阅读说明：本技术 羽扇豆醇在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用 (Application of lupeol in preparation of medicine for preventing or treating liver injury ) 是由 吕志平 黄莎 曾婷 莫婵 周楚莹 赖瑜琪 于 2019-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了羽扇豆醇在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用,本发明表明,在LPS诱导的斑马鱼肝损伤模型中,羽扇豆醇能增加LPS导致的斑马鱼肝脏面积,H&E染色显示羽扇豆醇能减轻肝细胞变性,肿大；TUNEL染色显示羽扇豆醇能减轻肝细胞凋亡；LPS刺激RAW264.5体外细胞模型中,羽扇豆醇显示抗炎活性,具有减轻INOS水平,降低TNF-α水平；因此羽扇豆醇恢复了LPS引起的肝损伤。(The invention discloses an application of lupeol in preparing a medicine for preventing or treating liver injury, and the application shows that in a zebra fish liver injury model induced by LPS, lupeol can increase the liver area of zebra fish caused by LPS, and H & E staining shows that the lupeol can relieve liver cell degeneration and swelling; TUNEL staining showed lupeol to reduce hepatocyte apoptosis; in an LPS stimulated RAW264.5 in vitro cell model, lupeol shows anti-inflammatory activity, has functions of reducing INOS level and reducing TNF-alpha level; thus lupeol restored LPS-induced liver damage.)

羽扇豆醇在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及羽扇豆醇在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。

背景技术

急性肝损伤(Acute Liver Injury，ALI)威胁人类健康。单核吞噬细胞向肝脏的浸润与肝损伤的严重程度相关，肝损伤期间，常驻巨噬细胞，称为Kupffer细胞(KCs)，参与初始应激反应，被广泛认为是负责ALI的主要细胞类型之一，释放导致细胞损伤的各种代谢物，包括超氧自由基，一氧化氮，类二十烷酸，蛋白酶和亲炎性细胞因子等。脂多糖(LPS)可导致KCs显著分泌促炎介质，并最终导致内毒素诱导的肝损伤。

羽扇豆醇(Lupeol)属于五环萜烯型三萜类，在食用蔬菜，水果和许多植物中有存在。分子式为C₃₀H₅₀O，分子量为426.72，结构式如下：

许多研究表明，羽扇豆醇具有许多有益的药理活性，包括抗氧化，抗炎，抗高血糖，抗血脂异常和抗癌变作用。从各种以疾病为目标的动物模型，这些报告表明，羽扇豆醇在各种给药途径如局部，口服，皮下，腹膜内具有抗糖尿病，抗哮喘，抗关节炎，心脏保护，保肝，肾保护，神经保护和抗癌作用。

发明内容

本发明的目的是提供羽扇豆醇在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的：羽扇豆醇在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。

所述的肝损伤为脂多糖所致的肝损伤。

所述药物由有效成分羽扇豆醇和药用辅料组成。

所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

羽扇豆醇在制备降低巨噬细胞INOS表达水平和TNF-a表达水平的药物中的应用。

本发明表明，在LPS诱导的斑马鱼肝损伤模型中，羽扇豆醇能增加LPS导致的斑马鱼肝脏面积，H&E染色显示羽扇豆醇能减轻肝细胞变性，肿大；TUNEL染色显示羽扇豆醇能减轻肝细胞凋亡；LPS刺激RAW264.5体外细胞模型中，羽扇豆醇显示抗炎活性，具有减轻INOS水平，降低TNF-α水平，因此羽扇豆醇恢复了LPS引起的肝损伤，可以作为治疗肝损伤的药物。

附图说明

图1是实施例1的所述斑马鱼胚胎对照组(Control)、模型组(Model)以及给药组的肝脏形态。

图2是实施例1的所述斑马鱼胚胎斑马鱼胚胎对照组(Control)、模型组(Model)、DMSO组以及给药组的H&E病理染色结果。

图3是实施例1的所述斑马鱼胚胎对照组(Control)、模型组(Model)以及给药组的TUNEL染色结果。

图4、5是实施例1的羽扇豆醇对RAW264.7细胞INOS表达的影响。

图6是实施例1的羽扇豆醇对RAW264.7细胞ITNF-α表达的影响。

具体实施方式

本发明是羽扇豆醇在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。优选的，所述的肝损伤为脂多糖LPS所致的肝损伤。所述药物由有效成分羽扇豆醇和药用辅料组成。药物的剂型可以为口服剂型或注射剂型。优选的，羽扇豆醇在制备降低巨噬细胞INOS表达水平和TNF-a表达水平的药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

1.实验材料：

羽扇豆醇(购自上海源叶公司，纯度≥98％)，转基因斑马鱼[Tg(lfabp10α-eGFP)]斑马鱼，AB品系野生成年斑马鱼，RAW264.7巨噬细胞系，TUNEL试剂检测盒

2.实验方法：

2.1体内斑马鱼模型：提前一天选用和AB品系野生鱼分别按照雌雄1：1或2:1分别配对于交配盒中,并用隔板隔离，第二天抽去隔板进行交配；第二天收集鱼卵，在将收集的10hpf的鱼卵随机分为对照组、模型组、DMSO组、低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组，置于六孔板中，每组30卵/孔。羽扇豆醇溶解于DMSO中，低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组，依次分别加入25μM、50μM、100μM羽扇豆醇，给药1小时后，模型组、DMSO组、低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组，低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组依次加入10μg/mL LPS，在28.5℃恒温培养箱中培养至72hpf，结束造模，收集斑马鱼胚胎。

分别收集对照组的所述未进行LPS处理的正常肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼[Tg(lfabp10α-eGFP)]斑马鱼胚胎及模型组的所述斑马鱼胚胎，利用型号为OLYMPUSU-HGLGPS的荧光显微镜拍照，比较空白组和模型组肝脏大小。

分别收集对照组的所述未进行LPS处理的正常斑马鱼胚胎及模型组的所述斑马鱼胚胎，质量浓度为4％的多聚甲醛(PFA)固定，4℃冰箱过夜分别收集对照组的所述未进行LPS处理的正常肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼[Tg(lfabp10α-eGFP)]斑马鱼胚胎及模型组的所述斑马鱼胚胎，利用型号为OLYMPUS U-HGLGPS的荧光显微镜拍照，比较空白组和模型组肝脏大小。。第二日经过80％乙醇脱水2小时，90％乙醇脱水2小时，95％乙醇过夜，次日100％乙醇I脱水0.5小时，100％乙醇II脱水0.5小时，100％乙醇III脱水小时，二甲苯分别处理0.5小时，石蜡I浸泡0.5小时，石蜡II浸泡0.5小时，石蜡III浸泡1小时。将所述斑马鱼胚胎从石蜡中取出,置于包埋盒中,倒入石蜡,进行包埋,然后在切片机上切片,切片厚度设置为4μm。将切好的薄片轻轻放入60℃水浴中,完全开展后,将它转移至涂的载玻片上,放入60℃的恒温箱中烘干约2小时。

H&E染色：将上述制备的石蜡切片，分别按照二甲苯I、II、III各脱蜡3分钟，无水乙醇I、II各2分钟，95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇各1分钟，苏木精染色10分钟，水冲洗之后1％盐酸酒精分化15秒，水中浸泡10分钟，伊红染色3分钟，80％乙醇、90乙醇各10秒，95％乙醇1-2分钟，无水乙醇I、II、III各3分钟，二甲苯I、II、III各3分钟，最后中性树胶封片，显微镜下拍照。

TUNEL染色：将上述制备的石蜡切片首先脱蜡(二甲苯I、II各8分钟，无水乙醇I、II各5分钟，95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇各3分钟)，PBS洗3遍，每遍5分钟，甩干片子，按1:10TUNEL在37℃烘箱避光孵育1小时，PBS洗3遍，每遍5分钟，DAPI染色10分钟，PBS洗3遍，每遍5分钟，最后用抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下拍照。

2.2体外细胞模型：巨噬细胞系RAW264.7培养在含10％FBS,100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的高糖培养基中，37℃，5％CO₂培养箱中孵育。将RAW264.5细胞接种于六孔板中，分为对照组、模型组、DMSO组、低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组，低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组，依次分别加入25μM、50μM、100μM羽扇豆醇，给药6小时后。模型组、DMSO组、低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组，低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组依次加入1μg/mL LPS，在37℃，5％CO₂培养箱中继续孵育18小时，结束造模，收集细胞。

分别收集上述6组细胞，PBS洗3遍，每遍5分钟，用4％的多聚甲醛固定细胞，4℃过夜。第二天，PBS洗3遍，每遍5分钟，含0.1％Triton-X100 PBS通透10分钟，PBS洗3遍，每遍5分钟，含5％山羊血清(PBS+5％5％山羊血清+0.1％Triton-X100)常温下封闭2小时，分别用1:200INOS抗体/1:200TNF-α抗体孵育，4℃过夜。次日，PBS洗3遍，每遍5分钟,1:400荧光二抗常温孵育2小时，PBS洗3遍，每遍5分钟，DAPI染色5分钟，PBS洗3遍，每遍5分钟，抗荧光萃灭剂封片，荧光显微镜拍照。

分别收集上述6组细胞，PBS洗3遍，每遍5分钟，含2％磷酸酶抑制剂和2％蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上裂解30分钟，刮取细胞，4℃离心机，12000rpm，离心15分钟。取上清，BCA进行蛋白定量，加入5X Loading Buffering，98℃变性10分钟，80℃冰箱保存。

Western blot分析：取10μL样本分步进行凝胶电泳和转移到PVDF膜；随后，用5％脱脂牛奶在室温下封闭膜2小时；PVDF膜上的目的蛋白和第一抗体在4℃过夜孵育；用TBS-T缓冲液冲洗三次后，随后用兔Ig G抗体作为二次抗体孵育PVDF膜，2小时后用TBS-T缓冲液冲洗三次。

3.实验结果：

图1为本发明羽扇豆醇对斑马鱼肝脏的影响。结果表明可以降低LPS所致的斑马鱼胚胎肝脏的减小。

图2为斑马鱼胚胎对照组、模型组以及给药组的H&E病理染色结果。结果表明对照组斑马鱼肝脏组织结构正常，肝细胞排列整齐；LPS处理组可见肝脏组织结构紊乱，肝脏细胞可见肿大，变性，少量空泡。中、高浓度给药组斑马鱼肝脏组织结构正常，肝细胞排列整齐。且羽扇豆醇的优选浓度是100μM。

图3为斑马鱼胚胎对照组、模型组以及给药组的TUNEL染色结果的空白组和模型组的TUNEL染色显示，模型组斑马鱼肝细胞较对照组斑马鱼肝细胞凋亡明显增多，中、高浓度给药组斑马鱼肝脏肝细胞凋亡明显减少。且羽扇豆醇的优选浓度是100μM。

图4、5为本发明羽扇豆醇对RAW264.7细胞INOS表达的影响。结果表明，与正常对照组比较，模型组细胞的INOS的表达显著升高，中、高浓度给药组能显著降低INOS的表达水平。

图6为本发明羽扇豆醇对RAW264.7细胞ITNF-α表达的影响。结果表明，与正常组相比，模型组细胞肿瘤坏死因子(TNF-a)的表达显著升高，而羽扇豆醇处理后的RAW264.7细胞，能显著降低TNF-a的表达水平。机体正常水平的TNF-a可以调节免疫应答，抗感染等，但是在大量表达的时候则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。羽扇豆醇能显著降低由LPS引起的TNF-a表达升高，且羽扇豆醇的优选浓度是100μM。