一种监测蒸煮过程中谷物内部组分结构及分布的方法
阅读说明：本技术 一种监测蒸煮过程中谷物内部组分结构及分布的方法 (Method for monitoring internal component structure and distribution of grains in cooking process ) 是由 王莉 耿涵 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种监测蒸煮过程中谷物内部组分结构及分布的方法,属于不同蒸煮程度谷物结构剖析技术领域。本发明所述的动态监测蒸煮过程中谷物内部组分分布变化的方法包括蒸煮取样、固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、染色、观察；所述蒸煮取样是将蒸煮到不同温度的谷物样品进行取样；所述浸蜡是在54～56℃之间进行；所述展片是采用镊子取切片面,展于含有体积百分比为5％～10％的乙醇溶液中,完全舒展后再展于42℃水中,捞片,选择平展的谷物切面样品黏附于载玻片上。本发明能用于比较不同品种谷物间的蒸煮过程变化,从微观角度解释各品种间的蒸煮食味品质差异,为谷物品质形成提供理论基础。(The invention discloses a method for monitoring internal component structure and distribution of grains in a cooking process, and belongs to the technical field of grain structure analysis of different cooking degrees. The method for dynamically monitoring the distribution change of the internal components of the grains in the cooking process comprises the steps of cooking sampling, fixing, washing, dehydrating, transparentizing, waxing, embedding, slicing, spreading, dyeing and observing; the cooking sampling is to sample grain samples cooked to different temperatures; the wax dipping is carried out at 54-56 ℃; the slide is obtained by taking a slide face by using tweezers, spreading the slide face in an ethanol solution containing 5-10% of volume percentage, spreading the slide face in water at 42 ℃ after complete spreading, fishing out the slide, and selecting a flat grain section sample to be adhered on a glass slide. The method can be used for comparing the change of the cooking process among different varieties of grains, explaining the difference of the cooking taste and quality among the varieties from a microscopic angle and providing a theoretical basis for the formation of the grain quality.)
技术领域
本发明涉及一种监测蒸煮过程中谷物内部组分结构及分布的方法，属于不同蒸煮程度谷物结构剖析技术领域。
背景技术
切片技术是从事生物学、组织学研究观察动、植物内部显微结构的基础实验方法，为动、植物进行组织化学染色、开展免疫组化研究及进行原位杂交等研究提供了基础技术。但是切片展示的图像为平面图像且光学显微镜放大的倍数有限，很难对植物组织的整体形态、三维立体形态和亚细胞结构进一步做观察。
扫描电镜是利用细聚焦电子束在样品表面扫描时激发出来的各种物理信号来调制成像，已广泛利用于生物学、医学、冶金学等学科中微观结构的观察。扫描电镜景深大，成像富有立体感，分辨率高，适用于粗糙谷物样品表面的观察和分析。激光扫描共聚焦显微镜在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。对植物组织的石蜡切片、电镜扫描观察技术和激光共聚焦观察技术已趋于成熟，而动态监测谷物蒸煮过程中不同温度段的组织剖析还不常见。
谷物作为世界人民主要的粮食作物，谷物的品种、产地、种植、收获、储藏、加工等因素决定了谷物的组成和结构特性，而煮制成鲜食熟制品是最终蒸煮品质的释放过程。随着对谷物品质研究的深入，谷物蒸煮过程中组分和结构的变化与品质特性的关系成为研究的新热点。非侵入性测温方法可以准确控制蒸煮过程，充分了解蒸煮过程的核心温度，避免侵入性方法导致测温不准确的弊端，如红外传感和热电偶探头测温等途径。而红外传感具有有限的穿透能力，通常用于监测表面温度。热电偶直接测量温度，并把温度信号转换成热电动势信号，通过电气仪表转换成被测介质的温度，通常由热电极、绝缘套保护管、接线盒、显示仪表和记录仪表等主要部分组成，测量精度高，不受中间介质的影响，构造简单，使用方便。
谷物籽粒生长过程大体经历籽粒灌浆初期、乳熟期、蜡熟期、黄熟期和完熟期。随着籽粒生长进程，籽粒中的主要营养物质不断积累，胚乳由液态逐渐发育成质地紧密的固态。由于灌浆初期谷物籽粒的水分含量高，质地柔软，所以常规的谷物组织分析主要来自灌浆早期的谷物样品。随着籽粒内部水分的减少，淀粉和蛋白质的积累增加，籽粒结构变得紧密难以切开。
目前常用的切片方法包括石蜡切片、树脂包埋切片和切片机切片等，比如：专利CN105699142A发明了一种小麦籽粒的石蜡切片方法，专利CN1043746019A发明了一种谷物成熟种子树脂切片的方法。成熟谷物籽粒淀粉含量高，内部组织致密，水分含量低，获得完整切片的前提是需要提高籽粒的韧性，降低脆性。这些传统的石蜡切片方法时间较长且经过较多次数的脱水，会使谷物样品结构变得坚硬，切片时易破碎，无法获得硬度适中、结构完整的谷物籽粒切片。而树脂切片包埋后使得组织结构坚硬、难以切开，操作难度高，对切片机要求高，故成本较高。
发明内容
[技术问题]
对植物组织的石蜡切片、电镜扫描观察技术和激光共聚焦观察技术已趋于成熟，而动态监测谷物蒸煮过程中不同温度段的组织剖析还不常见。
[技术方案]
为了解决上述问题，本发明提供了一种动态监测蒸煮过程中谷物内部组分结构及分布变化的方法，不仅拓展了研究谷物品质的新方法，提高了谷物切片的效率，保存了谷物籽粒内部组分的结构和分布状态，通过乙醇辅助展片获得更为平整的切片，同时通过不同的荧光染色法实现了组分之间的区分与辨别，为谷物精细结构的鉴定提供了新思路。
本发明的第一个目的是提供一种观察谷物蒸煮过程中截面微观结构变化的方法，包括蒸煮取样、淬断、自然截断、观察；其中所述蒸煮取样是将蒸煮到不同温度的谷物样品进行取样；所述淬断是取样之后立刻置于液氮中进行淬断。
在本发明的一种实施方式中，所述的所述蒸煮取样中蒸煮是将谷物进行淘洗，20-30℃环境下浸泡30～40min，蒸煮30～40min，焖10～15min。
在本发明的一种实施方式中，所述蒸煮取样中不同温度的监控是将热电偶插入浸泡后开始蒸煮的谷物中心区域，观察显示屏所示温度，每隔10℃取出谷物样品。
在本发明的一种实施方式中，所述谷物为淀粉含量在40％以上的谷物，包括大米、玉米、小麦、藜麦、青稞、大豆、绿豆、红豆等。
在本发明的一种实施方式中，所述蒸煮取样是选择颗粒饱满，外形完整的谷物。
在本发明的一种实施方式中，所述淬断的目的是使得谷物表面的水分干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述自然截断是用两把镊子夹住淬断后的籽粒，在中间部位将其掰断获得籽粒截面，将截面黏在导电胶上。
在本发明的一种实施方式中，所述的观察是将谷物截面进行离子溅射仪喷金处理，放入扫描电子显微镜中观察不同蒸煮温度下谷物的组分微观结构。
本发明的第二个目的是提供一种动态监测蒸煮过程中谷物内部组分分布变化的方法，所述的方法包括蒸煮取样、固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、染色、观察；所述蒸煮取样是将蒸煮到不同温度的谷物样品进行取样；所述浸蜡是在54～56℃温度之间进行。
在本发明的一种实施方式中，所述蒸煮取样中蒸煮是将谷物进行淘洗，20～30℃环境下浸泡30～40min，蒸煮30～40min，焖10～15min。
在本发明的一种实施方式中，所述蒸煮取样中不同温度的监控是将热电偶插入浸泡后开始蒸煮的谷物中心区域，观察显示屏所示温度，每隔10℃取出谷物样品。
在本发明的一种实施方式中，所述的谷物为淀粉含量在40％以上的谷物，包括大米、玉米、小麦、藜麦、青稞、大豆、绿豆、红豆等。
在本发明的一种实施方式中，所述固定是将取样的谷物浸泡于固定液中，置于25℃环境下放置24h，期间观察谷物状态适当更新固定液；所述的固定液为戊二醛、多聚甲醛中的一种或多种混合液进行制备。
在本发明的一种实施方式中，所述冲洗采用水进行冲洗。
在本发明的一种实施方式中，所述的脱水是将固定后的谷物籽粒浸渍在体积浓度为30％、50％、70％、90％、100％梯度浓度的乙醇溶液中4～6min，使得水分含量降至5％以下；或，固定取样冲洗之后立刻置于液氮中进行淬断，使得水分含量降至5％以下。
在本发明的一种实施方式中，所述透明是将脱水后的谷物先在50％乙醇、50％二甲苯的混合溶液中浸渍20～30min，再转移到100％高浓度的二甲苯中浸渍20～30min；其中“％”为体积百分数。
在本发明的一种实施方式中，所述浸蜡是将透明后的谷物浸入54～56℃的低温石蜡中30min。
在本发明的一种实施方式中，所述包埋是将浸蜡后的谷物放入到包埋仪器的高温槽中，在58～60℃环境中倒入液体石蜡，进行包埋。
在本发明的一种实施方式中，所述切片是将包埋好的谷物在冷冻台上20～30min进行脱模，脱模后放至4℃冰箱中进行固形，以便于切片。使用切片机根据所需要的厚度进行超微切片，其中所述切片机是冷冻切片机、石蜡切片机、超微切片机中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述展片是采用镊子取切片面，展于含有体积百分比为5％～10％的乙醇溶液中，完全舒展后再展于42℃水中，捞片，选择平展的谷物切面样品黏附于载玻片上。
在本发明的一种实施方式中，展片之后需要进行烘片，具体是将附有谷物切面的载玻片置于37℃烘箱中烘烤过夜。
在本发明的一种实施方式中，所述染色是荧光染色，荧光染色包括单染和复染，所述单染是配制浓度均为0.2～4mg/mL的异硫氰酸荧光素、甲基橙、罗丹明、甲基红、尼罗红染料，分别对谷物内部的淀粉、蛋白、脂肪进行染色；其中淀粉用异硫氰酸荧光素或甲基橙进行染色；蛋白质用罗丹明或者甲基红染色；脂肪用尼罗红进行染色。染色后用水冲洗1～2次，配置染料、染料储存、染色、洗涤过程中需要避光处理；所述复染是采用浓度为0.2～4mg/mL的复配染液进行染色，所述复配染色液含有罗丹明、尼罗红、异硫氰酸荧光素或甲基橙中的两种或两种以上；其中淀粉用异硫氰酸荧光素或甲基橙进行染色；蛋白质用罗丹明或者甲基红染色；脂肪用尼罗红进行染色；用于淀粉和蛋白染色时淀粉染料比蛋白染料浓度高10～20倍；用于淀粉和脂肪染色时，淀粉染料的浓度为脂肪染料的5～10倍；用于蛋白和脂肪染色时，蛋白染料浓度为脂肪的5～10倍，染色后用水冲洗1～2次，配置染料、染料储存、染色、洗涤过程中需要避光处理。
在本发明的一种实施方式中，所述染色的具体步骤是：分别称取异硫氰酸荧光素、甲基橙、罗丹明、甲基红、尼罗红染料溶于丙酮溶液中，浓度均为0.2～4mg/mL，其中淀粉用异硫氰酸荧光素或甲基橙进行染色，呈现绿色荧光；蛋白质用罗丹明或者甲基红染色，呈现红色荧光；脂肪用尼罗红进行染色，呈现橙色荧光；当使用复染时，用于淀粉和蛋白染色时淀粉染料比蛋白染料浓度高10～20倍；用于淀粉和脂肪染色时，淀粉染料的浓度为脂肪染料的5～10倍；用于蛋白和脂肪染色时，蛋白染料浓度为脂肪的5～10倍，染色后用水冲洗1～2次，配置染料、染料储存、染色、洗涤过程中需要避光处理。
在本发明的一种实施方式中，所述观察根据所需观察目的进行组分染色处理，之后使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜(CLSM)观察。
本发明的第三个目的是本发明所述的方法在食品领域的应用。
[有益效果]
(1)本发明拓展了谷物研究的新途径，从动态监测的角度出发，建立了适用于多种成熟坚硬谷物的内部组分结构和分布探究方法。本发明通过对谷物在蒸煮过程中各个温度段进行监测和取样，更全面的了解谷物结构和分布变化，能用于比较不同品种谷物间的蒸煮过程变化，从微观角度解释各品种间的蒸煮食味品质差异，为谷物品质形成提供理论基础。本发明通过对谷物内部组分表面微观结构和组分分布等多重视角多重探索，从平面到立体，增强了视觉感。
(2)本发明改良了传统切片方法，改良了传统固定液，混合固定液提高软化效果；缩短脱水时间，防止谷物籽粒过分坚硬，切片时易碎的状况；使用低温石蜡进行浸蜡，防止过高温度对样品内部结构的影响；针对不同需求采用不同的染色液和切片效果，提高了组分之间的区分度。本发明的方法可操作性强、方法简便、经济适用，能够解决发育后期籽粒切片易碎的问题，为我国谷物研究提供的新思路和指导。
(3)本发明采用质地较软的石蜡作为包埋剂，尤其是根据需求选择两种不同熔点的石蜡用作浸蜡和包埋，防止过高温度对谷物籽粒本身结构产生影响；且改良固定液，采用复配戊二醛和多聚甲醛的固定液可在一定程度上改善成熟籽粒的韧性。
附图说明
图1为南粳9108、南粳46的生精米中淀粉和蛋白的观察，其中A：南粳9108；B：南粳46。
图2为南粳9108大米内淀粉和蛋白在蒸煮过程中的微观结构；其中A是生米；B是浸泡30min；C是蒸煮至50℃；D是蒸煮至70℃；E是蒸煮至90℃；F是蒸煮至100℃；G是熟米。
图3为南粳46大米内淀粉和蛋白在蒸煮过程中的微观结构；其中A是生米；B是浸泡30min；C是蒸煮至50℃；D是蒸煮至70℃；E是蒸煮至90℃；F是蒸煮至100℃；G是熟米。
图4为实施例1中所淬断样品经过自然截断的扫描电子显微镜截面；其中A为南粳9108放大40倍的截面图；B为南粳9108高倍下观察到的内部组织结构。
图5为对照例1中未淬断直接冷冻干燥的扫描电子显微镜截面；其中A为南粳9108冷冻干燥的截面形态；B为南粳9108放大400倍后的淀粉形态。
图6为实施例2中南粳9108大米制得切片的截面图；其中A是南粳9108蒸煮至50℃的切片；B是南粳9108蒸煮至70℃的切片。
图7为南粳9108、南粳46的生精米的淀粉和蛋白质分布CLSM图，其中A：南粳9108；B：南粳46。
图8为南粳9108、南粳46大米内淀粉和蛋白不同温度下CLSM图，其中A：南粳9108；B：南粳46。
图9为对照例2制备得到的切片；其中A为南粳9108蒸煮至50℃的切片；B为南粳46蒸煮至50℃的切片。
图10为对照例3制备得到的切片，其中A为南粳9108蒸煮至70℃的切片；B为南粳9108蒸煮至70℃时的CLSM图。
图11为对照例4制备得到的切片。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。实施例中的溶液未说明溶剂的都是以去离子水为溶剂。
实施例1
一种观察谷物蒸煮过程中截面微观结构变化的方法，包括蒸煮取样、淬断、自然截断、观察；
具体包括如下步骤：
(1)前处理：挑选粒形完整、颗粒饱满的大米(南粳9108、南粳46)，放入密封袋中，放入4℃环境下长期保存；
(2)蒸煮取样：将大米淘洗3遍，25℃环境下浸泡35min，蒸煮35min，焖10min；同时将热电偶插入浸泡结束后开始蒸煮的谷物中心区域，观察显示屏所示温度，每隔10℃取出大米样品；
(3)淬断：取出各温度段大米后即刻置于液氮中淬断3min，致水分干燥至5％以下；
(4)自然截断：用两把镊子夹住淬断后的籽粒，在中间部位将其掰断获得籽粒截面，将截面黏在导电胶上；
(5)镀金观察：将谷物截面进行离子溅射仪喷金处理，放入扫描电子显微镜中观察不同蒸煮温度下谷物的组分结构和分布。
图1为南粳9108、南粳46的生精米内部淀粉体和蛋白体的观察，从图1可以看出：大米籽中大区域分布着淀粉，淀粉由数个多角形淀粉颗粒聚集而组成复粒淀粉，整体结构致密。蛋白质分布在部分区域淀粉体交接间隙处，呈大小不一的球形。南粳9108、南粳46在相同的放大倍数下，蛋白含量高的蛋白体较为密集，南粳46蛋白体相对较少，但不同蛋白含量样品间呈现相同的分布规律。
图2和图3为南粳9108、南粳46大米内淀粉体和蛋白体在蒸煮过程中的微观结构变化，从图2和图3可以看出：大米在蒸煮过程中都会经历结构完整的淀粉体结构开始出现裂缝，结构崩解，吸水膨胀，开始糊化，最后完全糊化的整个过程，而蛋白质的变化规律是从分布在淀粉体间到糊化后形成网状结构，但依旧是圆粒形状。不同样品之间呈现出不同的快慢进程，蛋白含量稍高的南粳9108糊化进程较蛋白质含量低的南粳46慢。南粳9108样品在浸泡30min后，淀粉体崩解，存在于其间隙的蛋白体暴露出来。50℃时，南粳9108和南粳46可明显观察到从复合淀粉体崩解下来的单粒淀粉体，而蛋白含量较少的南粳46已逐渐吸水，边缘变圆；70℃时，南粳46淀粉体明显糊化、互相挤压，周围有明显的膨化分段线，而南粳9108则显示出进一步膨化的趋势。最后，明显可见蛋白体被挤压在边缘，形成“网络状”结构。
图4为所淬断样品经过自然截断的扫描电子显微镜截面，从图4可以看出：在放大40倍的条件下，截面状态自然，组织排布致密，能够清晰得反映南粳9108内部组分的结构，观察到淀粉等物质的连续性排列；进一步提高放大倍数，在50k放大倍数下，能够观察到南粳9108内部淀粉和蛋白质的分布状态，结构完整，组分区分明确。
对照例1
调整实施例1步骤(3)中的液氮干燥过程为冷冻干燥，在-60℃下，并置于高真空30Pa的密闭容器中，干燥90min，大米选择南粳9108，其他和实施例1保持一致。
图5为未经过液氮淬断干燥直接冷冻干燥后进行观察得到的扫描电子显微镜截面形态。从图5可以看出：由于在高度真空的环境下，将已冻结了的食品物料的水分不经过冰的融化直接从冰固体升华为蒸汽，获得的南粳9108样品中空，内部结构不致密，孔洞较多，一定程度上破坏了淀粉的自身结构。进一步提高放大倍数，观察到糊化后连成片的淀粉被割断，形成许多突然被割裂导致的连接丝，无法反映蒸煮过程对南粳9108内部组分变化的真实影响。
实施例2
一种动态监测蒸煮过程中谷物内部组分结构及分布变化的方法，所述的方法包括蒸煮取样、固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、染色、观察；
具体包括如下步骤：
(1)蒸煮取样：
将大米(南粳9108、南粳46)淘洗3遍，25℃环境下浸泡35min，蒸煮35min，焖10min；同时将热电偶插入浸泡结束后开始蒸煮的谷物中心区域，观察显示屏所示温度，每隔10℃取出大米样品；
(2)固定
挑选各温度谷物籽粒，待水分平衡后，浸泡于体积浓度为4％的多聚甲醛溶液和体积浓度为2.5％的戊二醛溶液按照体积比1:1复配得到的固定液中24h，期间每隔2h，根据籽粒情况，适当添加、更新固定液；
(3)冲洗
将固定好的样品放入包埋盒，使用水冲洗包埋盒3min，冲洗掉多余的固定液后沥干表面的水分；
(4)脱水
将冲洗后的样品浸入体积浓度为30％、50％、70％、90％、100％梯度浓度的乙醇溶液中5min进行脱水，使得水分含量降至5％；
(5)透明
将脱水后的大米先在50％的乙醇、50％的二甲苯的混合溶液中浸渍20min，之后转移到100％的二甲苯中浸渍20min；其中％为体积百分比；
(6)浸蜡
将透明处理后的大米浸渍在55℃的低温石蜡中30min；
(7)包埋
将浸蜡后的大米放入到包埋仪器的高温槽中，在58℃环境中倒入液体石蜡，进行包埋；
(8)切片
将包埋好的大米放置在冷冻台上30min进行脱模，脱模后在4℃冰箱内放置12h；之后使用石蜡切片机进行石蜡切片，选择15μm的厚度，先进行修片，待连续出现完整截面时进行选取；
(9)展片
采用镊子取切片面，展于含有体积分数为8％的乙醇溶液中，完全舒展后再展于42℃水中，捞片，选择平展的谷物切面样品黏附于黏附性高的载玻片上；之后将载玻片置于37℃烘箱中烘烤12h致完全干燥；
(10)染色：
采用复染的方法对蒸煮过程的淀粉和蛋白质组分分布进行观察，在避光环境下，使用丙酮配制质量浓度为0.4％的异硫氰酸荧光素(FITC)和质量浓度为0.04％的罗丹明B(RhB)，配制好后避光保存；在避光、25℃条件下，将FITC和RhB两种溶液按照体积比1:1混合，得到混合染液；之后添加50μL混合染液于切片上，染色5min，后用去离子水洗净切片上的染料，待表面水分干燥，倒置于激光共聚焦显微镜上进行观察。
图6为南粳9108大米蒸煮至不同温度段制得切片的截面图，由图6可知：能得到不同蒸煮温度段的完整的大米的籽粒结构，组织致密，没有碎裂、细缝，形态保持状态佳。
图7为南粳9108、南粳46的生精米的淀粉和蛋白质分布的CLSM图。从图7可以看出：淀粉以多边复合体的形式挤压在一块，形成淀粉体，淀粉体间连接致密，连接成片。蛋白成点状分布在淀粉体周围，表明蛋白质的圆形结构，在籽粒内部，蛋白体分布不均匀。蛋白体在不同样品间呈现相同的分布规律。
图8为南粳9108、南粳46大米内淀粉和蛋白蒸煮至不同温度下的CLSM图。从图8可以看出：浸泡后的大米籽粒内部淀粉较生精米更为松散，表明水分的浸入。50℃时，由于淀粉体的崩解，切面出现缝隙，此时蛋白质也就分布于淀粉体的间隙。90℃时，由于进一步的糊化，淀粉不再是淀粉体的结构，从切片观察得出，淀粉已接近完全糊化，呈现出糊状结构，而蛋白质则呈现出“网络状”结构，存在于糊化的淀粉周围。
对照例2
调整实施例2步骤(4)中脱水的时间为20min，步骤(6)中浸蜡的温度为70℃，其他和实施例2保持一致。
得到的切片如图9，从图9可以看出：南粳9108和南粳46都体现出该方法制得切片坚硬、易碎、所得切片易中空，无法得到完整的籽粒结构。
对照例3
调整实施例2步骤(9)的展片中8％的乙醇溶液为水(乙醇的添加量为0)，其他和实施例2保持一致。
得到的切片如图10，从图10可以看出：南粳9108蒸煮至70℃的切片，截面不平整，有褶皱，进一步进行激光共聚焦显微镜观察发现切面不平整导致染色不均匀，且南粳9108内部组分无法显示在一个平面，观察效果差。
对照例4
调整实施例2步骤(8)中的切片为未改良的切片，具体是：包埋完后未进行4℃、12h保存，立即进行石蜡切片，厚度选择25μm，其他和实施例2保持一致。
得到的切片如图11，从图11可以看出：由于未进行固形，刚包埋后的组织在石蜡切片中形态易被外力改变导致切片形态破坏，厚度过厚导致切片不平整。
对照例5
调整实施例2步骤(2)中的固定液替换为固定液1(戊二醛)、固定液2(多聚甲醛)、固定液3(戊二醛/多聚甲醛体积比1：1复配液)、固定液4(FAA固定液(福尔马林5ml；冰醋酸5ml；70％酒精90ml))、固定液5(体积比为1:1:1:1的福尔马林、多聚甲醛、戊二醛、冰醋酸固定液)，其他和实施例2保持一致。
通过5种固定液的结果对比可以发现：使用固定液4(FAA固定液)、固定液5(体积比为1:1:1:1的福尔马林、多聚甲醛、戊二醛、冰醋酸固定液)固定后组织块更为坚硬、易碎，切片时组织松散、易破碎，无法获得完整切片；而固定液1(戊二醛)、固定液2(多聚甲醛)在一定程度上可以改善谷物籽粒的硬度，且1：1复配之后效果更好，能够对蒸煮过程中不同温度段的谷物样品进行效果良好的切片。
对照例6
调整实施例2步骤(6)中的浸蜡温度为40℃，其他和实施例2保持一致。
石蜡的熔点在45～65℃，当浸蜡温度为40℃时，石蜡无法完全渗入谷物籽粒块中，当石蜡包埋冷却后，渗入不完全的石蜡无法起到支撑作用，导致谷物籽粒变形，塌陷，无法切除完整的切片，观察效果差。
对照例7
将实施例2步骤(9)中展片替换为用表面涂有聚合黏胶的载玻片将样品平展的粘附于载玻片上；其他和实施例2保持一致。
在切片后，先把切片放入含有5％乙醇的水溶液中，再转移至42℃的温水中，可以使切片平整，褶皱和气泡较少，直接将切完的片用表面涂有聚合黏胶的载玻片将样品平展的粘附于载玻片上，无法保证切片完全舒展，易导致褶皱，对后续的观察不利。