阅读说明：本技术 一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法 (method for detecting autophagy effect of anthocyanin-induced rat islet beta cells ) 是由 赖灯妮 邓放明 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于运用细胞生物学检测技术领域,公开了一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法,包括花青素溶液制备、大鼠胰岛β细胞的培养、花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围筛查、流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型、活性氧自由基水平实验和蛋白印迹方法验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型、细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果、建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果、结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体和自噬流效果判断。本发明为花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果建立高通量筛选方法,并为花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬作用预防糖尿病提供理论依据。(The invention belongs to the technical field of applied cytobiology detection, and discloses a method for detecting autophagy effect of a rat islet beta cell induced by anthocyanin. The invention establishes a high-throughput screening method for the autophagy effect of the anthocyanin-induced rat islet beta cells, and provides a theoretical basis for the autophagy effect of the anthocyanin-induced rat islet beta cells to prevent diabetes.)

一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法

技术领域

本发明属于运用细胞生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法。

背景技术

目前，最接近的现有技术：根据世界卫生组织预测2025年全球糖尿病患者突破6亿，增长率高达55％。全球诊断和治疗糖尿病每年花费高达825亿美元。糖尿病主要分为1型、2型以及妊娠糖尿病，其中2型糖尿病占90％以上。胰岛素在体内呈双相分泌，2型糖尿病人的胰岛素在一相高于正常或正常，在二相的高峰延迟，其主要是由于胰岛β细胞数量减少、功能受损以及胰岛素抵抗而形成。胰岛β细胞数量的减少和功能的紊乱与糖毒性、脂毒性等因素密切相关。短期高血糖刺激胰岛素的合成分泌及葡萄糖的利用，而长期的高血糖却被称为糖毒性，长期的高血糖不仅导致胰岛β细胞数量的减少和功能的失常，加剧体内胰岛素抵抗，这些主要是由于糖毒素使得胰岛β细胞发生凋亡和坏死。已有研究报道胰岛β细胞凋亡的信号转导途径主要包括外源性途径、内源性途径以及颗粒酶β途径。这些凋亡信号通路的共同特征是：各种氧化应激和刺激信号激活特定的转导通路，最终激活半胱天冬蛋白酶(caspase)。激活的caspase剪切胞内底物，从而破坏细胞特有的形态结构和影响细胞代谢活动，导致细胞发生凋亡。因此，胰岛β细胞受损及功能障碍是2型糖尿病发病的核心环节，而胰岛β细胞的凋亡在此也扮演了重要角色。

自噬是细胞利用溶酶体降解已受损的大分子物质和细胞器的过程，自噬连续不断清理错误折叠的蛋白质、有害的代谢产物、老化的线粒体等细胞器，从而保持胰岛β细胞的正常状态。在自噬突变的胰岛β细胞中发现内质网以及线粒体障碍，扰乱胰岛β细胞功能。自噬维持胰岛β细胞的数量、结构及功能从而延缓糖尿病的过程。研究发现在敲除自噬相关基因的小鼠中胰岛β细胞不仅形态发生改变，且胰岛素分泌下降。在糖尿病小鼠模型中发现自噬水平的变化伴随着胰岛β细胞的凋亡率显著增加和胰岛素分泌的下降。自噬在胰岛素的存储和释放过程中也扮演着重要的角色，胰岛β细胞中的自噬水平与胰岛素含量成正比，从而推测自噬参与胰岛素颗粒胞吐的分泌过程，在ADP敏感的K⁺离子通道和电压依赖性的Ca²⁺离子通道中起着积极的作用。因此自噬在维持胰岛β细胞数量、结构、功能功能及内环境稳定中起着重要的作用，从而达到预防糖尿病的作用。

花色苷主要存在于果蔬及谷物中，在自然界中主要是由六种花青素单体通过不同的酰基和糖基化构成。由于B环上R1和R2连接的甲氧基和羟基的不同形成了六种花青素单体，而六种花青素单体所具备的生物功效不同。广泛的研究表明花青素具有很强的自由基清除和抗氧化活性能力，在预防心血管疾病、肿瘤、糖尿病中发挥着重要的作用。桑树果实花色苷提取物素通过抗氧化应激抑制胰岛β细胞凋亡，从而预防糖尿病。枸杞中分离的花色苷通过ERK1/2和PI3K/Akt通路上调HO-1蛋白的表达水平，从而保护胰岛β细胞免于H₂O₂诱导的损伤。蓝莓中的花色苷提取物促进胰岛βTC-tet细胞增殖，同时还抑制由高糖诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12的凋亡。但是不同花青素单体在正常和凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体能力及其自噬能力与构效关系尚未报道。因此，亟需一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法以弥补现有技术在这一领域的空白。

综上所述，现有技术存在的问题是：不同花青素单体在正常和凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体能力及其自噬能力与构效关系尚未报道。

解决上述技术问题的难度：花色苷作为一种天然的植物多酚，具有抗氧化、抗炎症、预防心血管疾病等功效，特别是在防治糖尿病方面具有明显的作用，有研究发现花色苷主要通过减少氧化应激、改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌和保护胰岛β细胞等4个方面来防治2型糖尿病。自噬被认为是胰岛β细胞的自我保护机制之一，对于维持胰岛β细胞的结构、数量和功能至关重要。目前尚无有效检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的技术，进而根据花青素诱导大鼠胰岛β细胞的自噬效果评价花青素在预防糖尿病中的作用的技术。

解决上述技术问题的意义：本发明采用检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞静态自噬体数目、动态自噬流和建立高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型相结合的方法，能客观的评价花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬的效果；通过建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株构建了高通量检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法；为检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞的自噬效果建立了高通量筛选方法，并为花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬作用预防糖尿病提供理论依据。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，以花青素单体作为实验材料，以大鼠胰岛β(RIN-m5F)细胞为研究对象，主要通过高糖对细胞活力和凋亡率的影响初步确定高糖凋亡模型的条件，分析其对细胞内活性氧(ROS)水平以及细胞凋亡蛋白的影响进一步验证高糖凋亡模型。其次通过细胞免疫荧光方法检测花青素在正常和高糖凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体效果；建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果；最后结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。以期为为检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞的自噬效果建立了高通量筛选方法，并为花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬作用预防糖尿病提供理论依据。

本发明是这样实现的，一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：

步骤一，将花青素分别溶于二甲基亚砜，配置为400mM储备浓度，于-20℃避光保存；

步骤二，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养大鼠胰岛β细胞；

步骤三，花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查；

步骤四，利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；

步骤五，活性氧自由基ROS水平实验验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；

步骤六，细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；

步骤七，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果；

步骤八，建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株：包括慢病毒载体构建、慢病毒的包装制备、稳定细胞株的筛选；

步骤九，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果；

步骤十，结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。

进一步，步骤三中花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查包括以下步骤：

1)将含2×10⁴个细胞悬浮液接种于96孔板中，每孔取200μL，放置在37℃培养箱培养12h；

2)细胞单层贴壁生长后，按照终浓度为25-200μM添加六种花青素于37℃培养箱继续培养8h；

3)培养结束后，每孔按照1:10的比例加入20μLCCK-8溶液继续培养2h；

4)使用酶标仪在450nm测定各个样品的OD值；

5)同时设置空白组，只加入培养基和CCK-8试剂；阴性组不加待测药物细胞孔，每组设定5个复孔；并根据公式计算出细胞存活率；

细胞活力(％)＝(处理组OD-空白组OD)/(阴性组OD-空白组OD)×100％，细胞毒性(％)＝(阴性组OD-处理组OD)/(阴性组-空白组)×100％。

进一步，步骤四中利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型包括以下步骤：

1)将5×10⁵个细胞悬浮液接种于12孔细胞板中，培养12h；

2)每孔加入终浓度10、20和30mM的葡萄糖后分别培养24、36以及48h；

3)培养结束后，将每孔培养基分别吸入到离心管(1)中，用PBS清洗每孔1次并转入到对应的离心管(1)中；

4)然后每孔加入200-300ul不含EDTA的胰酶，消化细胞30s后直接加入2mL10％胎牛血清的RPMI 1640培养液轻轻吹打，让贴壁细胞悬浮于培养液中，再移入到新的离心管(2)中；

5)将离心管(2)在1000rpm条件下离心8min，再将上清液转入到对应的离心管(1)中，在3000rpm条件下离心8min，去除上清液；

6)用2mLPBS分别加入到离心管(1)和(2)中，用移液枪轻柔重悬细胞；

7)将离心管(1)中的悬浮细胞分别用1000rpm×8min再次离心一次，将上清液转入到对应的离心管(2)中，3000rpm×8min离心，去除上清液；

8)加入300-500ul的Bindbuffer重悬细胞，将离心管(1)和对应(2)细胞混合；

9)轻柔混匀之后，过200目细胞筛至离心管中，得到待测细胞悬浮液；

10)使用流式细胞仪器前，每处理500uL加入5ulAnnexin-V-FICT，室温孵育10min，混匀；

11)随后加入5ul PI混匀，室温孵育5min；

12)用激发波长Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm流式细胞仪器检测大鼠胰岛β细胞凋亡情况；

13)根据大鼠胰岛β细胞凋亡情况，确定大鼠胰岛β细胞凋亡模型条件为30mM和36h。

进一步，步骤五中活性氧自由基ROS水平实验包括以下步骤：

1)通过荧光探针DCFH-DA标记细胞内ROS水平；

2)按照细胞免疫荧光方法制备细胞爬片；以终浓度为50μmol/L的DCFH-DA加入各组处理组中，在37℃孵育50min，随后用PBS洗3遍；分别采用488nm和510nm的最大激发波长和发射波长检查细胞的荧光强度，拍照。

进一步，步骤六中细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型包括以下步骤：

1)细胞培养：RIN-m5F细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃、100％饱和湿度、5％CO₂条件下常规传代培养；

2)细胞分组：将1×10⁶/mL密度的细胞接种于培养板中，待细胞贴壁单层生长后，加入花色苷提取物于培养液中诱导8h；氧化应激状态条件为花色苷提取物预处理2h，随后加入H₂O₂诱导30min；

3)蛋白回收：待细胞处理结束后，弃培养液，用预冷的PBS洗两遍；每孔加入10％SDS；充分混匀后移至新离心管中，冰上孵育20-30min；14000g离心10min，将上清液移至新离心管中，置100℃金属浴10min，随后加入6×loading Buffer，充分振荡混匀，再次100℃金属浴10min，置-80℃冰箱保存备用；

4)蛋白定量：根据BSA试剂盒配置不同浓度BSA标准品、工作液；将不同浓度的BSA标准品和待测蛋白样品分别加入96孔板板中于37℃孵育30min，每组做5个平行；在562nm下，测定吸光值；根据BSA标准品标准曲线计算出样品中蛋白浓度；

5)蛋白印迹检测：浓缩胶和分离胶的配置，Caspase 3选择10％-12％的分离胶；

a.电泳：将配置好的胶装入电泳槽中，加入5-20μL待测蛋白至每个泳道；根据Caspase 3蛋白分子量电压稳定在50-80v，电泳1-2.5h；

b.转膜：根据分子大小将目标蛋白核对后切下胶块，然后将蛋白按照三明治的夹心方式放入装膜槽中；

c.封闭：将膜用封闭液封闭，于摇床上孵育1h；

d.一抗体孵育：一般用1:1000的比例稀释一抗于4℃冰箱孵育过夜，去除一抗，用TPBST将膜清洗三次，每次5-10min；

e.二抗体孵：一般用1:5000的比例稀释二抗，摇床下孵育1h，吸去二抗，PBST将膜清洗三次，每次5-10min；

f.加入化学发光显色液后，通过Image Quant LAS 4000mini凝胶成像仪显影，拍照，保存；用Image J分析软件对各个条带进行定量分析。

进一步，步骤七中利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果包括以下步骤：

1)在正常条件下和高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型中，将含1×105个的细胞悬浮液分别接种于已铺入玻片的12孔培养板中培养12h；

2)每孔中加入50μM的花青素溶液，培养8h；

3)用移液枪吸除培养液，用PBS洗2～3遍；加入4％多聚甲醛室温固定10min，弃多聚甲醛，继续用PBS洗3遍；去掉PBS，加入10％的山羊血清制成的封闭液，室温封闭30min；

4)在10％的山羊血清制成的封闭液中添加0.1％皂素制成稀释剂，稀释剂与一抗体LC3，MBL,PM036按照1：1000混合，将爬片覆于一抗稀释液上，于37℃避光孵育1h；

5)将爬片用封闭液洗三遍；

6)孵育二抗Southern Biotech,4050-05，方法同一抗，将爬片用封闭液三遍；

7)滴适量封片剂在载玻片上，将爬片正面朝下覆于封片剂上，避光干燥；

8)采用激光共聚焦显微镜观察荧光点状聚集数目即为自噬体的数目，点状密集程度可以初步评价大鼠胰岛β细胞产生自噬体能力；当自噬发生后，弥散分布在细胞质中的LC3-I经泛素化加工修饰与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺PE结合形成LC3-II；通过细胞免疫荧光的方法采用激光共聚焦观察点状聚集的数目即为自噬体的数目，点状密集程度可以初步评价细胞自噬；

9)拍照。

进一步，步骤八中建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株包括以下步骤：

1)通过PCR技术从PCMV-RFP-GFP-LC3质粒中扩增RFP-GFP-LC3片段；扩增产物经10g/L琼脂转化、筛选出重组质粒，得到RFP-GFP-LC3-GV374质粒；经过测序比对确认慢病毒载体构建成；

2)将293FT细胞培养至90％，用胰酶消化后以1×10⁶/mL密度传代至细胞平板中培养24h；待细胞生长对数期进根据Lipo3000转染试剂盒的说明书操作；培养24h后收集细胞上清液，3000r/min，离心10min，取上清液；

3)将收集的慢病毒颗粒加入至RIN-m5F细胞中培养48h；期间观察并更换新培养基，待培养结束后，加入体积比为6μg/mL嘌呤霉素进行筛选感染的RIN-m5F细胞；培养7天后，通过荧光显微镜下筛选出带有红色与绿色荧光的细胞；挑选出阳性克隆细胞，转移到新的培养皿中继续培养得到RFP-GFP-LC3胰岛β稳定细胞株。

进一步，步骤九中利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果包括以下步骤：

1)在高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型中，将含1×10⁵/mL RFP/GFP-LC3稳定的细胞株的悬浮液接种于已铺入玻片的培养板中；

2)将50μM花青素与20μM氯奎添加每孔中培养2h，再加入30mM葡萄糖培养36h；

3)反应结束后去掉培养基，用PBS洗爬片2～3遍；加入4％多聚甲醛室温固定10min，弃多聚甲醛，继续用PBS洗3遍；

4)滴适量封片剂在载玻片上，将爬片正面朝下覆于封片剂上，避光干燥；

5)采用激光共聚焦显微镜观察显微镜观察红色荧光/绿色荧光的比例判断自噬流，拍照。

本发明的另一目的在于提供一种所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法在筛选花青素诱导大鼠胰岛β细胞的自噬效果中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬作用预防糖尿病的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明对花青素在正常和高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体效果进行了研究与分析，主要结论如下：

(1)建立了大鼠胰岛β细胞高糖凋亡模型。通过采用CCK-8的方法和流式细胞技术分析不同浓度的葡萄糖对大鼠胰岛β细胞活率、凋亡率，确定了30mM的葡萄糖处理大鼠胰岛β细胞36h为高糖细胞凋亡模型的最佳条件；且通过凋亡蛋白caspase 3和活性氧自由基ROS两种评价指标进一步证实了高糖细胞凋亡模型，发现caspase 3和ROS表达水平与对照组均增加，这表明大鼠胰岛β细胞高糖凋亡模型构建成功。

(2)确立了不同花青素对大鼠胰岛β细胞的毒性。通过采用CCK-8的方法，0-200μM六种花青素单体在正常条件下处理大鼠胰岛β细胞后，发现六种花青素浓度为200μM时均出现细胞毒性，Dp、Pn、Pg、Cy和Pt五种花青素处理大鼠胰岛β细胞合适浓度为25-100μM，而Mv的适宜浓度应低于100μM。

(3)明确了不同花青素在正常条件下诱导大鼠胰岛β细胞自噬体的能力。通过细胞免疫荧光的方法，发现25μM的Pt、Pn、Pg和Mv四种花青素不诱导大鼠胰岛β细胞自噬体，而25μM Dp和Cy两种花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬体。50-100μM Dp、Cy、Pt、Pn和Pg五种花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬体，且呈剂量梯度增加，25-80μM Mv均不诱导大鼠胰岛β细胞自噬体。

(4)明确了花青素在高糖细胞凋亡模型中对大鼠胰岛β细胞自噬体的影响。通过细胞免疫荧光的方法确定0-30mM的葡萄糖本身不诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体。通过细胞免疫荧光和蛋白印迹的方法发现50μM的Dp、Cy、Pt、Pn和Pg五种花青素在高糖细胞凋亡模型中均能诱导大鼠胰岛β细胞自噬体，其中Dp诱导大鼠胰岛β细胞自噬体的能力最强，然而Mv在高糖细胞凋亡模型不诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体。

附图说明

图1是本发明实施例提供的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的采用CCK-8的方法研究了不同浓度的葡萄糖对大鼠胰岛β细胞(RIN-m5F)活力的影响示意图。

图3是本发明实施例提供的采用流式细胞技术分析不同浓度的葡萄糖处理大鼠胰岛β细胞36h后对细胞凋亡率的影响示意图。

图4是本发明实施例提供的采用蛋白印迹的方法研究高糖对大鼠胰岛β细胞中凋亡蛋白表达水平的影响示意图。

图5是本发明实施例提供的研究了高糖对大鼠胰岛β细胞中活性氧自由基(ROS)表达水平的影响示意图。

图6是本发明实施例提供的在正常条件下不同浓度的花青素对大鼠胰岛β细胞自噬体的影响示意图。

图7是本发明实施例提供的通过细胞免疫荧光的方法发现不同浓度的葡萄糖诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体数目的影响示意图。

图8是本发明实施例提供的Dp、Cy、Pt、Pn、Pg和Mv在高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体情况示意图。

图9是本发明实施例提供的采用蛋白印迹方法检测自噬的标记蛋白LC3在高糖细胞凋亡模型中的表达水平示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：

S101：花青素溶液制备：将芍药素、天竺葵素、锦葵素、矢车菊素、飞燕草素以及矮牵牛素六种花青素分别溶于二甲基亚砜，配置为400mM储备浓度，于-20℃避光保存。

S102：大鼠胰岛β细胞的培养：确立大鼠胰岛β细胞(RIN-m5F)为研究对象，用含10％胎牛血清(FBS，BI，150772)的RPMI 1640培养液在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养大鼠胰岛β细胞。

S103：花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查。

S104：利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型。

S105：活性氧自由基ROS水平实验验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型。

S106：细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型。

S107：利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果。

S108：建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株：包括慢病毒载体构建、慢病毒的包装制备、稳定细胞株的筛选。

S109：利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果。

S110：结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。

下面结合实验对本发明的技术效果作进一步描述。

1、实验材料与方法

1.1材料与试剂

芍药素、天竺葵素、锦葵素、矢车菊素、飞燕草素以及矮牵牛素六种花青素单体分别购于美国chromaDex公司。本发明实验所需的材料与试剂如表1所示。

表1实验所需材料与试剂

1.2仪器与设备

本发明实验所需的仪器与设备如表2所示。

表2实验所需仪器与设备

1.3实验方法

1.3.1技术路线

花青素溶液制备----大鼠胰岛β细胞的培养----花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查----流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型---活性氧自由基ROS水平实验验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型----细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型---细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果----建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株----细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果----结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。

1.3.2实验方法

(1)花青素溶液的制备

将六种花青素分别溶于二甲基亚砜，配置为400mM储备浓度，于-20℃避光保存。

(2)大鼠胰岛β细胞的培养

确立大鼠胰岛β细胞(RIN-m5F)为研究对象，用含10％胎牛血清(FBS，BI，150772)的RPMI 1640培养液在37℃，5％二氧化碳(CO₂)的培养箱中培养大鼠胰岛β细胞。

(3)花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查

①将含2×10⁴个细胞悬浮液接种于96孔板中，每孔取200μL，放置在37℃培养箱培养12h；

②细胞单层贴壁生长后，按照终浓度为25-200μM添加六种花青素于37℃培养箱继续培养8h；

③培养结束后，每孔按照1:10的比例加入20μL()CCK-8溶液继续培养2h；

④使用酶标仪在450nm测定各个样品的OD值；

⑤同时设置空白组(只加入培养基和CCK-8试剂)，阴性组(不加待测药物细胞孔)，每组设定5个复孔。

并根据公式：细胞活力(％)＝(处理组OD-空白组OD)/(阴性组OD-空白组OD)×100％，计算出细胞存活率。细胞毒性(％)＝(阴性组OD-处理组OD)/(阴性组-空白组)×100％

(4)流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型

①将5×105个细胞悬浮液接种于12孔细胞板中，培养12h；

②每孔加入终浓度10、20和30mM的葡萄糖后分别培养24、36以及48h；

③培养结束后，将每孔培养基分别吸入到离心管(1)中，用PBS清洗每孔1次并转入到对应的离心管(1)中；

④然后每孔加入200-300ul不含EDTA的胰酶，消化细胞30s后直接加入2mL10％胎牛血清的RPMI 1640培养液轻轻吹打，让贴壁细胞悬浮于培养液中，再移入到新的离心管(2)中；

⑤将离心管(2)在1000rpm条件下离心8min，再将上清液转入到对应的离心管(1)中，然后在3000rpm条件下离心8min，去除上清液；

⑥用2mL PBS分别加入到离心管(1)和(2)中，用移液枪轻柔重悬细胞；

⑦将离心管(1)中的悬浮细胞分别用1000rpm×8min再次离心一次，将上清液转入到对应的离心管(2)中，3000rpm×8min离心，去除上清液；

⑧加入300-500ul的Bindbuffer重悬细胞，将离心管(1)和对应(2)细胞混合；

⑨轻柔混匀之后，过200目细胞筛至离心管中，得到待测细胞悬浮液；

⑩使用流式细胞仪器前，每处理500uL加入5ul Annexin-V-FICT，室温孵育10min，混匀；

随后加入5ul PI混匀，室温孵育5min；

用激发波长Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm流式细胞仪器检测大鼠胰岛β细胞凋亡情况；

根据大鼠胰岛β细胞凋亡情况，确定大鼠胰岛β细胞凋亡模型条件为30mM和36h。

(5)活性氧自由基ROS水平实验包括以下步骤：

1)通过荧光探针DCFH-DA标记细胞内ROS水平；

2)按照细胞免疫荧光方法制备细胞爬片；以终浓度为50μmol/L的DCFH-DA加入各组处理组中，在37℃孵育50min，随后用PBS洗3遍；分别采用488nm和510nm的最大激发波长和发射波长检查细胞的荧光强度，拍照。

(6)采用蛋白印迹的方法研究高糖对大鼠胰岛β细胞中凋亡蛋白表达水平的影响包括以下步骤：

1)细胞培养：RIN-m5F细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃、100％饱和湿度、5％CO₂条件下常规传代培养；

2)细胞分组：将1×10⁶/mL密度的细胞接种于培养板中，待细胞贴壁单层生长后，加入花色苷提取物于培养液中诱导8h；氧化应激状态条件为花色苷提取物预处理2h，随后加入H₂O₂诱导30min；

3)蛋白回收：待细胞处理结束后，弃培养液，用预冷的PBS洗两遍；每孔加入10％SDS；充分混匀后移至新离心管中，冰上孵育20-30min；14000g离心10min，将上清液移至新离心管中，置100℃金属浴10min，随后加入6×loading Buffer，充分振荡混匀，再次100℃金属浴10min，置-80℃冰箱保存备用；

4)蛋白定量：根据BSA试剂盒配置不同浓度BSA标准品、工作液；将不同浓度的BSA标准品和待测蛋白样品分别加入96孔板板中于37℃孵育30min，每组做5个平行；在562nm下，测定吸光值；根据BSA标准品标准曲线计算出样品中蛋白浓度；

5)蛋白印迹检测：浓缩胶和分离胶的配置，Caspase 3选择10％-12％的分离胶；分离胶和浓缩胶的配方分别见表3和表4。

表3分离胶配方

表4浓缩胶配方

a电泳：将配置好的胶装入电泳槽中，加入5-20μL待测蛋白至每个泳道；根据Caspase 3蛋白分子量电压稳定在50-80v，电泳1-2.5h；

b转膜：根据分子大小将目标蛋白核对后切下胶块，然后将蛋白按照三明治的夹心方式放入装膜槽中；

c.封闭：将膜用封闭液封闭，于摇床上孵育1h；

d.一抗体孵育：一般用1:1000的比例稀释一抗于4℃冰箱孵育过夜，去除一抗，用TPBST将膜清洗三次，每次5-10min；

e.二抗体孵：一般用1:5000的比例稀释二抗，摇床下孵育1h，吸去二抗，PBST将膜清洗三次，每次5-10min；

f.加入化学发光显色液后，通过Image Quant LAS 4000mini凝胶成像仪显影，拍照，保存；用Image J分析软件对各个条带进行定量分析。

(7)细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果

①在正常条件下和高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型中，将含1×105个的细胞悬浮液分别接种于已铺入玻片的12孔培养板中培养12h；

②每孔中加入50μM的花青素溶液，培养8h；

③用移液枪吸除培养液，用PBS洗2～3遍；加入4％多聚甲醛室温固定10min，弃多聚甲醛，继续用PBS洗3遍；去掉PBS，加入10％的山羊血清制成的封闭液，室温封闭30min；

⑤在10％的山羊血清制成的封闭液中添加0.1％皂素制成稀释剂，稀释剂与一抗体(LC3，MBL,PM036)按照1：1000混合，将爬片覆于一抗稀释液上，于37℃避光孵育1h；

⑥将爬片用封闭液洗三遍；

⑦孵育二抗(Southern Biotech,4050-05,)，方法同一抗，将爬片用封闭液三遍；

⑧滴适量封片剂(Southernbiotech DAPI Fluoromount-G，0100-20)在载玻片上，将爬片正面朝下覆于封片剂上(勿使产生气泡)，避光干燥；

⑨采用激光共聚焦显微镜观察荧光点状聚集数目即为自噬体的数目，点状密集程度可以初步评价大鼠胰岛β细胞产生自噬体能力；当自噬发生后，弥散分布在细胞质中的LC3-I经泛素化加工修饰与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合形成LC3-II。通过细胞免疫荧光的方法采用激光共聚焦观察点状聚集的数目即为自噬体的数目，点状密集程度可以初步评价细胞自噬。

⑩拍照。

(8)建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株

①慢病毒载体构建

通过PCR技术从PCMV-RFP-GFP-LC3质粒中扩增RFP-GFP-LC3片段。扩增产物经10g/L琼脂转化、筛选出重组质粒，得到RFP-GFP-LC3-GV374质粒。经过测序比对确认慢病毒载体构建成。(此步骤由上海吉凯基因科技有限公司制作)

②慢病毒的包装制备

将293FT细胞培养至90％左右，用胰酶消化后以1×10⁶/mL密度传代至细胞平板中培养24h。待细胞生长对数期进根据Lipo3000转染试剂盒的说明书操作。培养24h后收集细胞上清液，3000r/min，离心10min，取上清液。

③稳定细胞株的筛选

将收集的慢病毒颗粒加入至RIN-m5F细胞中培养48h。期间观察并更换新培养基，待培养结束后，加入体积比为6μg/mL嘌呤霉素进行筛选感染的RIN-m5F细胞。培养7天后，通过荧光显微镜下筛选出带有红色与绿色荧光的细胞。挑选出阳性克隆细胞，转移到新的培养皿中继续培养得到RFP-GFP-LC3胰岛β稳定细胞株。

(9)细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果

①在高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型中，将含1×10⁵/mL RFP/GFP-LC3稳定的细胞株的悬浮液接种于已铺入玻片的培养板中；

②将50μM花青素与20μM氯奎添加每孔中培养2h，再加入30mM葡萄糖培养36h；

③反应结束后去掉培养基，用PBS洗爬片2～3遍；加入4％多聚甲醛室温固定10min，弃多聚甲醛，继续用PBS洗3遍；

④滴适量封片剂在载玻片上，将爬片正面朝下覆于封片剂上(勿使产生气泡)，避光干燥；

⑤采用激光共聚焦显微镜观察显微镜观察红色荧光/绿色荧光的比例来判断自噬流，拍照。

3、结果

3.1高糖诱导大鼠胰岛β细胞凋亡模型的构建

3.1.1高糖对大鼠胰岛β细胞活力的影响

采用CCK-8的方法研究了不同浓度的葡萄糖对大鼠胰岛β细胞(RIN-m5F)活力的影响，结果如图2所示。与对照组相比，培养基中添加10-30mM葡萄糖培养大鼠胰岛β细胞24h后细胞活性无明显差异；然而30mM葡萄糖处理大鼠胰岛β细胞36h和48h后，细胞活性比对照组显著降低，其中分别为76.03％和53.60％。结果表明30mM高糖在36h和48h均能显著抑制大鼠胰岛β细胞活力，因此本发明初步确定浓度为30mM以及时间较短的36h作为高糖细胞凋亡模型的条件。

3.1.2高糖对大鼠胰岛β细胞凋亡率的影响

为了进一步确定高糖凋亡模型的最佳条件，采用流式细胞技术分析不同浓度的葡萄糖处理大鼠胰岛β细胞36h后对细胞凋亡率的影响，结果如图3所示。0-30mM葡萄糖诱导大鼠胰岛β细胞36h后发现凋亡率分别为11.82％、14.63％、17.31％和22.49％。30mM葡萄糖处理组的凋亡率比对照组显著增加(P＜0.01)，其中早期凋亡率为10.21％、晚期凋亡率为12.28％，坏死率仅为0.04％。可见，30mM葡萄糖处理36h对大鼠胰岛β细胞具有明显促凋亡作用。因此，最终筛选出来的高糖细胞凋亡模型最佳条件为葡萄糖浓度30mM，处理时间36h。

3.1.3高糖对大鼠胰岛β细胞中凋亡蛋白表达的影响

在构建的高糖细胞凋亡模型中，采用蛋白印迹的方法研究高糖对大鼠胰岛β细胞中凋亡蛋白表达水平的影响，结果如图4所示。30mM的葡萄糖处理36h后凋亡蛋白Caspase 3被剪切为cleaved-caspase 3的蛋白表达比对照组增加，同时Bcl 2蛋白表达并无显著变化。已有研究报道胰岛β细胞凋亡的机制主要分为外源性、内源性和颗粒酶B途径。然而这些途径通过激活、转运相关激酶和蛋白最终激活半胱天冬蛋白酶(Caspase)家族，而Caspase3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，在细胞凋亡的执行阶段，负责对全部或者部分关键蛋白的酶切。在本发明中发现高糖细胞凋亡模型中激活了Caspase 3的蛋白表达，从而导致大鼠胰岛β细胞凋亡。B细胞淋巴癌/白血病-2(Bcl-2)蛋白家族与内源性凋亡途径密切相关，特别是线粒体途径。在应激条件下Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-l等抗调亡蛋白被抑制，Bax、Bak、Bid等促凋亡蛋白被激活并募集到线粒体膜上，使线粒体膜通透性改变，释放细胞色素C(Cytochrome-C，Cyto-C)，激活Caspase 9，进而Caspase 3，Caspase 6和Caspase 7，从而引发细胞凋亡。但是在本文中Bcl-2蛋白表达水平并无显著变化，初步推测高糖诱导大鼠胰岛β细胞凋亡可能并不是通过线粒体途径而导致细胞凋亡。因此，本实验结果表明30mM的葡萄糖激活caspase 3形成级联反应导致细胞凋亡，从而在凋亡蛋白表达水平评价高糖细胞凋亡模型的成功构建。

3.1.4高糖对大鼠胰岛β细胞中活性氧自由基的影响

在构建的高糖细胞凋亡模型中，研究了高糖对大鼠胰岛β细胞中活性氧自由基(ROS)表达水平的影响，结果如图5所示。通过观察带荧光的DCF明确高糖对RIN-m5F细胞内ROS水平的影响。30mM的葡萄糖对大鼠胰岛β细胞诱导36h后发现葡萄糖组与对照组比较显著升高细胞内ROS水平。在大鼠胰岛β细胞中，正常血糖者氧化的糖代谢产生的ROS可以被超氧化物歧化酶清除，而在高糖时ROS表达水平增加，不能完全被清除，导致细胞内元件受损。当细胞内ROS积累一定的程度，会导致线粒体、内质网细胞器的应激反应，从而激活凋亡蛋白(如Caspase-3,6,7)致使细胞凋亡。因此本实验表明30mM葡萄糖显著增加大鼠胰岛β细胞内ROS表达水平，从而在活性氧自由基表达水平评价高糖细胞凋亡模型的成功构建。

3.2花青素对大鼠胰岛β细胞毒性的影响

通过采用CCK-8的方法，观察了六种花青素在正常条件下对大鼠胰岛β细胞的毒性，结果如表5所示。研究发现与对照组相比，浓度在25-50μM之间的六种花青素对细胞生长的抑制率均在10.95％以下，表明六种花青素对细胞无毒害；浓度在50-100μM之间的Dp、Pn、Pg、Cy、Pt五种花青素对细胞生长的抑制率与对照组相比无明显差异；但浓度为100μM的Mv对细胞生长的抑制率明显上升。当六种花青素浓度为200μM时，细胞大量死亡，具有明显的细胞毒性，其中Cy处理后的细胞毒性为45.25％，其次Mv为42.44％。结果表明花青素浓度为200μM时均出现细胞毒性，25-100μM为Dp、Pn、Pg、Cy、Pt五种花青素处理RIN-m5F细胞合适的浓度，而Mv的适宜浓度应低于100μM。

表5不同浓度花青素对大鼠胰岛β细胞毒性的影响

3.3花青素在正常条件下对大鼠胰岛β细胞自噬体的影响

通过细胞免疫荧光的方法，观察了在正常条件下不同浓度的花青素对大鼠胰岛β细胞自噬体的影响，如图6和表6所示。研究结果发现与对照组相比，浓度为25μM的Pt、Pn、Pg和Mv四种花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬体，但效果无明显差异，而25μM Dp和Cy两种花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬体的效果相对明显；与对照组相比，50-100μM的Dp、Cy、Pt、Pn和Pg五种花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬体数目均呈极显著上升，且呈剂量梯度增加，其中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体数目由多到少分别为Dp、Cy、Pt、Pn和Pg；然而Mv诱导大鼠胰岛细胞自噬体数目与对照组相比无显著差异，其中在50μM浓度时Dp、Cy、Pt、Pn和Pg诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体分别为9.74、9.68、8.8、8.35、7.35个/细胞。而25-80μM的Mv诱导大鼠胰岛β细胞自噬体数目与对照组相比无显著差异。因此，在后续实验中，选定50μM作为花青素在正常条件下诱导大鼠胰岛β细胞自噬体的浓度。

表6花青素在正常条件下诱导大鼠胰岛β细胞自噬体数目

3.4花青素在高糖细胞凋亡模型中对大鼠胰岛β细胞自噬体的影响

为了研究花青素在高糖细胞凋亡模型中对大鼠胰岛β细胞自噬体的影响，首先确定高糖本身是否诱导大鼠胰岛β细胞自噬体，其次通过细胞免疫荧光和蛋白印迹方法分析不同花青素在高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体的能力。通过细胞免疫荧光的方法发现不同浓度的葡萄糖诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体数目的影响，如图7所示。0-30mM的葡萄糖诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体数目与对照组相比无显著差异，而40mM的处理组呈显著差异。这表明0-30mM的葡萄糖本身不诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体，这与ChieEbato研究结果30mM高糖在胰岛β细胞中不诱导自噬一致。因此确定30mM高糖浓度不诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体。

通过细胞免疫荧光的方法，Dp、Cy、Pt、Pn、Pg和Mv在高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体情况如图8所示。研究结果发现浓度为50μM的Dp、Cy、Pt和Pn四种花青素在高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体数目与对照组比呈极显著差异，Pg呈显著差异，其中诱导自噬体的数目由多到少依次为Dp、Cy、Pt、Pn及Pg，而50μM Mv在高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体数目与对照组无显著差异。而50μM的五种花青素均能明显诱导大鼠胰岛β细胞自噬体，其中Dp、Cy诱导自噬体的能力较强，然而Mv在高糖细胞凋亡模型不诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体。因为Dp、Cy、Pt和Pn四种花青素在高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体数目呈极显著差异，诱导自噬体能力较强，所以作为后续研究对象。

为了进一步确定Dp、Cy、Pt和Pn四种花青素在高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬的能力，采用蛋白印迹方法检测自噬的标记蛋白LC3在高糖细胞凋亡模型中的表达水平，结果如图9所示，结果表明Dp、Cy、Pt和Pn处理组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平比对照组增强，且由强到弱依次为Dp、Cy、Pt和Pn，与细胞免疫荧光的实验结果一致。表明Dp在正常条件下和高糖细胞凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体能力最强，因此Dp作为后续研究的对象。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。