海参磷脂在制备防治糖尿病及其并发抑郁症药物中的应用
阅读说明：本技术 海参磷脂在制备防治糖尿病及其并发抑郁症药物中的应用 (Application of sea cucumber phospholipid in preparation of medicine for preventing and treating diabetes and depression complicated with diabetes ) 是由 张永平 王佳佳 李勇斌 宋采 张翼 聂影影 胡雪琼 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供海参磷脂在制备防治糖尿病及其并发抑郁症药物中的应用。本发明通过实验发现,海参磷脂的添加会使得动物糖尿病症状及相关的抑郁样行为得到改善。模型组与对照组相比,其组织葡萄糖、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇均有显著性的增高(均为P＜0.05),组织甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇含量亦有明显升高,而海参磷脂处理组可显著改善模型组的上述异常指标,提示海参磷脂对糖尿病及其并发抑郁症有改善作用。(The invention provides application of sea cucumber phospholipid in preparing a medicament for preventing and treating diabetes and concurrent depression thereof. Experiments show that the animal diabetes symptoms and related depression-like behaviors can be improved by adding the sea cucumber phospholipid. Compared with a control group, the tissue glucose, the total cholesterol and the low-density lipoprotein cholesterol of the model group are obviously increased (P is less than 0.05), the tissue triglyceride and the high-density lipoprotein cholesterol are also obviously increased, and the sea cucumber phospholipid treatment group can obviously improve the abnormal indexes of the model group and prompt that the sea cucumber phospholipid has the function of improving the diabetes and the concurrent depression thereof.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及海参磷脂在制备预防或治疗糖尿病及其并发抑郁症的药物中的应用。
背景技术
因体内葡萄糖调节紊乱所导致的糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种以持续性高血糖为特点的代谢疾病。糖尿病分为妊娠期糖尿病、1型糖尿病及2型糖尿病等。经济的发展与科技的进步使得人们的生活水平得到进一步的提高，同时也使得作为全球流行性疾病的糖尿病的患病率逐年升高。在2017年，全球4.5亿人患有糖尿病，国际糖尿病联合会(IDF)做出的预测中指出，身患糖尿病的人数在2045年将达到5.87亿，占成年人口的8.3％。糖尿病给患者带来了重大的经济负担，由糖尿病造成的人均每年门诊开销达3000元-20000元。糖尿病患者在其一生中的医疗支出要比非糖尿病患者多出约35,900美元-124,600美元。同时，也对医疗保障系统造成巨大的负担，特别是尚不完善的基层卫生服务体系。
作为代谢紊乱型疾病，糖尿病对机体各组织、各器官及神经等产生慢性损害和功能障碍等不良影响，严重危害人体健康，甚至最终发展残疾和死亡。其中，2型糖尿病在糖尿病患者总数中约占90％。遗传因素、胰岛素抵抗和胰岛素的分泌功能紊乱等会引起2型糖尿病。除了肥胖、缺乏体育运动和年龄等因素外，环境因素如化学有毒物质包括多氯联苯和有机氯农药等也会增加其患病率。除胰岛素抵抗外，超过90％的2型糖尿病都是由胰岛素的功能缺陷引起的。2型糖尿病通常会引起血糖含量的升高，甘油三酯、游离脂肪酸含量的增加，脂质代谢的异常等。另外，糖尿病也会引起各种并发症，如视网膜病变、血管病变、糖尿病足、糖尿病周围神经病变、糖尿病肾病和抑郁症等，给患者带来巨大的压力。
抑郁症指精神状态处于长期的低落状态、精神状态失常，或伴有胸闷、难以入眠等的一种综合病征，抑郁症受到多种因素影响，包括基因、环境、生理和个人认知等，涉及到的代谢物质如神经递质类包括5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去肾上腺素(NE)等，这些神经递质会影响情绪反应、体温调节、精神活动、睡眠等，进而综合影响总体的精神状态。由于抑郁症所涉及的因素较多，有关其发病机制的假说也比较多，目前主要有5-HT假说、细胞因子学说、乙酰胆碱假说、去甲肾上腺素假说、多巴胺假说和综合社会心理因素的考虑等，其发病机制和治疗的研究也更加倾向于结合心理和社会等因素进行综合考量。
与非糖尿病患者相比，糖尿病患者具有更高的概率出现抑郁症的症状，在Mukut等的对患有2型糖尿病患者的研究中，发现有38.8％患者患有抑郁症，其中45.36％患者表现出中度抑郁现象，29.9％重度抑郁，24.74％为轻度抑郁。并且，抑郁症也会增加糖尿病的患病概率。有研究认为，2型糖尿病与抑郁样行为的联系与下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)的功能性紊乱有关，主要表现为皮质醇(Cortisol)分泌的增多和促肾上腺皮质激素释放激素(ACTH)分泌节律的紊乱。由此可见，在对2型糖尿病引起的抑郁样行为的治疗改善中，需要同时考虑糖尿病和抑郁症的影响因素，综合确定适宜的治疗方案。
目前2型糖尿病的治疗主要聚焦于胰岛素及其作用上，主要有双胍类、磺脲类、胰岛素、胰岛素增敏剂和葡萄糖苷酶抑制剂等。但这些药物带来的潜在风险也是不容忽视的，如服用双胍类药物易引起乳酸败血症，磺脲类对肾脏造成一定的负担，胰岛素的使用易造成血糖过低甚至导致死亡。而且这些临床治疗药物几乎对糖尿病的并发抑郁症状无改善作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有糖尿病的降糖药物副作用大，疗效欠佳，且对并发抑郁症无改善等问题，提供海参磷脂在制备预防或治疗糖尿病及其相关抑郁症的药物中的应用，本发明提供的海参磷脂能够降低动物组织中的葡萄糖、胆固醇和甘油三酯，对高糖高脂引发的抑郁症具有改善作用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供海参磷脂在制备预防或治疗糖尿病和/或糖尿病并发抑郁症的药物中的应用。
本发明还提供海参磷脂在制备降低葡萄糖含量的药物中的应用。
本发明还提供海参磷脂在制备降低甘油三酯含量的药物中的应用。
本发明还提供海参磷脂在制备降低总胆固醇含量的药物中的应用。
本发明还提供海参磷脂在制备降低高密度脂蛋白胆固醇的药物中的应用。
本发明还提供海参磷脂在制备降低低密度脂蛋白胆固醇的药物中的应用。
可选地，所述海参磷脂为可溶于乙醇的海参磷脂。
所述海参磷脂从海参中提取得到，优选地，本发明的海参磷脂的提取方法包括如下步骤：
1)一次丙酮除油：取海参粉末，加入丙酮，浸泡后，固液分离，将固液分离所得液体旋转蒸发，得到干品；将固液分离所得固体继续用乙醇浸泡提取，再次固液分离，将所得液体旋转蒸发，得到磷脂粗品，合并所述干品以及磷脂粗品，得到混合物。
2)二次丙酮除油：取步骤1)所得的混合物，采用丙酮萃取，得到不溶解于丙酮的部分为精制磷脂组分，取所述精制磷脂组分，加入乙醇，固液分离，得到可溶于乙醇的海参磷脂。
可选地，所述步骤1)中，所述海参粉末与所述丙酮的体积之比为1：1-3。
可选地，所述步骤1)中，所述固体与所述乙醇的体积之比为1：2-4，所述乙醇为无水乙醇。
可选地，所述步骤1)中，乙醇浸泡温度为35-45℃，重复浸泡提取3-5次。
可选地，所述步骤2)中，所述混合物与所述丙酮的用量之比为1g：1-8mL，优选为1g：3-5mL，更优选为1g：4mL。
可选地，所述步骤2)中，萃取温度为30-70℃，优选为40-60℃，更优选为50℃。
可选地，所述步骤2)中，每次萃取时间为50-70min，优选为60min。
可选地，所述步骤2)中，萃取次数为2-4次，优选为3次。
可选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
可选地，所述药物的剂型为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。以上各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过实验发现，海参磷脂的添加会使得糖尿病模型动物的抑郁样行为得到改善。模型组与对照组相比，其组织葡萄糖、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇均有显著性的增高(均为P＜0.05)，组织甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇含量亦有明显升高，而海参磷脂处理组可显著改善模型组的上述异常指标，海参磷脂对糖尿病及其并发抑郁症有改善作用。本发明发现海参磷脂在制备用于防治糖尿病和抑郁症的相关产品方面具有重要的产业价值。
附图说明
图1显示为实施例中海参磷脂提取的工艺流程图。
图2显示为丙酮用量对磷脂得率的影响图(254nm)。
图3显示为温度对磷脂得率的影响图(254nm)。
图4显示为糙海参不同组分的TLC图像(254nm)。
图5显示为Al2O3柱分离后磷脂组分的TLC图像(254nm)。
图6显示为本发明实施例的体质指数检测结果图。
图7显示为本发明实施例的组织葡萄糖含量检测结果图。
图8显示为本发明实施例的组织甘油三酯测定结果图。
图9显示为本发明实施例的组织总胆固醇测定结果图。
图10显示为本发明实施例的组织低密度脂蛋白胆固醇测定结果图。
图11显示为本发明实施例的组织高密度脂蛋白胆固醇测定结果图。
图12显示为本发明实施例的首次从底部到达上部分用时(Latency to Top)图。
图13显示为本发明实施例的到达上部分次数(Top Transition)图。
图14显示为本发明实施例的在上部分逗留时间(Time in Top)图。
图15显示为本发明实施例的第10s时的鱼群平均距离图。
图16显示为本发明实施例的第20s时的鱼群平均距离图。
图17显示为本发明实施例的第30s时的鱼群平均距离图。
图18显示为本发明实施例的第40s时的鱼群平均距离图。
图19显示为本发明实施例的第50s时的鱼群平均距离图。
图20显示为本发明实施例的第60s时的鱼群平均距离图。
图21显示为本发明实施例的第5min内的鱼群平均距离图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
糖尿病是目前危害人类健康的一种疾病，常伴有抑郁症状。目前对糖尿病和抑郁症均无理想治疗药物。现有的糖尿病药物均只注重对糖尿病患者血糖及相关血液指标的影响，而无涉及对抑郁症的防治。本发明注重对糖尿病及并发的抑郁症状的改善。
在新型降糖药物的筛选上，副作用低、对糖尿病具有显著改善作用，而且具有改善抑郁症状的降糖天然物质具有良好的开发前景。
海参是传统药食两用海洋资源，具有免疫调节等多种功效。本发明探索海参磷脂提取物对糖尿病及其抑郁相关症状的影响。利用斑马鱼作为模式动物，建立Ⅱ型糖尿病模型。通过2％的葡萄糖水浸泡及含20％胆固醇饲料喂养为模型组和实验组建立起斑马鱼糖尿病模型。其中实验组设置低、中、高浓度的海参磷脂，分别为10μg/kg，100μg/kg，1000μg/kg，添加到实验组的饲料中，14天后进行行为学实验，然后测量各组斑马鱼的体质指数(BMI)以及血糖血脂指标。
实验结果发现，行为学实验Novel Tank Test中，模型组相对于对照组而言表现出显著的紧张(P＜0.05)。Shoaling Test中，也是表现出更为紧张。而海参磷脂的添加则会使得各组的抑郁样行为得到改善，其中改善效果最佳的浓度为100μg/kg。实验虽发现各组的BMI指数无明显差异，但是模型组与对照组相比，其组织葡萄糖、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇均有显著性的增高(均为P＜0.05)，组织甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇含量亦有明显升高，而海参磷脂处理组可显著改善以上指标的异常，其中海参磷脂在10μg/kg剂量组对糖尿病的血糖血脂指标的改善效果较其余浓度较佳。海参磷脂对糖尿病或糖尿病并发抑郁症有改善作用。本发明揭示海参磷脂在制备用于防治糖尿病或糖尿病并发抑郁症的相关产品方面具有广阔的市场应用价值。
以下实施例中，采用的海参磷脂为可溶于乙醇的海参磷脂提取物，其提取方法参见申请号为2019107756578的中国专利申请《海参磷脂在制备抑制神经炎症药物中的应用》，具体为该专利中步骤1.2.4所得的乙醇可溶部分，即该专利图1中的物料Fr.2-2。
海参磷脂的提取方法如下：
1、材料
糙海参由深圳市太丰东方海洋生物科技有限公司提供，取用量为13kg，破碎制成粉末；其它试剂均为国产分析纯。
2、仪器
WFH-201B暗箱式紫外透射反射分析仪，上海精密仪器仪表有限公司；KH-300ZDE超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；RE-6000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；CA-1116A冷却水循环装置，EYELA；MZ2CNT化学隔膜真空泵，Vacuubrand；ME204E梅特勒天平，METTLER TOLEDO；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Agilent 7890A气相色谱仪：CTC顶空进样器，FID检测器和Chemstation工作站。
图1显示为海参磷脂提取的工艺流程图。
3、冷丙酮初次除油及磷脂粗品的制备
海参粉末先用4℃预冷丙酮浸泡过夜，丙酮的体积为海参粉末体积的2倍，抽滤，滤液在50℃下水泵减压旋干，得到初步除去脂肪的物料，称重；滤渣用3倍体积无水乙醇浸泡过夜，40℃超声30min，连续提取4次，4次提取的滤液合并旋干称重，得到磷脂粗品。
4、丙酮二次除油及精制磷脂的制备
丙酮脱去磷脂粗品脂肪成分的最重要的影响因素包括温度、料液比。因此采取萃取时间60min，提取3次，①30℃条件下，研究丙酮用量对磷脂得率的影响，料液比设置分别为1g：1mL、1g：2mL、1g：4mL、1g：6mL、1g：8mL，得出料液比为1g:4mL、超声30min浸泡丙酮除油率最高；②料液比为1g：4mL的条件下，研究温度对磷脂得率的影响，温度设置分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，得出50℃丙酮除油率最高。最后确定丙酮二次脱油的最优条件如下：料液比为1g：4mL、50℃、60min、提取3次。丙酮二次溶解的油脂成分经TLC点板分析与第一次溶解的油脂成分一致，将二者合并得到丙酮提取物(Fr.1)；丙酮不溶解部分为精制磷脂组分(Fr.2)。精制磷脂组分用95％乙醇溶解过滤旋干(上层析柱备用)4℃储存(Fr.2-2)，不溶解部分(Fr.2-1)旋干4℃储存。
5、乙醇可溶部分磷脂的分离
取1000g的氧化铝，在120℃条件下活化3h左右，取出，冷却至室温，加入洗脱溶液(90％乙醇溶液)浸泡，搅拌，使其充分溶胀。采用湿法装柱，将层析柱垂直装置，以自动部分收集器作为洗脱液的接收器。将约20g的Fr.2-2溶解在90％乙醇溶液中，0.22μm滤膜过滤。当溶液流至接近氧化铝上层表面时，立即用配制好的洗脱溶剂连续洗脱。调节洗脱液流速(0.3mL/min)，利用自动部分收集器每10mL换管收集。在紫外分光光度计254nm条件下，检测收集到的液体，根据紫外检测结果，将在254nm条件下吸光谱图相近的液体收集在一起，将最终得到的3个组分Fr.2-2-1、Fr.2-2-2、Fr.2-2-3用旋转蒸发器浓缩至膏状，真空干燥。
6、GC测定磷脂提取物中的丙酮溶剂残留量
称取图1中Fr.2物料，即精制磷脂，取用量为1.0g，精密称定，置25mL量瓶中，加纯化水溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置20mL顶空瓶中，加盖，密封，用于气相测定。取丙酮适量，精密称定，加水制成每1mL约含2.5μg的对照品储备液，精密量取对照品储备液20mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置20mL顶空瓶中，加盖，密封，作为对照品溶液。色谱柱：HP-INNOWAX(30m×0.320mm，0.50μm)；柱温：采用程序升温，初始温度40℃，保持6min，以25℃·min-1速率升温至220℃，保持5min；进样口温度220℃；检测器温度250℃；氮气为载气，流速为2.0mL/min；顶空进样瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30min，进样体积为1.5mL，分流比为5∶1。
结果表明，3批样品中丙酮残留量为0.23±0.01％，少于中国药典2005年版对溶媒丙酮规定的残留限度：不超过0.5％。
图2显示为丙酮用量对磷脂得率的影响图(254nm)：30℃条件下，料液比分别为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8，磷脂粗品得率分别为68.2％，68.5％，68.7％，68.7％，68.7％，丙酮组分TLC结果如图6所示，考虑节省溶剂，料液比为1:4(m/v)(30℃)条件下丙酮除油率最高。
图3显示为温度对磷脂得率的影响图(254nm)。料液比为1:4(m/v)条件下，提取温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，磷脂粗品得率分别为68.2％，69.3％，70.2％，70.3％，70.1％，得出50℃时磷脂粗品得率最高，丙酮组分TLC结果如图5所示。因此，最后选择丙酮二次脱油的最优条件为：料液比1/4、50℃、60min、提取3次。
图4显示为糙海参不同组分的TLC图像(254nm)。丙酮二次溶解的油脂成分经TLC点板分析与第一次溶解的油脂成分一致，将二者合并得到丙酮提取物(Fr.1)；丙酮不溶解部分为精制磷脂组分(Fr.2)。精制磷脂组分用95％乙醇溶解，其中不溶解部分根据文献推测主要为卵磷脂(Fr.2-1)，溶解部分过滤(Fr.2-2)待上柱进一步分离精制，其TLC谱图如图8所示。
图5显示为Al2O3柱分离后磷脂组分的TLC图像(254nm)。
图4和图5中，氯仿：甲醇＝5:1是指体积比，氯仿甲醇混合液是作为层析分离液使用，层析的样品就是图1中的物料Fr.2-2。
如图5所示的TLC谱图，组分Fr.2-2经氧化铝层析柱分离得到3个组分Fr.2-2-1、Fr.2-2-2和Fr.2-2-3，组分Fr.2-2-1为主要磷脂精细组分，推测主要为脑磷脂。
7、分组
步骤4中，精制磷脂组分用95％乙醇溶解过滤旋干(上层析柱备用)，4℃储存，为乙醇可溶部分(Sea cucumber phospholipid extract ethanol-soluble fraction，SCE)，即图1中的物料Fr.2-2；不溶解部分旋干，4℃储存，为乙醇不溶部分(Sea cucumberphospholipid extract water-soluble fraction，SCW)，即图1中的物料Fr.2-1。
图1中的物料Fr.2-2，即SCE，为可溶于乙醇的海参磷脂，将SCE溶于乙醇中，除菌过滤后，制成含有所需浓度海参磷脂的乙醇溶液；SCW为可溶于水但不溶于乙醇的海参磷脂，进行细胞实验时，将SCW溶于少量水中，除菌过滤后，再加入细胞悬液中，制成含有所需浓度海参磷脂的细胞悬液。
实施例1
1、制备海参磷脂提取物
海参是一种具有重要经济价值的无脊椎海洋棘皮动物，在亚洲国家中被广泛应用为滋补性食品。海参含有多肽、三萜苷类、多糖、酚类和脂类等多种生物活性物质。这些活性物质具有多种有利的生物功能，如抗氧化、抗癌、抗炎症、抗血栓、抗微生物、抗糖尿病、抗肥胖、改善学***，通过提高脂联素的mRNA表达，改善血浆炎症因子，显著对糖尿病症状进行改善。LeticiaOlivera-Castillo等的研究发现，其降低血脂的效力不会因为烹调或热处理而丧失。基于各种糖尿病动物模型的研究表明，整体海参具有降低血糖的作用，但其功效成分不明，且对糖尿病伴随的抑郁症的影响尚不明确。使用海参及其活性成分可以避免一般降糖药物所带来的不良反应。综上，海参或者海参活性物质对于降低血糖具有一定的功效，并且其潜在的风险相对降糖药物更小，具有巨大的应用价值。
目前对于2型糖尿病的治疗方式主要是口服降糖药以及改变患者的生活习惯，而对于糖尿病并发症，则是采取预防的策略。但降糖药物却对人体具有各种各样潜在的危害，对生活习惯和方式的干预也很大程度会受到患者人体差异的影响，所以，低糖、低脂肪、低胆固醇、高蛋白的海参便成为更好的降糖辅助选择。然而，海参对于糖尿病及其伴随的抑郁症的影响目前尚不明确。
研究发现，海参的活性物质中，海参皂甙则具有调节免疫和造血、促进性功能、抑菌和抗肿瘤的功效，硫酸软骨素可延缓衰老等。海参脂质中约有91％为磷脂，其中大部分为磷脂型二十碳五烯酸(EPA-PC)和二十碳四烯酸(AA)。其中AA对神经细胞生长发育起到积极的作用，另外，AA还可以影响心血管功能、提高生殖细胞的质量和调节免疫等。EPA-PC相对AA而言抗氧化性更加优异，具有良好的细胞渗透性，更容易被生物所利用，因此EPA-PC更容易被小肠吸收。它具有良好的减肥特性，同时起到保护胰岛的作用。徐雷雷的研究表明，EPA-PC可促进大鼠空腹血清胰岛素的分泌，降低空腹血糖和糖化血清蛋白。
2、本实施例的目的及意义
本实施例利用高糖高脂诱发的斑马鱼糖尿病和抑郁症状作为模式动物，通过行为学实验和对血糖、血脂等生化指标的检测，旨在探索海参磷脂对糖尿病及其并发抑郁样行为的改善作用，为糖尿病及其并发抑郁症的预防或治疗提供一种副作用和潜在风险更小的药物。
3、实验材料和方法
3.1、实验动物和原料
本实施例采用成年斑马鱼150条，于60L半透明水箱中饲养7天观察其状态。饲养条件为：pH：7.0-7.4，水温28℃，昼夜模拟为14小时光照，10小时黑暗，实验开始前喂养普通饲料。
海参样品采用磷脂提取物固体，使用95％乙醇按照一定比例溶解得到海参磷脂溶液。
3.2、实验试剂和仪器设备
无水葡萄糖(500g/瓶，广东光华科技股份公司)，95％无水乙醇，胆固醇(阿拉丁控股集团有限公司)，无水***，PBS缓冲溶液(Boster Biological Technology co.ltd)，小型鱼专用鱼粮(潍坊意品宠物用品公司)，甘油三酯(TG)测试盒(单试剂型，南京建成生物工程研究所)，总胆固醇(T-CHO)测试盒(单试剂型，南京建成生物工程研究所)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒(直接法，南京建成生物工程研究所)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒(直接法，南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)。
梅特勒ME104E/AUW-120电子天平，J2708生物解剖器(七件组)，TIANGEN OSE-Y30手持匀浆器，DW-86L728J海尔医用低温保存箱，Allegra X-30R高速离心机，DH-250电热恒温箱，Bio-tek EL×800酶标仪，SB-948增氧泵，Novel Tank透明水箱，XUEEKE MS-130系列全自动雪花制冰机。
3.3、实验方法
3.3.1饲料制备
用95％无水乙醇将海参磷脂提取物溶解成浓度分别为10μg/kg、100μg/kg、1000μg/kg的溶解液，保存于1.5mL EP离心管中，于4℃下进行保存。普通饲料采用小型鱼专用鱼粮，高脂组的饲料以同样饲料为基础，按10％的质量分数添加胆固醇粉末，然后加入无水***至没过饲料，同时进行充分搅拌。将含有***的饲料放于通风橱中。待***完全挥发后，按照实验设置浓度加入海参磷脂溶解液，并充分搅匀。最后，将饲料按每管0.75g分装到0.5mL EP离心管中，按照分组于4℃下进行保存。
3.3.2动物分组及模型
在预试验进行的浓度筛选中表明10μg/kg、100μg/kg、1000μg/kg的海参磷脂对斑马鱼异常行为的改善作用较好，故本实验设置的分组为：对照组(Control)、模型组(DM)、低剂量实验组(DM+10μg/kg)、中剂量实验组(DM+100μg/kg)和高剂量实验组(DM+1000μg/kg)将150条斑马鱼平均且随机地分成5组，每组30条，饲养于8L半透明塑料箱中，分组完成后，先不用高脂饲料饲养一周以适应环境。除实验组投喂无任何处理的饲料外，其余各组分别对应投喂等量高脂饲料并饲养于葡萄糖含量为2％的水中，各组同时喂食，每日更换饲养用水。
表1糖尿病斑马鱼模型分组
3.3.3行为学实验
投喂高脂饲料14天后，对各组进行行为学实验。斑马鱼的精神状态由行为学实验进行评估和判定。本实验设置两个行为学实验以判定斑马鱼对新环境的适应能力及群体偏好性。试验将斑马鱼转移到新环境中，由于动物的自我保护意识，其探索性行为不可避免地会减少。并且斑马鱼的探索行为会随焦虑程度的增加而减少，或者表现为更加密集的群体。因此，通过行为学实验，能够对斑马鱼的精神状态作出评估。
3.3.3.1新鱼缸潜水模型试验
Novel Tank Test，即新鱼缸潜水模型试验。所使用水箱为透明梯形水箱，水箱中部有平行于水平线的中线标记，此线将Novel Tank划分为上部分和下部分。Novel Tank尺寸为上边长28cm，底边长22cm，高15cm，斜边长16cm，加水1.5L。试验开始前，对斑马鱼进行过夜禁食处理(禁食12小时)。测试时，将Novel Tank加水至刻度线，并用白色KT板排除外界因素对鱼的干扰，实验人员于Novel Tank正前方2m处进行观察记录，实验的总时长为5min。试验开始后，将一条鱼轻轻地放入Novel Tank中，观察其运动轨迹，记录斑马鱼首次从Novel Tank底部到达上部分所用时间(Latency to Top)；在5min内斑马鱼在上部分所逗留的时长(Time in Top)以及跨越标记中线到达上部分的次数(Entries Times)。对实验人员进行训练后开展正式实验。
3.3.3.2斑马鱼群体密度评估实验
对斑马鱼群体密度进行评估的试验为Shoaling Test，试验同样采用Novel TankTest所用的梯形透明水箱。试验开始前，对斑马鱼进行过夜禁食处理(禁食12小时)。测试时，将Novel Tank加水至刻度线，并用白色KT板将Novel Tank围住，排除外界因素对鱼的干扰，在梯形透明水箱正前方放置摄像头以记录鱼群的运动状态。实验人员于Novel Tank正前方2m处进行观察记录，实验的总时长为5min。试验开始后，随即开始录制视频，将5条斑马鱼轻轻地放入梯形透明水箱中，前4min为鱼群适应期，不进行鱼间距离的记录。在进入第5min后，每隔10s测量一次两两斑马鱼之间的距离，以平均值代表鱼群密度。对实验人员进行训练后开展正式实验。
3.3.4生化指标检测
完成行为学实验后，对各组斑马鱼进行生化指标的检测。首先进行体质指数(BMI)的测定，然后对各组进行去头处理，鱼脑和鱼体组织分别保存在-80℃冰箱中。取鱼身于离心管中，称取其质量，按鱼身的质量与PBS缓冲液的体积之比为1：9的比例加入PBS缓冲溶液(pH为7.4)，用手持匀浆器在冷水浴进行匀浆。然后在4℃，2500r/min的条件下离心10min。取上清进行生化指标的检测。
3.3.4.1BMI指数的测定
将各组斑马鱼进行冰冻麻醉之后，用纸巾擦干其鱼身上的水滴，用电子天平称量得到鱼重(体重)，使用直尺量出斑马鱼身最前端到最尾端得到斑马鱼的鱼体长度(身高)。BMI的计算公式为：BMI＝鱼重(kg)÷鱼体长度(m)^2。
3.3.4.2组织BCA蛋白浓度测定
BCA的测定在碱性条件进行，主要的反应是还原反应和螯合作用，涉及铜离子的还原和与BCA分子的螯合，生成的复合物的最大光吸收强度(即颜色的深浅)和测定组织蛋白质浓度的增加而增加。以各BSA蛋白作为标准品，配制系列梯度(μg/μL)的标准溶液，在570nm使用酶标仪测定其吸光度以制出标准曲线。各样品的蛋白浓度可以由标准曲线得出。
3.3.4.3组织葡萄糖含量测定
组织葡萄糖(Glucose)的测定基于葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法，通过测定H2O2的量间接测得。在进行测定时，组织中的葡萄糖在发生酶促反应会生成H2O2，进而发生缩合反应，生成醌类化合物。这种醌类化合物的吸收光强度与其浓度成正比，在490nm下使用酶标仪可以测定其吸光度，进而求出组织样品中的葡萄糖含量。试验同时设置空白管与校准管以减少误差。以96孔板为载体，根据试剂盒说明书进行操作。葡萄糖的计算公式为：葡萄糖含量(mmol/gprot)＝[(样品管的吸光度-空白管的吸光度)/(校准管的吸光度-空白管的吸光度)]×校准品浓度(5.55mmol/L)÷BCA定量蛋白浓度(gprot/L)。
3.3.4.4组织甘油三酯的测定
采用GPO-PAP酶法进行测定。测定也同样通过测定H2O2量简介测定。TG发生酶促反应会生成甘油，然后甘油会和ATP反应，生产甘油-3-磷酸和二磷酸腺苷。受到氧化酶的催化，甘油-3-磷酸会和O2作用，生成磷酸羟基丙酮和H2O2。H2O2和4-AAP以及对氯酚在过氧化物酶的催化下生成红色化合物。红色化合物所呈现的颜色深浅程度和甘油三酯的含量成正比，通过使用酶标仪在490nm下测定其吸光度即可间接得出样品的TG浓度。试验同时设置空白管与校准管以减少误差。具体步骤根据试剂盒说明书进行操作。TG的计算公式为：TG含量(mmol/gprot)＝[(样品管的吸光度-空白管的吸光度)/(校准管的吸光度-空白管的吸光度)]×校准品浓度(2.26mmol/L)÷BCA定量蛋白浓度(gprot/L)。
3.3.4.5组织总胆固醇的测定
组织总胆固醇(T-CHO)的测定基于COD-PAP法。测定时，组织中与脂肪酸结合的胆固醇会被CE水解为脂肪酸和游离状态的胆固醇。连同组织中原本存在游离胆固醇，在氧化酶的作用下生成胆甾烯酮和H2O2。H2O2会和4-AAP以及苯酚在过氧化物酶的作用下生成红色化合物。红色化合物的吸收光强度和胆固醇的含量成正比，通过使用酶标仪在490nm下测定其吸光度即可间接得出样品的T-CHO浓度。试验同时设置空白管与校准管以减少误差。T-CHO的计算公式为：T-CHO含量(mmol/gprot)＝[(样品管的吸光度-空白管的吸光度)/(校准管的吸光度-空白管的吸光度)]×校准品浓度(5.17mmol/L)÷BCA定量蛋白浓度(gprot/L)。
3.3.4.6组织低密度脂蛋白胆固醇的测定
采用直接法测定组织低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)。测定时，组织中的高密度脂蛋白(HDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)和低密度脂蛋白(LDL)需要先微粒化才能进行检测。它们在高分子化合物和表面活性剂的作用下生成微粒化的胆固醇。微粒化胆固醇会在CO、CE的作用下生成H2O2。H2O2最后在4-氨基安替比林和Toos在过氧化氢酶的作用下生成呈色化合物。呈色的深浅与LDL-c含量的增加而增加。通过使用酶标仪在570nm下测定其吸光度即可间接得出样品的LDL-c浓度。试验同时设置空白管与校准管以减少误差。LDL-c的计算公式为：LDL-c含量(mmol/gprot)＝[(样品加入试剂2的吸光度-样品加入试剂1的吸光度)-(空白孔加入试剂2的吸光度-空白孔加入试剂2的吸光度)/(校准孔加入试剂2的吸光度-校准孔加入试剂1的吸光度)-(空白孔加入试剂2的吸光度-空白孔加入试剂2的吸光度)]×校准品的浓度(2.55mmol/L)÷BCA定量蛋白浓度(gprot/L)。
3.3.4.7组织高密度脂蛋白胆固醇的测定
组织高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)采用直接法进行测定。测定时，组织中的HDL、VLDL和CM需要转化为HDL-c才能被检测出来。它们在高分子化合物和表面活性剂的作用下变成HDL-c。进而在CO、CE的作用下生成△4-胆固醇和H2O2。H2O2、4-氨基安替比林和Toos在过氧化氢酶的作用下生成红紫色化合物。红紫色化合物呈色的深浅与HDL-c含量的增加而增加。通过使用酶标仪在570nm下测定。试验同时设置空白孔与校准孔以减少误差。HDL-c的计算公式为：HDL-c含量(mmol/gprot)＝[(样品加入试剂2的吸光度-样品加入试剂1的吸光度)-(空白孔加入试剂2的吸光度-空白孔加入试剂2的吸光度)/(校准孔加入试剂2的吸光度-校准孔加入试剂1的吸光度)-(空白孔加入试剂2的吸光度-空白孔加入试剂2的吸光度)]×校准品的浓度(1.8mmol/L)÷BCA定量蛋白浓度(gprot/L)。
3.4统计分析
本实验使用GraphPad进行数据的整理和分析。数据的表示方法为误差正负标准误，采用单因素检验。
4、结果与分析
4.1体质指数结果
图6所示为体质指数检测结果，从BMI的检测结果看来，DM组与对照组之间没有显著性差异，低、中、高剂量组与DM组之间也没有显著性差异。说明在模型建立的过程中，高糖高脂的环境并没有造成各组之间的肥胖状况的异同。但单凭BMI指数一项指标不足以判断糖尿病模型是否被成功建立，故需结合以下生化指标作出进一步的分析。
5.2糖尿病指标检测结果
图7所示为组织葡萄糖含量检测结果图(注：*：对照组与模型组存在显著性差异(P＜0.05)；#：表示添加各剂量的海参磷脂的各组与模型组之间存在显著性差异(P＜0.05))，从组织葡萄糖检测结果中可以看出，DM组与对照组存在显著性升高(P＜0.05)。证明DM模型建立成功。而在饲料中添加海参磷脂后，低、中、高剂量处理组斑马鱼组织中葡萄糖含量均低于DM组。其中100μg/kg处理组的降葡萄糖最显著(P＜0.05)。
图8所示为组织甘油三酯测定结果图，图9所示为组织总胆固醇测定结果图，图10所示为组织低密度脂蛋白胆固醇测定结果图，图11所示为组织高密度脂蛋白胆固醇测定结果图。图8图10中，**：对照组与模型组存在极显著的差异(P＜0.01)；##：表示添加各剂量的海参磷脂的各组与模型组之间存在极显著的差异(P＜0.01))。
从组织甘油三酯的测定结果可以看出，DM组的组织甘油三酯(TG)较对照组存在显著性升高(P＜0.05)。而三个海参磷脂处理实验组，与DM组比较组织甘油三酯含量有所减少，其中10μg/kg与100μg/kg剂量组与模型组DM存在显著性差异(P＜0.05)。说明海参磷脂可降低组织甘油三酯。组织总胆固醇(T-CHO)对照组与DM组差尽管异不显著，但仍可看出DM组的含量要高于对照组，而海参磷脂在100μg/kg与1000μg/kg剂量组与DM组相比存在显著性的下降(P＜0.05)。说明组织胆固醇的含量在喂食海参磷脂(100μg/kg)后得到了显著的改善。组织低密度脂蛋白胆固醇的DM组与1000μg/kg剂量组与对照组存在极显著的差异(P＜0.01)。而组织HDL-c仅100μg/kg组与DM组存在显著性差异(P＜0.05)，且其较其余各组低，说明海参磷脂对糖尿病模型动物组织的LDL-c和HDL-c变化均有显著改善作用。由四个生化指标中DM组与对照组的差异来看，DM组具有糖尿病的指标特征，故本实验建立的糖尿病模型具有一定的参考价值。从各剂量组与DM组的差异可以看出，100μg/kg剂量组对组织TG、T-CHO和HDL-c的降低均有显著的作用。通过表2的各项生化指标的显著性对比可以发现，100μg/kg剂量组对糖尿病的各项指标有一定的改善作用。
表2各剂量组与模型组生化指标的显著性对比(mmol/gprot)
注：#表示P<0.05，##表示P<0.01
4.3行为学实验结果
4.3.1Novel Tank Test结果
图12所示为首次从底部到达上部分用时(Latency to Top)图，图13所示为到达上部分次数(Top Transition)图，图14所示为在上部分逗留时间(Time in Top)图。
从Novel Tank Test的结果可以看出，首次到达Novel Tank上部分用时中，DM组所耗用时间和对照组相比具有极显著的差异(P＜0.01)，表明DM组相对于对照组而言更为紧张焦虑。与DM组相比，喂养海参磷脂的三个剂量组均可不同程度改善斑马鱼在NovelTankTest实验中紧张焦虑行为，其中10μg/kg与1000μg/kg剂量组与其存在极显著的差异(P＜0.01)，而100μg/kg则存在显著性差异(P＜0.05)。无论是到达上部分的次数还是在上部分逗留的时间，DM组都比其余各组耗费更多的时间，也和对照组之间有显著差异(P＜0.05)。10μg/kg与100μg/kg剂量组与DM组对比都有显著性的差异(P＜0.05)或者极显著的差异(P＜0.01)。
4.3.2Shoaling Test结果
图15所示为第10s时的鱼群平均距离图，图16所示为第20s时的鱼群平均距离图，图17所示为第30s时的鱼群平均距离图，图18所示为第40s时的鱼群平均距离图，图19所示为第50s时的鱼群平均距离图，图20所示为第60s时的鱼群平均距离图，图21所示为第5min内的鱼群平均距离图。
从实验结果可以发现，在第10s时，10μg/kg处理组的鱼群平均距离对比对照组有显著减小(P＜0.05)。第20s时，各组的差异均不显著。在30s时，DM及低中高剂量组与对照组均出现了显著性减小(P＜0.05)。第40s时，DM组的平均距离对比对照组有显著减小(P＜0.05)，而低、中、高剂量组之间虽无显著性差异，但仍可观察出100μg/kg组较其余两组的平均距离更小。50s时，DM组的距离与中剂量组均与对照组有显著性减小(P＜0.05)，三个剂量之间的趋势与40s时相同。60s时，各组之间均无显著性差异，但1000μg/kg组平均距离最短。第5分钟鱼群平均距离表明，DM与对照组差异显著(P＜0.05)，距离最短，但与投喂海参磷脂的其余各组差异不明显，说明DM较其他组而言更显紧张。而模型组与实验组鱼群之间的平均距离均比对照组要短，也就是都比对照组要紧张。通过表三的各剂量组与模型组行为学测试指标的显著性对比，可以发现，10μg/kg剂量组与DM组差异比较明显，表现得更为不紧张，而100μg/kg剂量组次之。
表3各剂量组与模型组行为学测试指标的显著性对比(s)
注：#表示P<0.05，##表示P<0.01
5、结论
本实施例利用高糖高脂诱发的斑马鱼糖尿病和抑郁症状作为模式动物，通过行为学实验和对血糖、血脂等生化指标的检测，证实了海参磷脂对糖尿病及其并发抑郁症有改善作用。
在BMI指数的测定结果中，各组间均无明显差别，但生化指标中，DM组又与对照组存在显著性差异或者比对照组的指标数值上更大，故判断本实施例建立的DM模型为非肥胖型糖尿病。而且，有研究指出，BMI与2型糖尿病之间并无明显的关系，但通过生化指标的检测仍可证明，海参磷脂对斑马鱼的肥胖状况的改善没有明显的作用，但可显著降低组织葡萄糖、胆固醇和甘油三酯。其中，改善作用比较良好的浓度为100μg/kg。从Novel Tank Test中可以看出，DM组较对照组而言更加地紧张，表现出更少的探索行为。而喂食海参磷脂组对比DM较为放松。从Shoaling Test第5min内的鱼群平均距离中可以看出，海参磷脂对鱼群紧张程度有较好的改善作用。从柱状图的轻微趋势中可以看出，100μg/kg对鱼群紧张程度的改善较其余浓度更佳。故可以断定，DM组出现了由糖尿病并发的抑郁样行为，斑马鱼出现了由高糖高脂诱发的抑郁样行为。而从投喂海参磷脂的各组与DM组的对比可以发现，海参磷脂对此种抑郁样行为具有一定的改善作用，其中，改善作用比较良好的浓度为10μg/kg。
综上，海参磷脂对糖尿病及其并发抑郁症具有改善作用，提示海参磷脂在制备预防或治疗糖尿病或伴随糖尿病并发的抑郁症的药物方面具有广阔的市场价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。