用的蓝藻类海洋植物，钝顶螺旋藻可以利用简单营养素大量合成包括糖脂在内的多种脂质。
钝顶螺旋藻种子液用f/2培养基培养至对数期后，无菌条件下反复清洗离心数次后重悬，按照培养基体积的千分之一接种量接种至新鲜f/2培养基中，静置培养至稳定期后，离心去除培养液，真空冷冻干燥收获菌体。
f/2培养基：每1L人工海水加入0.075g NaNO3、0.057g NaH2PO4·2H2O、0.03gNa2SiO3·9H2O、1mL微量元素储存液、1mL维生素储存液。其中人工海水：每1L去离子水中加入20.758g(2.07％)NaCl、0.587g(0.06％)KCl、0.17g NaHCO3(普通或13C全标记NaHCO3)、0.0746g NaBr、0.0225g H3BO3、0.0027g NaF、5.5g(0.55％)Na2SO4、 9.395g(0.94％)MgCl2·6H2O、1.316g CaCl2·2H2O、0.0214g SrCl2·6H2O，溶解后在 121℃下灭菌20min后备用。微量元素储存液：9.8mg CuSO4·5H2O、22mg ZnSO4·7H2O、 10mg CoCl2·6H2O、0.18gMnCl2·4H2O、6.3mg Na2MoO4·2H2O、4.36g Na2EDTA、3.15g FeCl3·6H2O、1L H2O，过滤除菌。维生素储存液:1L去离子水中溶解1mg生物素、1mg 维生素B12、200mg维生素B1，用0.22μm滤器过滤灭菌。
本发明所述13C代谢标记对象不止限于上述两种，其他通过摄入13C全标记底物或营养组分后通过生物代谢替换原有12C的生物，如细胞、植物或动物都可以适用本发明。
本发明所述普通生物样品中和13C代谢标记生物样本中脂质的提取方法为液液萃取法，包括且不限于以下提取方法和过程：参考Bligh和Dyer等人(Dyer,1959)的研究，对生物样本脂质进行提取，详细操作步骤如下：将冻干好的样本用研钵研磨成细微粉末状，称取10 mg左右于12mL玻璃螺纹管中，加入1mL去离子水，再加入2.5mL甲醇，涡旋混匀数分钟后置于-20℃冰箱过夜沉淀蛋白。隔天取出后再加入1.25mL氯仿，涡旋10min后，再加入1.25mL氯仿，涡旋10min。之后加入1.25mL去离子水，涡旋10min后，在4℃，5000 rpm/min转速下离心20min。之后倾斜螺纹管管体，用玻璃巴氏管小心吸取下清于干净玻璃试管中，注意不要刺破中间的蛋白层。之后再加入2mL氯仿，重复提取过程，合并下清，氮吹干后用1mL氯仿/甲醇(1:1)溶液复溶，过0.22μm有机相滤膜后于进样小瓶中待上机。
本发明涉及的仪器分析条件如下，但不局限于此，只要可以实现生物样本中非靶向脂质分析的液相色谱串联高分辨质谱方法均可使用。
所使用仪器为UPLC 30A系统(Shimadzu Corporation,Japan)串联TripleTOF6600系统 (AB SCIEX,USA)。液相分离条件：色谱柱：Kinetex C18色谱柱(100mm×2.1mm,2.6μm) (美国Phenomenex公司)，接同样芯材的预柱Security Guard precolumn(美国Phenomenex公司)；流动相：A相：甲醇/乙腈/水(1:1:1,V/V/V)；B相：异丙醇/乙腈(5:1，V/V),二者皆含5mmol/L的醋酸铵；梯度洗脱程序为0-0.5min，80％A相；0.5-1.5min，60％A相；1.5-3 min，40％A相；3-13min，2％A相；13-13.1min，80％A相；13.1-17min，80％A相。质谱分析条件：在正电喷雾电离(ESI+)和负电喷雾电离(ESI-)模式下进行数据采集模式为数据依赖型采集模式(DDA)。外部校准输入系统(calibrant delivery system,CDS)每隔8个样对质谱质量精度进行自动校准。在正离子模式下，MS参数为：去簇电压设置为80V，碰撞能量设置为30V，离子喷射电压设置为+5500V，质量范围为50～1200m/z。离子源的气体 1和气体2设置为50psi。幕帘气设置为35psi，界面加热器温度设置为600℃；在负离子模式下，去簇电压设为-80V，碰撞能量设为-30V，离子喷射电压设为-4500V，质量范围为 50～1200m/z。数据采集软件为AB SCIEX Analyst TF 1.7Software(AB SCIEX,USA)。
质谱数据采集后，数据分析首先通过MS-DIAL内置数据库LipidBlast进行二级谱图匹配，同时一级质谱分子离子和二级质谱碎片离子的m/z精密度为±0.01和±0.05Da。定性准确度打分值设定为80％。为了提高鉴定的可信度，减少假阳性结果，利用PeakView从一级分子离子m/z准确度(误差<5ppm)、保留时间(误差<5％)和同位素模式(差异<10％)三个维度对MS-DIAL中鉴定的脂类进行数据人工评价，进一步验证和筛选MS-DIAL中鉴定的脂类。13C标记脂质通过对应12C普通脂质保留时间(13C标记脂质与对应12C普通脂质的保留时间相同)以及13C引入导致的MS和MS/MS离子m/z差(13C引入导致的MS和MS/M 离子m/z差＝1.003355n，n代表脂质中的碳数)进行定向判断，同时一级质谱分子离子的m/z 偏差在5ppm内。13C全位标记脂质的标记效率通过同位素模式分布模拟软件IsoPro进行模拟计算所得。
本发明涉及的脂质定量方法为同位素稀释质谱法，根据美国食品药品监督管理局(Food &Drug Administration,FDA)或欧洲药品管理局(European Medicines Agency,EMA)的生物分析方法验证指南建立的金标准和计量框架，在基于质谱的分析中，基于基质匹配的多外标校准和内标法的同位素稀释质谱法是具有最高计量等级的定量方法。同位素稀释质谱法是将已知质量的同位素元素作为稀释剂加入到分析元素中，利用质谱分析混合前后同位素丰度的差异，从而计算出分析样本中该元素的浓度的方法。对于脂质组学绝对定量分析而言，同位素标记脂质可以作为内标加入到分析样本中，得到目标分析脂质与同位素标记脂质的响应比，同时利用普通脂质标准品在线性动态范围内配置成一系列梯度溶液，加入等质量的同位素标记脂质，以二者响应比与浓度比建立外部校准曲线，将分析样本中得到的响应比代入校准曲线则可以计算出样本中该脂质的绝对浓度。当加入样本和外标溶液中的同位素标记脂质的量一致时，即使是不确定浓度的同位素标记脂质也可以作为内标使用，此时只需要把浓度比换成外标浓度即可。
本发明涉及同位素稀释质谱法的定量分析过程如下：
1)标准品混合母液及混合梯度溶液的配置：取适量体积的每一类标准品母液，配置标准品系列梯度标准品混合母液溶液，每一类脂质具体浓度分别为：0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、10 μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。脂质标准品选择氯仿/甲醇＝2:1 (v/v)溶剂配置。
2)取干净进样小瓶若干，每个小瓶中加入13C代谢全位标记脂质提取物20μL，氮吹干后分别加入100μL不同浓度的标准品混合梯度溶液，每个梯度重复三次。之后涡旋混匀后转移至内衬管中，待上机。
3)IDMS校准曲线的绘制：IDMS校准曲线的横坐标为12C标准品的浓度(μg/mL)，纵坐标为12C脂质标准品与相应13C全位标记脂质的提取离子色谱峰面积之比，这里选择分析物分子离子对应m0(天然单同位素峰和全位标记同位素峰)的m/z提取离子色谱峰。根据美国食品和药物管理局(FDA)生物分析指南，通过测量每种标准的线性度、检测限 (LOD)、定量限(LOQ)等来评估分析方法的有效性。分别使用3:1和10:1的信噪比来估计LODs和LOQs，而采用相关系数(R2)作为线性判断依据。对于实际样本中脂质的定量分析，只需要往其中加入等量13C全位标记脂质，得到相对应的峰面积之比后代入IDMS标准曲线中，即可获得该脂质在实际样本中的浓度。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。
实施例1
一种基于13C代谢全位标记脂质结合同位素稀释质谱法的糖脂定量方法，包括如下步骤：
1)13C代谢全位标记糖脂的制备：以13C全标记NaHCO3为唯一碳源按照前述培养条件和流程培养螺旋藻，待到稳定期后，离心、冷冻干燥，液液萃取法提取获得13C全位标记糖脂。并以普通含12C底物NaHCO3培养螺旋藻菌体提取脂质作为对照(培养条件等一致)。
2)螺旋藻脂质定性分析和13C标记效率计算：将普通和13C全位标记螺旋藻脂质样本分别单独进行质谱脂质组学数据采集，并根据前述分析流程和标记计算方法进行定性分析和13C标记效率计算。
表1 13C标记螺旋藻中糖脂信息及其标记率
由表1中数据可知，标记螺旋藻中15种SQDG，12种DGDG和22种MGDG的13C标记效率在97.5-98.6％之间。这些结果表明代谢标记后的脂质可以作为脂质定量的理想内标，可以解决目前缺乏同位素标记的糖脂商业标准品的问题。
3)糖脂标准品混合母液配置：取糖脂标准品配置成500μg/mL的混合标准品母液，并稀释成梯度浓度溶液：0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。脂质标准品选择氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶剂配置。
取干净进样小瓶，每个小瓶中加入13C代谢全位标记脂质提取物20μL，氮吹干后加入 100μL标准品混合梯度溶液，每个梯度重复三次。之后涡旋混匀后转移至内衬管中，待上机。
4)IDMS校准曲线的绘制：IDMS校准曲线的横坐标为12C标准品的浓度(μg/mL)，纵坐标为12C脂质标准品与相应13C全位标记脂质的提取离子色谱峰面积之比，这里选择分析物分子离子对应m0(天然单同位素峰和全位标记同位素峰)的提取离子色谱峰。采用相关系数(R2)作为线性判断依据。结果如表2所示。
表2利用12C峰面积和12C/13C峰面积比建立的糖脂定量方法的线性方程及线性相关性比较
由表2可以看出，糖脂基于12C普通脂质峰面积校准曲线的线性系数在未经13C标记脂质校准前较低，其线性方程曲线如图5所示，可以看出在脂质浓度逐渐升高到一定数值时，其质谱响应峰面积逐渐趋于饱和，不会再线性增长，这可能是由于在高浓度下，脂质离子之间相互作用和聚集增强，存在抑制效应，从而影响其质谱响应。经过13C标记脂质峰面积校准后，可以明显看出校准曲线线性系数提高，在高浓度考察范围下依然可以达到0.99 左右，定量准确性和精密度都得到明显改善。
实施例2
基于13C代谢全位标记脂质结合同位素稀释质谱法对三角褐指藻所含脂质的定量分析，包括以下步骤：
1)13C代谢全位标记脂质的制备和分析：分别以13C全标记葡萄糖和NaHCO3为唯一碳源按照前述培养条件和流程培养解脂耶氏酵母和螺旋藻，待到稳定期后，离心、冷冻干燥，液液萃取法提取获得13C全位标记脂质。并以普通含12C碳源培养基培养解脂耶氏酵母和螺旋藻菌体提取脂质作为对照(对照组的区别之处仅在于分别采用普通葡萄糖和NaHCO3为唯一碳源)。将普通和13全位标记脂质样本单独或混合后进行质谱脂质组学数据采集，并根据前述分析流程和标记计算方法进行定性分析和13C标记效率计算，结果如表3和表1所示。
表3 13C标记解脂耶氏酵母中主要脂质类别信息及其标记率
因此，在解脂耶氏酵母中，鉴定出共存的普通和13C标记脂质共18类，288种，大部分脂质的标记效率均在99％以上。可以作为常见脂质定量的良好内标。
2)脂质标准品混合母液配置：取TAG(16:0-18:1-16:0)、TAG(18:2-18:2-18:2)、TAG (20:1-20:1-20:1)、DAG(16:0-18:1)、DAG(18:1-18:1)、LPC 18:1、LPE 16:0、PC(16:0-18:1)、PC(18:1-18:1)、PE(16:0-18:1)、PE(18:1-18:1)、PG(16:0-18:1)、PG(18:1-18:1)、PS (16:0-18:1)、PS(18:1-18:1)、PI(16:0-18:1)、PI(18:1-18:1)、PA(16:0-18:1)、PA(18:0-18:1)、 (16:0-18:1)、PE(18:1-18:1)、Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/17:0)、FA 18:2和FA 22:1配置成除PI(10μg/mL)外每一类浓度为100μg/mL的混合标准品母液，并稀释成：0.0001 μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1 μg/mL、10μg/mL、50μg/mL梯度溶液。每个梯度重复三次。之后涡旋混匀后转移至内衬管中，待上机。其中，脂质标准品选择氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶剂配置。
3)IDMS校准曲线的绘制：IDMS校准曲线的横坐标为12C标准品的浓度(μg/mL)，纵坐标为12C标准品与相应13C全位标记脂质的提取离子色谱峰面积之比，这里选择分析物分子离子对应m0(天然单同位素峰和全位标记同位素峰)的m/z提取离子色谱峰。采用相关系数(R2)作为线性判断依据。结果如表4所示。
表4利用12C峰面积和12C/13C峰面积比建立的各类脂质定量方法的线性方程及线性相关性比较
由此可见，在经过13C标记脂质峰面积校准以后，几乎所有脂质的线性方程相关系数都得到显著改善，从0.90左右甚至以下提高到0.99以上，提高脂质定量分析的线性范围，为样本中高含量脂质的定量分析提供更为准确的定量，而同时也不影响低浓度脂质的分析。
4)正常和缺磷/氮培养三角褐指藻菌体的获取：取培养至对数生长期的三角褐指藻菌液 8mL(接种量1％)接种于装有800mL f/2培养基的三角锥形瓶中，在22℃利用空气泵通气，50μmol photons·m-2·s-1光强，明暗周期为12h/12h条件下培养7天左右(藻液呈暗褐色)，开始缺磷/氮培养。在4℃，9000rpm/min离心10min获取菌体后去除原有菌液，获得的菌体取部分作为正常培养三角褐指藻菌体，其余菌体加入缺磷/氮f/2培养基 (不添加Na2PO3盐或NaNO3盐)重悬培养，在重悬之前尽量去除原培养基残留造成的氮/ 磷元素。最后按照之前的条件继续培养大致5-6天后离心收集菌体，并置于-20℃保存。
5)将1)中获得的13C标记糖脂和常见脂质作为内标加入到正常和缺磷/氮培养的三角褐指藻菌体中，利用液液萃取法提取脂质，并利用建立的各类脂质的IDMS标准曲线进行全脂质组定性定量分析。为验证定量方法的准确性，同时在分析样本中加入已知浓度的用于常规定量分析的氘代脂质内标。其组成为：15:0-18:1-d7-PE，15:0-18:1-d7-PS，15:0-18:1-d7- PG，15:0-18:1-d7-PI，15:0-18:1-d7-PA，18:1(d7)Lyso PE，15:0-18:1-d7-PC，18:1(d7)Lyso PC，d18:1-18:1(d9)SM，15:0-18:1-d7 DG，18:1(d7)Chol Ester，15:0-18:1(d7)-15:0TAG， 18:1(d7)MAG，C15 Ceramide-d7(d18:1-d7/15:0)，C16:0-d4-FA。将实际浓度与利用该方法计算的浓度进行对比，结果如表5所示。
表5定量方法准确性验证结果
由表5中结果可知，基于13C代谢全位标记脂质作为内标结合同位素稀释质谱法对实际样本中脂质的定量分析中的测定浓度和真实浓度非常接近，表明这种定量方法获得的实际样本中脂质浓度是真实可靠的。本发明依照这种定量方法对正常和缺磷/氮培养的三角褐指藻菌体436种脂质，包括18(分)类，主要为甘油酯(DAG和TAG)、磷脂(LPC、PC、 PA、PE、PG、PI和CL)、糖脂(MGDG、SQDG、DGGA、DGDG和LDGTS)、Cer、FFA 和ASG进行了定量分析，为定量生物学中生物体代谢过程精准动力学建模分析提供了良好的方法和工具。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。
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